CN105004704A - 钕离子敏化上转换纳米晶新用途及高分辨多光子显微系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种钕离子敏化上转换纳米晶新用途及高分辨多光子显微系统。钕离子敏化上转换纳米材料可以由中心波长＜800nm的短波长稳态激光激发产生多光子可见光，具有更大的多光子吸收截面和多光子饱和激发功率，更易于进行高阶多光子成像，该新特性用于多光子显微成像中可以大幅降低系统的成本，显著提高显微成像分辨率。该多光子显微成像系统包括中心波长＜800nm的短波长稳态激光器，其样品采用钕离子敏化的上转换纳米材料。本发明首次提出利用短波长稳态激光器，构建廉价又简便的多光子显微系统，提出利用钕离子敏化上转换发光性质的纳米材料进行超高分辨率的多光子显微成像，该材料也可引入细胞、组织或其他基质中进行高分辨率生物成像。

Description

钕离子敏化上转换纳米晶新用途及高分辨多光子显微系统

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种钕离子敏化上转换纳米晶新用途及高分辨多光子显微系统。

背景技术

在现代光学成像技术中，借助探针标记的荧光显微镜，尤其是基于荧光单光子过程的激光扫描共聚焦显微镜，凭借高分辨率(约200纳米)已经在医学、生命科学和材料科学领域得到了广泛的应用。然而，共聚焦显微镜也有不少缺陷，如系统相对复杂，紫外、蓝光激发易损伤生物样品，成像深度十分有限(几十微米)，难以避免生物样品自发荧光的干扰，样品易光漂白等。基于一些生物样品及材料非线性激发下的天然“光学切片”能力，人们提出了双光子扫描显微镜，这种显微系统相对容易搭建，近红外激发光也能减小生物光损伤并能提高成像深度(几百微米，甚至毫米)，在一定程度上解决了共聚焦显微系统存在的问题。然而，近红外(大于800纳米)激发的双光子荧光显微镜分辨率相对不高的分辨率(微米量级)严重限制了其在生物显微成像中的应用。这一低分辨率是由其理论计算公式d＝1.22λ/2NA(N)^1/2所制约的，其中λ是激发光波长，NA是显微物镜的数值孔径，N是多光子成像的非线性阶数(双光子成像中N＝2)。理论上，通过减小激发光波长，增大显微物镜数值孔径和多光子非线性阶数都可以提高分辨率，而机械上的显微物镜数值孔径已经很难继续提高，因此，用更短激发波长进行更高阶多光子成像成为提高多光子显微镜分辨率的必然选择。

然而，多数荧光物质的非线性多光子(双光子、三光子、四光子)激发截面非常小，使用超高峰值功率的飞秒脉冲激光器可以获得更强的多光子荧光，但高昂的光源费用(～$200,000)限制了它的广泛推广，同时使用短波长激发下的三光子、四光子荧光波长又通常落在紫外波段，对检测光路与探测器要求高，这都不利于进行短波长激发下的多光子高分辨率显微成像。虽然已有提出稳态激光泵浦的低成本双光子显微镜，但是近红外波长(大于800纳米)激发的低阶双光子成像时分辨率仍不高。

发明内容

本发明的第一个目的就是克服现有的研究方向偏见，提供一种钕离子敏化的上转换纳米材料在多光子显微成像中的用途，所述钕离子敏化的上转换纳米材料由中心波长＜800nm的稳态连续激光激发，在得到的多光子荧光光谱中，多光子发射峰均在可见光范围内。

相较于传统的镱离子敏化的上转换纳米晶，钕离子敏化的上转换纳米材料有很好的光稳定性，从光谱中可知，无论是激发光谱还是多光子(三光子、四光子)发射光谱，都可以选取在可见光范围内的短波长进行成像和探测。更重要的是这种材料相比传统上转换材料具有更大的多光子吸收截面，具有明显更大的多光子激发饱和功率，能够产生更强的多光子荧光，因此可以使用廉价的稳态激光器，普通的光电探测器来进行多光子显微成像，不仅可以提高现有的多光子显微成像分辨率，同时大幅降低系统成本，解决共聚焦显微镜、双光子荧光显微镜存在的一些问题，为生命科学、医学和材料科学研究提供一种新的方法。

根据上述用途搭建一多光子显微成像系统，该系统包括中心波长＜800nm的稳态连续二极管激光器、显微镜光学系统和载物台，所述显微镜光学系统包括扩束透镜组、扫描振镜、短通二向色镜、荧光滤光片、光电探测器和物镜，样品放置在载物台上，稳态连续二极管激光器产生的短波长连续激光耦合进入所述显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置扩束透镜组、扫描振镜和短通二向色镜，其中短通二向色镜与该激光束成45°角放置；在垂直于该激光束且穿过该短通二向色镜的光轴方向上，在该短通二向色镜上方同轴地依次放置有荧光滤光片和光电探测器，在该短通二向色镜下方放置有物镜，钕离子敏化的上转换纳米材料样品放置在载物台上物镜的焦点处；短通二向色镜使激发光反射、钕离子敏化的上转换纳米材料产生的多光子荧光透射。

优选的，所述稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为720～740nm，所述短通二向色镜用于反射波长大于670nm的激发光，透射波长小于670nm的多光子荧光。

优选的，所述稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm时，钕离子敏化的上转换纳米材料产生的多光子荧光光谱中，465-480nm波段为该样品的三光子发光峰，450-460nm波段为该样品的四光子发光峰，645-680nm波段为该样品的双光子发光峰。

更进一步的，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的双光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为1mW，选取645-680nm波段荧光进行探测。

更进一步的，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的三光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为100uW，选取465-480nm波段荧光进行探测。

更进一步的，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的四光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为100uW，选取450-460nm波段荧光进行探测。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、本发明发现了由中心波长＜800nm的稳态连续激光激发的钕离子敏化的上转换纳米材料在多光子显微成像中的用途，通过分析其光频谱可知，无论是激发光谱还是多光子(三光子、四光子)发射光谱，都可以选取在可见光范围内的短波长进行成像和探测。同时，该材料具有更大的多光子吸收截面和多光子饱和激发功率，更易于进行高阶多光子成像，并且不仅限于双光子成像，考虑到生物成像时激发功率不宜过大，这种高效率的高阶多光子激发降低了高分辨活体生物实验对于探测器的要求，因此本发明的高分辨显微系统更易实现。

2、本发明可以采用二极管激光器作为多光子激发光源，相比于传统的多光子荧光显微镜采用的超快脉冲激光器，价格十分低廉，易于推广。

3、本发明是使用短波长搭建的多光子显微成像系统，因此相比于传统的800nm以上波段也要廉价，易于实验室采购，成本低。

4、本发明搭建的多光子显微成像系统提高了现有的多光子显微成像分辨率，同时大幅降低系统成本，解决了共聚焦显微镜、双光子荧光显微镜存在的一些问题，为生命科学、医学和材料科学研究提供一种新的方法。

附图说明

图1为本发明的基本结构示意图。

图2为本发明的一个实例的结构示意图。

图3为本实施例探测到的钕离子敏化上转换纳米材料的激发光光谱。

图4为本实施例探测到的钕离子敏化上转换纳米材料的多光子发光光谱。

图5为本实施例中获得的钕离子敏化上转换纳米材料的多光子激发饱和功率。

图6(a)为本实施例获得的钕离子敏化上转换纳米材料的x-y平面上的高分辨率双光子成像。

图6(b)为图6(a)的强度点扩散函数高斯分布曲线图。

图7(a)为本实施例获得的钕离子敏化上转换纳米材料的x-y平面上的高分辨率三光子成像。

图7(b)为图7(a)的强度点扩散函数高斯分布曲线图。

图8(a)为本实施例获得的钕离子敏化上转换纳米材料的x-y平面上的高分辨率四光子成像。

图8(b)为图8(a)的强度点扩散函数高斯分布曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本发明多光子显微成像系统的基本结构如图1所示，其中1为二极管激光器，2为扩束透镜组，3为扫描振镜，4为短通二向色镜，5为荧光滤光片，6为光电探测器，7为物镜，8为样品，9为载物台。稳态连续激光器中心波长＜800nm，显微镜光学系统包括扩束透镜组2、扫描振镜3、短通二向色镜4、荧光滤光片5、光电探测器6和物镜7，样品8放置在载物台9上。工作时二极管激光器1产生的短波长连续激光经光纤转换为空间光后进入所述显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置扩束透镜组2、扫描振镜3和短通二向色镜4，其中短通二向色镜4与该激光束成45°角放置；在垂直于该激光束且穿过该短通二向色镜4的光轴方向上，在该短通二向色镜4上方同轴地依次放置有荧光滤光片5和光电探测器6，在该短通二向色镜4下方放置有物镜7，钕离子敏化的上转换纳米材料样品放置在载物台上物镜的焦点处。短通二向色镜4使激发光反射，钕离子敏化的上转换纳米材料产生的多光子荧光透射。

实际使用时可在上述基本结构上进行相应改进，例如采用图2所示的系统，在该多光子显微成像系统中，二极管激光器1产生的稳态连续激光通过光纤导入显微镜系统，沿该激光束前进方向上依次放置扩束透镜组2、扫描振镜3和短通二向色镜4，其中短通二向色镜4与该激光束成45°角放置，扫描振镜3与计算机12连接。在垂直于该激光束且穿过该短通二向色镜4的光轴方向上，在该短通二向色镜4下方与光轴成45°角放置有反射镜10，在该反射镜的反射光束的前进方向上依次同轴放置有多光子对应荧光波段带通滤光片5、聚光透镜11和光电探测器6，其中光电探测器6与计算机12连接。另外，在短通二向色镜4上方与激光垂直的光轴上同轴地依次放置有物镜7、载物台9和样品8，钕离子敏化的上转换纳米材料样品放置在载物台上物镜的焦点处。本实施例中，由于多光子激发显微成像的天然“共聚焦小孔”作用，该系统不需要使用共聚焦的共轭小孔模块，只需要一个扫描单元即可。计算机12与光电探测器6和扫描振镜3连接，实现图像存储及扫描控制。

本实施例中，稳态连续二极管激光器采用中心波长为730nm、输出功率可调的激光器，短通二向色镜为反射波长大于670nm，透射波长小于670nm的二色镜，荧光滤光片采用带通滤光片，显微镜采用OLYMPUS IX81倒置显微镜，激光扫描单元为OLYMPUS MPE-FV1000，物镜、光电探测器也均采用现有装置，图像存储、分析及扫描控制软件采用现有的FV10-ASW(OLYMPUS)。

本实施例的工作过程是：

稳态连续二极管激光器(中心波长730nm)1产生的连续可见激光经过扩束透镜组2后，扩束为更大的平行光束，扫描振镜3控制激光束在样品上的多光子激发扫描，短通二向色镜(反射波长大于670nm的激发光，透射波长小于670nm的多光子荧光)使光束偏转90°，平行射入物镜后会聚在焦点处的钕离子敏化的上转换纳米材料样品，样品8在稳态连续激光激发下发射出多光子荧光，其中一部分由物镜7收集后转换为平行光束，通过短通二向色镜4后被反射镜10反射，反射后的信号通过荧光带通滤光片5滤过相应波段的多光子信号，经聚光透镜11收集后会聚在光电探测器6，被其接收。然后通过计算机12控制扫描振镜3，利用高倍物镜7聚焦的光斑扫描样品获得一幅二维图像。

用本实施例对单个钕离子敏化的上转换纳米材料进行光谱测量，图3是该单个上转换纳米材料的激发光谱，图4是在730nm连续光13激发下的多光子发光光谱，可以看到无论是激发光谱还是多光子(三光子、四光子)发射光谱，都可以选取在可见光范围内的短波长进行成像和探测，从图4中可以得到，465-480nm为该样品的三光子发光峰14，450-460nm为该样品的四光子发光峰15，645-680nm为该样品的双光子发光峰。

如图5所示，用本实施例对钕离子敏化的上转换纳米材料进行多光子饱和激发功率测量，本实验选取470nm波段蓝光作为三光子发光，选取450nm波段蓝光作为四光子发光。图中纵坐标表示发光强度，横坐标表示激发功率。通过曲线拟合可以发现该显微成像中使用的钕离子敏化上转换纳米材料具有约100微瓦的多光子激发饱和功率，这个功率对于多光子生物成像十分安全，同时相对较大的多光子激发饱和功率也可以带来更大的多光子荧光强度，十分适合在该发明的简易系统下进行高分辨显微成像实验。

如图6、7、8所示，为用本实施例对单个钕离子敏化的上转换纳米颗粒进行多光子显微成像，考察该发明能够达到的高分辨率成像情况。图6(a)、7(a)、8(a)的分别是该实施例下测到的单个上转换纳米颗粒的双光子、三光子及四光子荧光成像图。其中对于单颗粒的三光子和四光子成像，使用了730nm可见连续激光(焦面处功率为100uW)激发，分别选取470nm和450nm波段荧光进行探测。对于单颗粒的双光子成像，使用730nm可见连续激光激发(焦面处功率为1mW)，探测其红光部分的双光子信号，而且通过切换荧光滤光片可以很容易的进行几种多光子的显微成像转换。图6(b)、7(b)、8(b)为对应成像图的强度点扩散函数高斯分布曲线图，通过对单颗粒的强度分布进行高斯拟合，在该实施例中，可以得到双光子、三光子及四光子荧光信号成像的分辨率分别为250nm，185nm，161nm，这一结果与在该实施例的实验条件下双光子、三光子及四光子成像的分辨率理论值224nm、183nm、159nm匹配的很好，证明在该实施例中使用简易的显微系统获得了很高分辨率的多光子成像结果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.钕离子敏化的上转换纳米材料在多光子显微成像中的用途，其特征在于，所述钕离子敏化的上转换纳米材料由中心波长＜800nm的稳态连续激光激发，在得到的多光子荧光光谱中，多光子发射峰均在可见光范围内。

2.高分辨多光子显微系统，其特征在于，该系统包括中心波长＜800nm的稳态连续二极管激光器、显微镜光学系统和载物台，所述显微镜光学系统包括扩束透镜组、扫描振镜、短通二向色镜、荧光滤光片、光电探测器和物镜，样品放置在载物台上，稳态连续二极管激光器产生的短波长连续激光耦合进入所述显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置扩束透镜组、扫描振镜和短通二向色镜，其中短通二向色镜与该激光束成45°角放置；在垂直于该激光束且穿过该短通二向色镜的光轴方向上，在该短通二向色镜上方同轴地依次放置有荧光滤光片和光电探测器，在该短通二向色镜下方放置有物镜，钕离子敏化的上转换纳米材料样品放置在载物台上物镜的焦点处；短通二向色镜使激发光反射、钕离子敏化的上转换纳米材料产生的多光子荧光透射。

3.根据权利要求2所述的高分辨多光子显微系统，其特征在于，所述稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为720～740nm，所述短通二向色镜用于反射波长大于670nm的激发光，透射波长小于670nm的多光子荧光。

4.根据权利要求2所述的高分辨多光子显微系统，其特征在于，所述稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm时，钕离子敏化的上转换纳米材料产生的多光子荧光光谱中，465-480nm波段为该样品的三光子发光峰，450-460nm波段为该样品的四光子发光峰，645-680nm波段为该样品的双光子发光峰。

5.根据权利要求2所述的高分辨多光子显微系统，其特征在于，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的双光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为1mW，选取645-680nm波段荧光进行探测。

6.根据权利要求2所述的高分辨多光子显微系统，其特征在于，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的三光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为100uW，选取465-480nm波段荧光进行探测。

7.根据权利要求2所述的高分辨多光子显微系统，其特征在于，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的四光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为100uW，选取450-460nm波段荧光进行探测。