CN103592278A - 基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法及装置，该方法包括：将同轴共路的激发光和抑制光同时聚焦在样品上，样品上具有受激荧光发射特性的位置随机出射荧光，收集荧光信号，生成稀疏荧光分布图像，对衍射斑进行单分子定位，将不同的荧光分子定位图像经图像合成后即得。该装置包括：第一激光光源、第二激光光源、反射镜、第一二色镜、科勒镜组、第二二色镜、显微物镜、样品、滤光片、场镜、目镜、宽场感光元件以及计算机。本发明的分辨率精细度高，可以获取横向20nm的超分辨图像；结构简单，成本低廉；减小了强激光或荧光漂白对于样品的非可逆损害，增强了样品的重复利用率；功能扩展性强。

Description

基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法及装置

技术领域

本发明涉及生物样品微观观测方法及设备领域，尤其涉及一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法及装置。

背景技术

纳米技术与生物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。纳米技术应用广泛，包括1～100nm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内，研究这些微小物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。反过来，超分辨率显微成像技术的发展也推动了整个生命科学的进步。相比其他的显微技术，光学显微技术的一大优势是可以对处于自然状态的活细胞进行研究。

自世界上第一台光学显微镜问世以来，提高光学显微成像系统的分辨能力及测量范围一直是众多科学家致力研究的重要科学问题，特别是近年来，随着物理学、生物医学、微电子学和材料学等学科的迅速发展，对这一问题的研究变得尤为迫切，主要体现在：物理学的发展要求人们能观测到微观世界中原子的大小；分子生物学的发展要求人们能观测到活体细胞这种高散射物质内小到纳米尺度的单分子；微电子技术的发展要求人们能检测到超大规模集成电路中窄到数十纳米的线宽尺寸；纳米新材料的出现要求人们能观测到纳米尺度大小的纳米颗粒等，这些现代科学的新进展，更加促使人们不断地去探索高分辨显微成像的新方法和新技术。

由于衍射极限的存在，传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm和1000nm。二十世纪三十年代发展起来的电子显微成像技术及八十年代初崛起的各类非光学的探针扫描显微成像技术具有纳米甚至更高的分辨能力，但它们在不同程度上存在着系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁琐等困难，特别是不能获得样品重要的光学信息（如反射率、折射率、偏振态及光谱等信息），因而无法完全取代光学显微成像的地位。

随着现代激光技术、计算机技术、精密机械及电子技术的迅猛发展，超分辨的光学显微成像技术（Super-resolution Optical Microscopy,SROM）应运而生。在生物学领域，基于荧光非线性效应的生物超分辨光学显微成像技术的发展尤为迅速。目前，主流的生物超分辨光学显微成像技术主要分为两大类：一类是以S.W.Hell等人提出的荧光发射抑制显微术（Stimulated EmissionDepletion Microscopy,STED）为代表的目标开关与读取显微技术（TargetedSwitching and Read-out Mode）；另一类是以E.Betzig等人提出的光敏定位显微技术（photoactivated localization microscopy，PALM）、X.Zhuang等人提出的随机光学重构显微技术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）为代表的随机开关与读取显微技术（Stochastic Switching andRead-out Mode）。前者以扫描方式成像，通过抑制光压缩系统的有效点扩散函数（Point Spread Function，PSF）直接提高系统的分辨能力；后者则是以宽场成像的方式，通过多幅图像重复拍摄的方法，对观察区域内的荧光分子进行随机定位，最终通过重构图像达到超分辨的目的。虽然上述两种方法均能够实现超分辨显微的目的，但是都并不完美，例如：目标开关与读取显微技术需要对样品施加较强的抑制光（一般为数百兆W/cm²）；而随机开关与读取显微技术则需要预先对观察区域内的荧光分子进行漂白。这两种情况都容易造成对观察样品不可逆的损害。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明综合了两种不同超分辨显微技术的基本原理，提供了一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法及装置，实现了对生物样品超分辨显微图像的获取。

一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法，包括以下步骤：

1）将同轴共路的激发光和抑制光同时聚焦在样品上；

2）在激发光和抑制光的共同作用下，样品上具有受激荧光发射特性的位置随机出射荧光，产生荧光信号；

3）收集荧光信号，生成稀疏荧光分布图像；

4）对稀疏荧光分布图像上的衍射斑进行单分子定位，生成荧光分子定位图像；

5）重复步骤3）和4），得到不同的荧光分子定位图像，经图像合成后得到样品的超分辨显微图像。

所述的超分辨显微，是指利用该方法获取的图像分辨率高于传统显微成像方法的分辨率，即高于所能分辨最小尺寸小于λ/2NA，其中λ为工作波长，NA为显微镜数值孔径。

为实现对所有荧光分子的观察，重复步骤3）随机得到不同的稀疏荧光分布图像，每个稀疏荧光分布图像即为稀疏化单帧图像，之后重复步骤4），对不同的稀疏荧光分布图像上的衍射斑进行单分子定位，生成不同的荧光分子定位图像，完成对观察区域内样品上不同荧光分子的单分子定位，直至样品上所有的荧光分子完成单分子定位。将不同的荧光分子定位图像（即定位图像序列）经图像合成后，即得到了样品的超分辨显微图像。

单分子定位，是指得到单个荧光分子受激发射的衍射斑后，使用曲线拟合算法对衍射斑进行高斯拟合，将拟合峰值位置作为该荧光分子的真实位置并在图像相应位置进行标记的数学过程。

图像合成，是指将所有单张荧光分子定位图像上的荧光分子定位点，线性映射到一张图像上的数学过程。

所述的样品具有受激荧光发射或类似特性，可以是纳米荧光颗粒或者经过荧光分子染色的生物组织、细胞样品，或者其它具有荧光发射特性的纳米颗粒、量子点等材料样品。

所述的激发光的波长位于样品荧光分子的激发谱内。

所述的抑制光的波长位于样品荧光分子的发射谱内。

本发明的工作原理是：

对于荧光分子而言，不同的激光入射波长将对其产生不同的影响。当入射激光波长位于荧光分子的激发谱内时，即入射激光为激发光，荧光分子将因为受激幅射作用而激发出荧光；相应地，当入射激光波长位于荧光分子的发射谱内时，即入射激光为抑制光，荧光分子的受激幅射现象将受到限制。当激发光和抑制光共同作用在荧光分子上时，则会产生竞争现象。根据简化的荧光二能级模型（基态S₀、激发态S₁），荧光分子自由电子的能级分布概率密度随时间变化的关系可以由如下公式表示：

$\frac{{\mathrm{dP}}_{S0}}{\mathrm{dt}}=-k_e{P}_{S0}+k_{S1}{P}_{S1}+k_{\mathrm{STED}}{P}_{S1}$

$\frac{{\mathrm{dP}}_{S1}}{\mathrm{dt}}=-k_{S1}{P}_{S1}-k_{\mathrm{STED}}{P}_{S1}+k_e{P}_{S0}$

其中，P_S0和P_S1分别是基态和激发态的能级分布概率密度，k_e=σ_eI_e是荧光分子的吸收速率，σ_e为吸收截面，I_e为激发光输入光强；k_S1=1/τ是荧光下转换速率常数，τ为荧光寿命；k_STED=σ_STEDI_STED是荧光抑制速率，σ_STED为荧光发射截面，I_STED为抑制光输入光强。由上述公式可以得到，对于整个样品观察区域而言，荧光发光效率F可以由如下公式表示：

$F=\frac{k_{\mathrm{fl}}}{k_{\mathrm{fl}}+k_{\mathrm{STED}}}=\frac{{\mathrm{qk}}_{S1}}{{\mathrm{qk}}_{S1}+{\mathrm{\σ}}_{\mathrm{STED}}{I}_{\mathrm{STED}}}$

其中k_fl为荧光发光速率，q为荧光转换量子效率。

由上述公式可以看出，由于上述公式中大部分参数由荧光分子自身性质及周围环境所决定，因此在真实环境中可以认为是常数。在这种前提下，荧光发光效率F将仅与抑制光输入功率I_STED相关。抑制光输入功率I_STED越大，荧光发光效率F就越低。在抑制光输入功率足够大的前提下，荧光发光效率F分布将表现出量子性：即不再表现为荧光发光光强的线性变化，而更多地表现为空间上的亮暗。在这种状态下，当使用宽场成像设备对整个样品观察区域成像时，可以观察到大部分区域内荧光分子发光被抑制而极少数荧光分子稀疏随机发光的现象，即会生成稀疏荧光分布图像。为观察到这种现象，根据压缩感知对稀疏矩阵的定义，此时荧光发光效率F应不大于5%。由于该要求远低于常规荧光发射抑制显微术（STED）中对于荧光发光效率的要求（<1%），因此在该种情况下，抑制光输入功率ISTED可以比常规荧光发射抑制显微术低一个数量级以上，从而大大降低了样品在观察过程中被强激光损坏的风险。同时，相比于现有的随机开关与读取显微技术如PALM和STORM等，由于不需要预先对样品进行荧光漂白，也避免了样品荧光分子失活的风险，增强了样品的重复利用率。

在实现了整个样品观察区域内荧光发光的稀疏化之后，可以使用现有的单分子定位算法，使用曲线拟合算法对衍射斑进行高斯拟合，将拟合峰值位置作为该荧光分子的真实位置并在图像相应位置进行标记，即实现了单帧图像的记录。现有的单分子定位算法已可以实现nm量级的分子定位精度，从而实现对于发光荧光分子的精确观察。由于在整个抑制过程中的荧光发光的随机性，在重复拍摄与定位的过程中，将逐步实现对整个观察区域内所有荧光分子的定位工作，最终实现整个样品观察区域内的超分辨显微成像。整个样品的成像精度由如下公式决定：

$R=\frac{d_c}{\sqrt{N}}$

其中d_c为单个荧光分子衍射弥散斑的大小，一般由拟合高斯函数的半高全宽（Full Width Half Maximum，FWHM）决定。N为单个记录位置内记录得到的荧光光子数。不难看出，整个成像分辨率随着记录图像帧数的增加而提高。但是，由于记录每帧图像都需要花费一定的时间，因此在真实情况下，需要在分辨率和成像速率上加以权衡。

本发明还提供了一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，能够实现基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法。

一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，包括：

用于产生激发光的第一激光光源；

用于产生抑制光的第二激光光源；

用于将激发光和抑制光合束的第一二色镜；

用于将所述第一二色镜的合束光均匀光线的科勒镜组；

用于聚焦激发光和抑制光并收集样品荧光信号的显微物镜；

用于将所述科勒镜组的匀光反射至所述显微物镜上并将所述显微物镜收集的样品荧光信号透射的第二二色镜；

用于对所述第二二色镜的透射光进行过滤激发光和抑制光的滤光片；

用于收束所述滤光片的出射光的场镜；

用于接收所述场镜的出射光的目镜；

用于将所述目镜的出射光进行成像的宽场感光元件；

以及用于对所述宽场感光元件形成的图像进行处理，并得到最终的样品超分辨显微图像的计算机。

作为优选，所述第一激光光源和第一二色镜均位于主轴光路上，所述第二激光光源通过反射镜与所述第一激光光源汇聚在所述第一二色镜上，第一二色镜将激发光和抑制光合束。

所述第一激光光源的发射谱宽小于等于10nm，发射功率在5～20mW之间，发射波长由样品荧光吸收谱决定，优选位于荧光吸收谱峰值位置。即所述第一激光光源的激发光的谱宽小于等于10nm，所述第一激光光源的发射功率为5～20mW，所述第一激光光源的激发光的波长位于样品的荧光吸收谱峰值位置。

所述第二激光光源的发射谱宽小于等于10nm，发射功率在100mW～1W之间，发射波长由样品荧光发射谱决定，优选位于荧光发射谱峰值红移位置。即所述第二激光光源的激发光的谱宽小于等于10nm，所述第二激光光源的发射功率为100mW～1W，所述第二激光光源的激发光的波长位于样品的荧光发射谱峰值红移位置。

作为优选，所述第一二色镜对激发光表现为高透、而对抑制光表现为高反。所述的高透，是指透过率在98%以上；所述的高反，是指反射率在98%以上，具体为98%～99.9%。即所述第一二色镜对激发光表现为98%以上的高透过率、而对抑制光表现为98%～99.9%高反射率

所述的科勒镜组可采用现有技术，用于均匀光线。

所述的第二二色镜用于分光，为了提高系统的能量利用率，要求第二二色镜对激发光和抑制光实现高反。所述的高反，是指反射率在98%以上。即所述的第二二色镜对激发光和抑制光需要98%以上高反射率。第二二色镜将激发光和抑制光反射至显微物镜，显微物镜再将激发光和抑制光在样品表面实现均匀照明，显微物镜还需要对样品稀疏随机发出的荧光（即荧光信号）进行反向收集，然后反向收集的荧光信号再发射到第二二色镜上，透射过第二二色镜，再经滤光片、场镜和目镜后在宽场感光元件上成像，得到稀疏荧光分布图像。

为了保证收集效率，提高系统能量利用率，作为优选，所述的显微物镜为数值孔径(NA)=1.35～1.49、放大率为50～150倍的浸没式平场消辅色差生物显微物镜镜头（也称生物显微镜平场消色差物镜镜头），进一步优选为数值孔径(NA)=1.4、放大率为100倍的浸没式平场消辅色差生物显微物镜镜头。

所述的滤光片，对荧光峰值波长表现为高透，而对激发光和抑制光波长表现为低透。所述的高透，是指透过率在99.9%以上；所述的低透，是指通过率在0.1%以下。为了保证对于激发光和抑制光波长的低透过率，可以采用多片滤光片叠加的方式实现。为保证滤光效率，不能使滤光片与主光轴完全垂直放置，而应保证一个小的夹角，优选角度为5°，即所述滤光片的光轴与主光轴的夹角为5°。

所述的宽场感光元件，可采用现有技术，具体可选用电荷耦合器件（CCD）、胶片等，优选为CCD，以方便进行数字图像处理。

在照明光路上，第一激光光源和第二激光光源在光学位置与样品及宽场感光元件互为共轭关系。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）分辨率精细度高，可以获取横向20nm的超分辨图像；

（2）结构简单，成本低廉；

（3）减小了强激光或荧光漂白对于样品的非可逆损害，增强了样品的重复利用率；

（4）可以与其他显微方式配合使用，功能扩展性强。

附图说明

图1为本发明基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置的结构原理示意图。

图2为本发明中荧光分子内二能级分布图；

图3为本发明中荧光分子稀疏发光图；

图4为本发明中图像合成过程的原理图。

具体实施方式

下面结合说明书附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，包括：第一激光光源1、第二激光光源2、反射镜3、第一二色镜4、科勒镜组5、第二二色镜6、显微物镜7、样品8、滤光片9、场镜10、目镜11、宽场感光元件12以及计算机13。

除计算机13外，光学元件沿光路方向设置，第一激光光源1和第一二色镜4均位于主轴光路上，第二激光光源2通过反射镜3与第一激光光源1汇聚在第一二色镜4上，第一二色镜4将第一激光光源1产生的激发光和第二激光光源2产生的抑制光合束，产生合束光。科勒镜组5位于第一二色镜4沿光路方向的后方，使得第一二色镜4的合束光光线均匀。第二二色镜6位于勒镜组5沿光路方向的后方，用于分光，具体为将科勒镜组5的匀光反射至显微物镜7上并将显微物镜7反向收集的样品荧光信号透射。滤光片9位于第二二色镜6沿光路方向的后方，滤光片9用于对第二二色镜6的透射光进行过滤激发光和抑制光。场镜10位于滤光片9沿光路方向的后方，场镜10用于收束滤光片9的出射光。目镜11位于场镜10沿光路方向的后方，用于接收场镜10的出射光。宽场感光元件12位于目镜11沿光路方向的后方，用于将目镜11的出射光进行成像（形成稀疏荧光分布图像）。计算机13用于对宽场感光元件12形成的图像进行处理，并得到最终的样品超分辨显微图像。

除计算机13外，图中所有光学元件及样品8均位于光路上。通过科勒镜组5及显微物镜7，第一激光光源1、第二激光光源2与样品8在光学上满足共轭关系；通过显微物镜7、场镜10以及目镜11，宽场感光元件12与样品8在光学上也满足共轭关系。

第一激光光源1用于提供装置所需要的激发光，其发射谱宽小于10nm，发射功率在5～20mW之间，发射波长由样品8荧光吸收谱决定，优选位于荧光吸收谱峰值位置；相应地，第二激光光源2用于提供装置所需要的抑制光，其发射谱宽小于10nm，发射功率在100mW～1W之间，发射波长由样品8荧光发射谱决定，为避免对探测荧光信号强度造成影响，优选位于荧光发射谱峰值红移位置。

抑制光从第二激光光源2出射后，经过反射镜3折转光路，再通过第一二色镜4与从第一激光光源1出射的激发光合束。为了达到上述目的，要求第一二色镜4对激发光表现为高透、而对抑制光表现为高反。所述的高透，是指透过率在98%以上；所述的高反，是指反射率在98%～99.9%。

经过合束的激发光和抑制光，将依次通过科勒镜组5和显微物镜7，在样品8上实现对样品观察面的均匀科勒照明。为了缩短光路轴向尺寸，在科勒镜组5和显微物镜7间加入第二二色镜6折转光路。为了提高系统的能量利用率，要求第二二色镜6对激发光和抑制光实现高反。所述的高反，是指反射率在98%以上。

除了将激发光和抑制光聚焦在样品表面实现均匀照明外，显微物镜7还需要对样品8发出的荧光信号进行反向收集。为了保证收集效率，提高系统能量利用率，要求显微物镜7具有如下特性：显微物镜为数值孔径(NA)=1.35～1.49、放大率为50～150倍的浸没式平场消辅色差生物显微物镜镜头，优选为数值孔径(NA)=1.4、放大率为100倍的浸没式平场消辅色差生物显微物镜镜头。

基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法，包括以下步骤：

1）将同轴共路的激发光和抑制光同时聚焦在样品上；

2）在激发光和抑制光的共同作用下，样品上具有受激荧光发射特性的位置随机出射荧光，产生荧光信号；

3）收集荧光信号，生成稀疏荧光分布图像；

4）对稀疏荧光分布图像上的衍射斑进行单分子定位，生成荧光分子定位图像；

5）重复步骤3）和4），得到不同的荧光分子定位图像，经图像合成后即可得到样品的超分辨显微图像。

为了利用荧光非线性实现超分辨显微成像，对用于观察的样品8有一定的限制。一般而言，要求样品8具有受激荧光发射或类似特性，可以是纳米荧光颗粒或者经过荧光分子染色的生物组织、细胞样品，或者其它具有荧光发射特性的纳米颗粒、量子点等材料样品。在满足上述限制的前提下，激发光将对样品8内荧光分子产生荧光激发作用；相应地，抑制光将对样品8内荧光分子产生荧光抑制作用。当激发光和抑制光共同作用在荧光分子上时，则会产生竞争现象。根据简化的荧光二能级模型（基态S₀、激发态S₁，如图2所示），荧光分子自由电子的能级分布概率密度随时间变化的关系可以由如下公式表示：

$\frac{{\mathrm{dP}}_{S0}}{\mathrm{dt}}=-k_e{P}_{S0}+k_{S1}{P}_{S1}+k_{\mathrm{STED}}{P}_{S1}$

$\frac{{\mathrm{dP}}_{S1}}{\mathrm{dt}}=-k_{S1}{P}_{S1}+k_{\mathrm{STED}}{P}_{S1}+k_e{P}_{S0}$

其中，P_S0和P_S1分别是基态和激发态的能级分布概率密度，k_e=σ_eI_e是荧光分子的吸收速率，σ_e为吸收截面，I_e为激发光输入光强；k_S1=1/τ是荧光下转换速率常数，τ为荧光寿命；k_STED=σ_STEDI_STED是荧光抑制速率，σ_STED为荧光发射截面，I_STED为抑制光输入光强。

由上述公式可以得到，对于整个样品观察区域而言，荧光发光效率可以由如下公式表示：

$F=\frac{k_{\mathrm{fl}}}{k_{\mathrm{fl}}+k_{\mathrm{STED}}}=\frac{{\mathrm{qk}}_{S1}}{{\mathrm{qk}}_{S1}+{\mathrm{\&sigma;}}_{\mathrm{STED}}{I}_{\mathrm{STED}}}$

其中k_fl为荧光发光速率，q为荧光转换量子效率。

由上述公式可以看出，由于上述公式中大部分参数由荧光分子自身性质及周围环境所决定，因此在真实环境中可以认为是常数。在这种前提下，荧光发光效率F将仅与抑制光输入功率I_STED相关。抑制光输入功率I_STED越大，由荧光发光效率F越低。在抑制光输入功率I_STED足够大的前提下，荧光发光效率F分布将表现出量子性：即不再表现为荧光发光光强的线性变化，而更多地表现为空间上的亮暗。在这种状态下，样品8大部分区域内荧光分子发光被抑制而极少数荧光分子稀疏随机发光，即可得到稀疏荧光分布图像。为观察到这种现象，根据压缩感知对稀疏矩阵的定义，此时荧光发光效率F应不大于5%，通过上述公式反算即可得到所需要的值。由于该要求远低于常规荧光发射抑制显微术（STED）中对于荧光发光效率的要求（<1%），因此在该种情况下，抑制光输入功率I_STED可以比常规荧光发射抑制显微术低一个数量级以上，从而大大降低了样品在观察过程中被强激光损坏的风险。同时，相比于现有的随机开关与读取显微技术如PALM和STORM等，由于不需要预先对样品进行荧光漂白，因此，也避免了样品荧光分子失活的风险，增强了样品的重复利用率。

在实现了荧光发光的稀疏化之后，样品8上发出的荧光，将被显微物镜7反向收集。收集到的荧光信号，将直接透过第二二色镜6进入整个系统的探测光路。第二二色镜6对于样品8荧光发射光谱峰值附近的波长呈高透特性，透过率大于98%。在荧光信号通过第二二色镜6后，仍需要使用滤光片9进一步去除杂散光。滤光片9对荧光峰值波长表现为高透，而对激发光和抑制光波长表现为低透。所述的高透，是指透过率在99.9%以上；所述的低透，是指通过率在0.1%以下。为了保证对于激发光和抑制光波长的低透过率，可以采用多片滤光片叠加的方式实现。并且，为了保证滤光效率，不能使滤光片9与主光轴完全垂直放置，而应保证一个小的夹角，滤光片9的光轴与光路的主光轴的夹角优选为5°。通过滤光片9后，荧光将进一步通过场镜10进行收束，并最终通过目镜11成像在宽场感光元件12上。通过上述一系列光路后，宽场感光元件12与样品8在光学位置上满足共轭关系，这样，通过宽场感光元件12即可以得到样品8观察区域内荧光发光的单帧稀疏荧光分布图像，如图3所示。宽场感光元件12具体可选用电荷耦合器件（CCD）、胶片等，优选为CCD，以方便进行数字图像处理。

如图4所示，在获取了样品8观察区域内荧光发光的单帧稀疏荧光分布图像之后，所得到的信号将交由计算机13进行处理。可以使用现有的单分子定位算法，使用曲线拟合算法对衍射斑进行高斯拟合，将拟合峰值位置作为该荧光分子的真实位置并在图像相应位置进行标记，即实现了单帧位置图像的记录。现有的单分子定位算法，如fluoroBancroft算法、Maliang算法等，已可以实现nm量级的快速分子定位精度，从而实现对于发光荧光分子的精确观察。再通过计算机13保存在单帧位置图像之后，重复上述步骤，最终即可得到不同的荧光分子定位图像，即位置图像序列。由于在整个抑制过程中的荧光发光的随机性，在重复拍摄与定位的过程中，将逐步实现对整个观察区域内所有荧光分子的定位工作。此后，需要对整个位置图像序列加以合成成为一幅完整图像。所述的图像合成，是指将所有单张定位图像上的荧光分子定位点，线性映射到一张图像上的数学过程。至此，整个样品的成像精度由如下公式决定：

$R=\frac{d_c}{\sqrt{N}}$

其中d_c为单个荧光分子衍射弥散斑的大小，一般由拟合高斯函数的半高全宽（Full Width Half Maximum，FWHM）决定。N为单个记录位置内记录得到的荧光光子数。不难看出，整个成像分辨率随着记录图像帧数的增加而提高。但是，由于记录每帧图像都需要花费一定的时间，因此在真实情况下，需要在分辨率和成像速率上加以权衡。

Claims (9)

1.一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将同轴共路的激发光和抑制光同时聚焦在样品上；

2）在激发光和抑制光的共同作用下，样品上具有受激荧光发射特性的位置随机出射荧光，产生荧光信号；

3）收集荧光信号，生成稀疏荧光分布图像；

4）对稀疏荧光分布图像上的衍射斑进行单分子定位，生成荧光分子定位图像；

5）重复步骤3）和4），得到不同的荧光分子定位图像，经图像合成后得到样品的超分辨显微图像。

2.一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，其特征在于，包括：

用于产生激发光的第一激光光源；

用于产生抑制光的第二激光光源；

用于将激发光和抑制光合束的第一二色镜；

用于将所述第一二色镜的合束光均匀光线的科勒镜组；

用于聚焦激发光和抑制光并收集样品荧光信号的显微物镜；

用于将所述科勒镜组的匀光反射至所述显微物镜上并将所述显微物镜收集的样品荧光信号透射的第二二色镜；

用于对所述第二二色镜的透射光进行过滤激发光和抑制光的滤光片；

用于收束所述滤光片的出射光的场镜；

用于接收所述场镜的出射光的目镜；

用于将所述目镜的出射光进行成像的宽场感光元件；

以及用于对所述宽场感光元件形成的图像进行处理，并得到最终的样品超分辨显微图像的计算机。

3.根据权利要求2所述的基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，其特征在于，所述第一激光光源和第一二色镜均位于主轴光路上，所述第二激光光源通过反射镜与所述第一激光光源汇聚在所述第一二色镜上。

4.根据权利要求2所述的基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，其特征在于，所述第一激光光源的激发光的谱宽小于等于10nm，所述第一激光光源的发射功率为5～20mW，所述第一激光光源的激发光的波长位于样品的荧光吸收谱峰值位置。

5.根据权利要求2所述的基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，其特征在于，所述第二激光光源的激发光的谱宽小于等于10nm，所述第二激光光源的发射功率为100mW～1W，所述第二激光光源的激发光的波长位于样品的荧光发射谱峰值红移位置。

6.根据权利要求2所述的基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，其特征在于，所述第一二色镜对激发光表现为98%以上的高透过率、而对抑制光表现为98%～99.9%高反射率。

7.根据权利要求2所述的基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，其特征在于，所述的第二二色镜对激发光和抑制光需要98%以上高反射率。

8.根据权利要求2所述的基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，其特征在于，所述的显微物镜为数值孔径=1.35～1.49、放大率为50～150倍的浸没式平场消辅色差生物显微物镜镜头。

9.根据权利要求2所述的基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微装置，其特征在于，所述滤光片的光轴与主光轴的夹角为5°。

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