CN103364384A - 受激发射损耗显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种基于高级次轴对称偏振涡旋光束的超分辨受激发射损耗显微成像方法及装置，利用该方法可获得物体的三维超分辨显微成像。将第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束聚焦获得实心光斑，将第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束聚焦获得空心光斑。所述聚焦中空光斑与所述聚焦实心光斑重叠，聚焦实心光斑所激发的样品上的荧光基团发出荧光，而聚焦中空光斑抑制了该荧光基团外围所发出的荧光，这样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到；激发的荧光经过滤光片滤波后被透镜聚焦，该聚焦光斑被探测器探测，得到超分辨受激发射损耗显微图像。

Description

受激发射损耗显微成像方法及装置

技术领域

本发明涉及受激发射损耗显微成像技术，具体涉及一种利用高级次轴对称偏振涡旋光束的超分辨受激发射损耗显微成像方法及装置。

背景技术

现代生物学和材料科学的发展对微观结构的研究提出了越来越高的分辨率需求，希望从分子水平揭示生命过程和材料性能的物理本质。但受到光学衍射极限的限制，普通光学显微镜的横向分辨率一般只能达到200nm，纵向分辨率约500nm，这对于研究亚细胞结构和分子结构已无能为力。虽然电子显微镜（Electron Microscopy）、原子力显微镜（AtomForce Microscopy）、近场扫描光学显微镜（Near-field Scanning OpticalMicroscope,NSOM）等技术可以获得很高的分辨率，但是由于缺乏特异性的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子，而且也不适合观察活细胞和细胞膜的动态变化过程。因此，如何利用光学方法突破传统光学显微镜的分辨率极限，使其既具有纳米尺度的光学分辨本领又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化，成为光学显微成像技术的一个重要挑战和机遇。

近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，远场光学显微成像的分辨率已经突破了衍射极限的限制，发展了多种超分辨荧光显微成像技术，如激活定位显微技术（Photoactivated LocalizationMicroscopy,PALM）、随机光学重构显微技术（Stochastic OpticalReconstruction Microscopy,STORM）、受激发射损耗显微技术（Stimulated Emission Depletion,STED）和结构照明显微技术（Structured Illumination Microscopy,SIM）等。其中，STED显微成像技术受到了特别关注，基于该技术极大改进了远场光学显微成像的分辨率，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质，而且它是一种从物理上打破衍射光学极限的远场荧光显微技术。STED显微成像技术的原理是：首先，使用一束激光在样品表面聚焦产生一个实心小光斑，仅激发一个点的荧光基团使其发荧光；然后，再用另一束激光在样品表面相同位置区域聚焦产生一个面包圈样的空心光斑抑制那个点周围的荧光强度，这样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到。接下来，收集发光点发出的荧光，探测处理后得到超分辨的显微图像。最后，连续移动三维平移台改变探测位置，最终得到整个物体的三维显微成像。

实现超分辨STED显微成像的关键是如何形成具有超小尺寸的激发光斑和抑制光斑，其中激发光斑是一个聚焦的实心光斑，而抑制光斑是一个聚焦的空心光斑。STED显微镜的分辨率主要是由有效荧光光斑的大小及损耗效果决定的。可以通过各种措施改善STED光在焦平面相干形成的抑制光斑的干涉对比度及中心强度分布,通过改善影响相干的条件,压缩荧光光斑的大小,尽可能提高横向和轴向抑制比。

近年来，提出了多种实现激发光斑和抑制光斑的方法和实验装置，例如S W Hell等人提出了一种基于0～2π涡旋位相板，使用圆偏光形成面包圈样的空心聚焦光斑的方法，见文献“S W Hell.Far-field opticalnanoscopy,Single Molecule Spectroscopy in Chemistry,Physics andBiology.Springer Series in Chemical Physics96:365-398，2010”。作为一种经典的光斑形成方法，它被广泛应用于目前的多种STED显微镜产品中。但这种技术的缺点在于圆偏振激发光难以聚焦到衍射极限以下，另外如果利用圆偏振光通过涡旋位相板形成面包圈光斑来抑制激发光斑周围的荧光，其抑制效果的提高只能靠增加STED激光功率，而高光强会对生物样品造成损伤。随后，又提出了诸如基于0/π圆形相位板、柱矢量光束等获得抑制光斑的方法。

如何通过对激发光束和受激发射损耗光束进行合理的偏振、相位及振幅调制以获得满足要求的超小聚焦光斑，这成为目前STED显微成像技术一个重要的技术关键。

发明内容

本发明提出了一种基于高级次轴对称偏振涡旋光束的超分辨STED显微成像方法及实现装置，利用该方法可获得物体的三维超分辨显微成像。

本发明提供一种基于高级次轴对称偏振涡旋光束的超分辨STED显微成像方法，包括如下步骤：在一路，激光器发出一连续或脉冲激光束，用作激发激光光束；所述激发激光光束光束经过针孔滤波器消除了杂散光，被透镜准直成一平行光束；该平行光束经过一偏振转换系统转换为第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束；然后该光束经过一光瞳滤波器，并被二向色分束镜反射，经过透镜聚焦获得一聚焦实心光斑；与此同时，在另一路，激光器发出一连续或脉冲激光束，用作受激发射损耗光束；所述受激发射损耗光束经过针孔滤波器、准直透镜后获得一强度均匀的准直光束；所述准直光束被光束偏振转换系统转换为第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，该光束进一步被光瞳滤波器调制，然后被二向色分束镜反射并被透镜聚焦，得到一聚焦中空光斑，用作受激发射损耗光斑；所述聚焦中空光斑与所述聚焦实心光斑重叠，聚焦实心光斑所激发的样品上的荧光基团发出荧光，而聚焦中空光斑抑制了该荧光基团外围所发出的荧光，这样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到；激发的荧光经过滤光片滤波后被透镜聚焦，该聚焦光斑被探测器探测，得到超分辨STED显微图像，其中，高级次轴对称偏振涡旋光束具有如下的光场复振幅分布， ${\stackrel{\→}{E}}_{\mathrm{in}}=\mathrm{AP}\left(\mathrm{\θ}\right)\exp \left(\mathrm{il\φ}\right)\left\{\cos \right[(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]{\stackrel{\→}{e}}_r+\sin [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0\left]{\stackrel{\→}{e}}_{\mathrm{\φ}}\right\},$ 上式中，A是一常数，代表光场的平均振幅大小；P(θ)为光束的光瞳函数，表征了光束的相对振幅及相位分布；l称为拓扑电荷数，表征沿圆周方向变化一周时光束涡旋相位变化的周期数；P为光束的偏振级次；分别为沿着径向和切向的单位矢量，其中P>1，l>0，当上述高级次轴对称偏振涡旋光束满足条件|l+P-1|=0或者|l-P+1|=0或者|l-P+2|=0或者|l+P-2|=0或者|l-P|=0或者|l+P|=0时，即为第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，可聚焦获得实心光斑，否则即为第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，聚焦获得空心光斑。

可选的，所述光瞳滤波器是能够对入射光束的振幅和相位进行调制的衍射光学元件，采用圆环形结构，其滤波函数可表示为，

其中，a_j和

分别对应第j个环带振幅透过率的振幅及相位值。

可选的，当第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束满足P为5且l为3，第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束满足P为5且l为2时，所获得的STED光斑的半高全宽度小于半个波长，突破了衍射极限的限制。

本发明还提供一种实现上述方法的基于高级次轴对称偏振涡旋光束的超分辨STED显微成像装置。

附图说明

图1是轴对称偏振光束的空间偏振分布

图2(a)-(d)是高级次轴对称偏振涡旋光束聚焦场在焦平面上的强度分布，其中图2(a)-图2(b)对应P=5,l=3，图2(c)-图2(d)对应P=5,l=2，聚焦透镜数值孔径为0.95。

图3(a)是STED显微成像系统结构示意图，图3(b)是差动共焦检测系统结构示意图。

图4是光瞳滤波器的结构示意图

具体实施方式

下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

轴对称偏振光束(Axially Symmetric Polarized Beams,ASPBs)是一种具有轴对称特性的偏振光束，对称轴为光束的传播轴。如图1所示，光束在横截面上任意一点（中心点除外）的偏振态为线偏振，偏振方位在横截面内。假设x-y平面为光束的横截面，z轴代表光束的传播轴，S(r,φ)为光束横截面上的某一点(中心点除外)，其偏振方位满足如下关系，

Φ(r,φ)=P×φ+φ₀(P≠0)   (1)

其中，P称为偏振级次，表示光束沿圆周方向变化360°时偏振方位变化的周期数；φ₀是当φ=0时对应的初始偏振方位角，其值与x轴的选取有关；S点的偏振方位与该点对应的空间方位角有关。当偏振级次P大于1时，通常称之为高级次轴对称偏振光束。在此基础上，还可以通过模式叠加的方法产生高级次轴对称偏振涡旋光束，即光束不仅具有高级次的空间变化偏振分布，同时具有涡旋相位分布。

假设高级次轴对称偏振涡旋光束具有如下的光场复振幅分布，

${\stackrel{\→}{E}}_{\mathrm{in}}=\mathrm{AP}\left(\mathrm{\θ}\right)\exp \left(\mathrm{il\φ}\right)\left\{\cos \right[(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]{\stackrel{\→}{e}}_r+\sin [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0\left]{\stackrel{\→}{e}}_{\mathrm{\φ}}\right\}---\left(2\right)$

其中，A是一常数，代表光场的平均振幅大小；P(θ)为光束的光瞳函数，表征了光束的相对振幅及相位分布；l称为拓扑电荷数，表征沿圆周方向变化一周时光束涡旋相位变化的周期数；P为光束的偏振级次；

分别为沿着径向和切向的单位矢量，其中P>1，l>0。l也可以是复数，只是不要等于零。

关于高级次轴对称偏振涡旋光束的生成，目前提出了多种方法，例如基于亚波长金属和介质光栅的方法、基于空间光调制器的方法以及液晶偏振转换器与涡旋相位片相结合的方法等。例如基于4f系统和空间光调制器的自相干分解与合成生成方法，具体可参考Xilin Wang等人的文献“通过空间光调制器和公共光路干涉构造来生成任意矢量光束（Generation of arbitrary vector beams with a spatial lightmodulator and a common path interferometric arrangement）,Opt.Lett.,32:3549,2007”。。通过计算机灵活控制空间光调制器对入射光束的振幅及相位进行调制，就可以生成多种形式的高级次轴对称偏振涡旋光束。

基于矢量衍射理论，可推导出高级次轴对称偏振涡旋光束的高数值孔径聚焦场分布，

$\stackrel{\→}{E}(r_S,{\mathrm{\φ}}_S,z_S)=\left[\begin{array}{c}{E}_r^{\left(S\right)}\\ E_{\mathrm{\φ}}^{\left(S\right)}\\ E_z^{\left(S\right)}\end{array}\right]$

$=\frac{-\mathrm{iA}}{\mathrm{\π}}\underset{0}{\overset{\mathrm{\α}}{\∫}}\mathrm{d\θ}\underset{0}{\overset{2\mathrm{\π}}{\∫}}\exp \left(\mathrm{il\φ}\right)P\left(\mathrm{\θ}\right)A\left(\mathrm{\θ}\right)T\left(\mathrm{\θ}\right)\sin \mathrm{\θexp}\left\{\mathrm{ik}\right[z_S\cos \mathrm{\θ}-r_S\sin \mathrm{\θ}\cos (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_S)\left]\right\}$

$\×\left[\begin{array}{c}\cos [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]\cos \mathrm{\θ}\cos (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_s)-\sin [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]\sin (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_s)\\ \cos [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]\cos \mathrm{\θ}\sin (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_s)+\sin [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]\cos (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_s)\\ \cos [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]\sin \mathrm{\θ}\end{array}\right]\mathrm{d\φ}---(3$

$)$

其中S(r_s,φ_s,z_s)是焦平面附近某一观察点，E_r、E_φ和E_z是径向、切向及轴向三个正交分量的光场复振幅。A是一个常数，P(θ)是光束的光瞳函数，表征入射光束相对的振幅及相位分布，A(θ)为聚焦透镜的切趾函数，T(θ)为光瞳滤波器的滤波函数。K(k,要小写，这个属于一种专有符号)是波数，θ称为光束会聚角，即某一光束波矢与光轴的夹角，因此最大的会聚角α与聚焦透镜数值孔径的关系为α=sin^-1(NA/n)，其中n是周围媒质的折射率。利用贝塞尔函数恒等关系，上式可进一步简化为，

$E_r^{\left(S\right)}(r_s,{\mathrm{\φ}}_s,z_s)=\frac{-\mathrm{iA}}{2}{\∫}_0^{\mathrm{\α}}{l}_0\left(\mathrm{\θ}\right)\sin \mathrm{\θ}\sqrt{\cos \mathrm{\θ}}\exp \left({\mathrm{ikz}}_s\cos \mathrm{\θ}\right)$

$\×\left\{i^{P+l}\exp \right[i(P+l-1){\mathrm{\φ}}_s+{\mathrm{i\φ}}_0]J_{P+l}\left(X\right)(\cos \mathrm{\θ}+1)$

$+i^{l-P}\exp [i(l-P+1){\mathrm{\φ}}_s-{\mathrm{i\φ}}_0]J_{l-P}\left(X\right)(\cos \mathrm{\θ}+1)$

$+i^{l+P-2}\exp [i(l+P-1){\mathrm{\φ}}_s+{\mathrm{i\φ}}_0]J_{l+P-2}\left(X\right)(\cos \mathrm{\θ}-1)$

$+i^{l-P+2}\exp [i(l-P+1){\mathrm{\φ}}_s-{\mathrm{i\φ}}_0]J_{l-P+2}\left(X\right)(\cos \mathrm{\θ}-1)\}\mathrm{d\θ}$

$\left(4a\right)$

$E_{\mathrm{\φ}}^{\left(S\right)}(r_s,{\mathrm{\φ}}_s,z_s)=\frac{-A}{2}{\∫}_0^{\mathrm{\α}}{l}_0\left(\mathrm{\θ}\right)\sin \mathrm{\θ}\sqrt{\cos \mathrm{\θ}}\exp \left({\mathrm{ikz}}_s\cos \mathrm{\θ}\right)$

$\×\left\{i^{P+l}\exp \right[i(P+l-1){\mathrm{\φ}}_s+{\mathrm{i\φ}}_0]J_{P+l}\left(X\right)(\cos \mathrm{\θ}+1)$

$-i^{l-P}\exp [i(l-P+1){\mathrm{\φ}}_s-{\mathrm{i\φ}}_0]J_{l-P}\left(X\right)(\cos \mathrm{\θ}+1)$

$+i^{l+P-2}\exp [i(l+P-1){\mathrm{\φ}}_s+{\mathrm{i\φ}}_0]J_{l+P-2}\left(X\right)(1-\cos \mathrm{\θ})$

$-i^{l-P+2}\exp [i(l-P+1){\mathrm{\φ}}_s-{\mathrm{i\φ}}_0]J_{l-P+2}\left(X\right)(1-\cos \mathrm{\θ})\}\mathrm{d\θ}---\left(4b\right)$

$E_z(r,\mathrm{\φ},z)=-\mathrm{iA}{\∫}_0^{\mathrm{\α}}{l}_0\left(\mathrm{\θ}\right){\sin }^2\mathrm{\θ}\sqrt{\cos \mathrm{\θ}}\exp \left({\mathrm{ikz}}_s\cos \mathrm{\θ}\right)$

$\×\left\{i^{(l+P-1)}\exp \right[i(l+P-1){\mathrm{\φ}}_s+i{\mathrm{\φ}}_0]J_{l+P-1}\left(X\right)$

$+i^{(l-P+1)}\exp [i(l-P+1){\mathrm{\φ}}_s-{\mathrm{i\φ}}_0]J_{l-P+1}\left(X\right)\}\mathrm{d\θ}---\left(4c\right)$

其中，X=-kr_ssinθ。基于以上公式，可计算出不同情况下聚焦场的振幅、相位及强度分布。而且根据上述公式中的贝塞尔函数不难发现，当|l+P-1|=0或者|l-P+1|=0或者|l-P+2|=0或者|l+P-2|=0或者|l-P|=0或者|l+P|=0时，聚焦场是一种实心结构，否则是一种空心结构。因此，这意味着，通过灵活的调控高级次轴对称偏振涡旋光束的偏振及相位分布可以得到不同的聚焦光场强度分布，包括实心及空心聚焦光斑。当该类型光束应用于STED显微成像系统中，实心光斑可用于激发光斑，而空心光斑用于抑制光斑，结合相位滤波技术还可以进一步减小激发荧光的光斑，提高现有STED显微成像系统的分辨率。

假设入射光束的光瞳函数为

$P\left(\mathrm{\θ}\right)=\exp [-{\mathrm{\β}}^2{\left(\frac{\sin \mathrm{\θ}}{\sin \mathrm{\α}}\right)}^2]{\left(\sqrt{2}\mathrm{\β}\frac{\sin \mathrm{\θ}}{\sin \mathrm{\α}}\right)}^P{L}_p^l\left(2{\mathrm{\β}}^2\frac{{\sin }^2\mathrm{\θ}}{\mathrm{si}{n}^2\mathrm{\α}}\right)---\left(5\right)$

其中，表示径向系数为p、切向系数为l的勒让德多项式，β为透镜填充因子，这里假定β=1,p=0,φ₀=0,A=1,n=1。

图2(a)-图2(d)显示了两种不同偏振级次和拓扑电荷数的高级次轴对称偏振光束高数值孔径聚焦场的强度分布，其中透镜数值孔径为0.95。图2(a)-图2(b)对应了P=5,l=3的偏振光束，其聚焦场是一实心光斑，半高全宽度为0.46λ；而图2(c)-图2(d)对应了P=5,l=2的偏振光束，其聚焦场是一空心光斑，半高全宽度为0.34λ。很显然，对于高级次轴对称偏振涡旋光束，通过灵活的调控光束的偏振级次和拓扑电荷数，就可以灵活地调控其聚焦场的强度分布，或者超小的实心和空心聚焦光斑，分别作为激发光束和受激发发射光束，可以实现超分辨的成像。本领域技术人员可知，除了给出的两组P和L的数值外，有很多组组合满足条件，但是需要改变数值孔径和光瞳滤波函数，例如，维持光瞳函数不变，当透镜数值孔径为0.98，P=6，L=4得到超分辨的实心聚焦光斑，而P=6，L=3得到超分辨的空心聚焦光斑。

为此，建立如图3(a)所示的STED显微成像系统，其中激光器1发出一连续或脉冲激光束，用作激发激光光束，该光束经过显微物镜和针孔组成的针孔滤波器2消除了杂散光，被透镜3准直获得一平行光束，该平行光束经过一偏振转换系统4转换为高级次轴对称偏振涡旋光束，然后该光束经过一光瞳滤波器5，并被二向色分束镜8反射，经过透镜9聚焦在焦平面10上得到一聚焦实心光斑。

在另一路，激光器1′发出一连续或脉冲激光束，用作受激发射损耗光束，即STED光，经过透镜和针孔组成的针孔滤波器2′、准直透镜3′后获得一强度较为均匀的准直光束，被光束偏振转换系统4′转换为另外一种形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，该光束进一步被光瞳滤波器5′调制，然后被二向色分束镜8′反射并被透镜9聚焦在焦平面10上，得到一聚焦中空光斑，用作受激发射损耗光斑。

该聚焦中空光斑与上述聚焦实心光斑重叠，聚焦实心光斑所激发的样品上的荧光基团发出荧光，而聚焦中空光斑抑制了该荧光基团外围所发出的荧光，这样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到。激发的荧光经过滤光片11滤波后被透镜12聚焦，该聚焦光斑被APD探测器14探测。

可在探测器前放置一探测针孔，利用共聚焦成像原理提高荧光信号探测的分辨率，也可在此基础上，引入差动共焦检测的系统，提高信号轴向探测的灵敏度和分辨率，如图3(b)所示。

在以上所述的STED系统中，激发光、STED光以及荧光物质都有非常苛刻的要求，三者的相关能级一定要吻合。激发光的波长低于STED光的波长，而且通常需要采用超连续、高能量的激发激光和STED光，激发脉冲宽度一般在几十皮秒，STED光一般在200ps左右，脉冲重复间隔要小于1MHz，具体要求则根据不同的实验要求设定。偏振转换系统可将入射的激光束转换为多种形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，基于干涉仪与空间光调制器相结合的模式叠加方法获得，如文献“Hao Chen,Jingjing Hao,Baifu Zhang,Ji Xu,Jianping Ding,and Huitian Wang.Generation of vector beam with space-variant distribution of bothpolarization and phase.Optics Letters,36(16),3179-3181,2011.”所述。所用的聚焦透镜5是一种高数值孔径的消复色差透镜，例如奥林巴斯公司生产的APON60XO TIRF油浸物镜，数值孔径为1.49，其中油的折射率为1.518。光瞳滤波器1和2是一类可对入射光束的振幅和相位进行调制的衍射光学元件，通常采用圆环形结构，如图4所示，其滤波函数可表示为，

其中，a_j和分别对应第j个环带振幅透过率的振幅及相位值。

事实上，通过进一步优化光瞳滤波函数，选择特殊设计的聚焦透镜，例如抛物面透镜或菲涅耳透镜等，可以进一步降低激发光斑和抑制光斑的尺寸，从而进一步提高STED显微成像的分辨率。另外，将STED显微成像技术和4Pi共焦显微成像技术相结合，建立4Pi-STED显微系统，同时结合高级次轴对称偏振涡旋光束独特的聚焦特性，有望进一步提高STED的成像分辨率。

以上已对本发明实施例进行描述。然而，本领域技术人员将理解，在不背离由权利要求所确定的本发明的真实范围和精神的情况下，可对这些实施例进行更改和变型。

Claims (6)

1.一种基于高级次轴对称偏振涡旋光束的受激发射损耗显微成像方法，包括如下步骤：

在一路，

激光器发出一连续或脉冲激光束，用作激发激光光束；

所述激发激光光束经过针孔滤波器消除了杂散光，被透镜准直成一平行光束；

该平行光束经过一偏振转换系统转换为第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束；

然后该光束经过一光瞳滤波器，并被二向色分束镜反射，经过透镜聚焦获得一聚焦实心光斑；

同时在另一路，

激光器发出一连续或脉冲激光束，用作受激发射损耗光束；

所述受激发射损耗光束经过针孔滤波器、准直透镜后获得一强度均匀的准直光束；

所述准直光束被光束偏振转换系统转换为第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，该光束进一步被光瞳滤波器调制，然后被二向色分束镜反射并被透镜聚焦，得到一聚焦中空光斑，用作受激发射损耗光斑；

所述聚焦中空光斑与所述聚焦实心光斑重叠，聚焦实心光斑所激发的样品上的荧光基团发出荧光，而聚焦中空光斑抑制了该荧光基团外围所发出的荧光，这样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到；激发的荧光经过滤光片滤波后被透镜聚焦，该聚焦光斑被探测器探测，得到超分辨STED显微图像，

其中，高级次轴对称偏振涡旋光束具有如下的光场复振幅分布，

${\stackrel{\→}{E}}_{\mathrm{in}}=\mathrm{AP}\left(\mathrm{\θ}\right)\exp \left(\mathrm{il\φ}\right)\left\{\cos \right[(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]{\stackrel{\→}{e}}_r+\sin [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0\left]{\stackrel{\→}{e}}_{\mathrm{\φ}}\right\},$

上式中，A是一常数，代表光场的平均振幅大小；P(θ)为光束的光瞳函数，表征了光束的相对振幅及相位分布；l称为拓扑电荷数，表征沿圆周方向变化一周时光束涡旋相位变化的周期数；P为光束的偏振级次；

分别为沿着径向和切向的单位矢量，其中P>1，l>0，

当上述高级次轴对称偏振涡旋光束满足条件|l+P-1|=0或者|l-P+1|=0或者|l-P+2|=0或者|l+P-2|=0或者|l-P|=0或者|l+P|=0时，即为第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，可聚焦获得实心光斑，否则即为第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，聚焦获得空心光斑。

2.如权利要求1所述的受激发射损耗显微成像方法，其中所述光瞳滤波器是能够对入射光束的振幅和相位进行调制的衍射光学元件，采用圆环形结构，其滤波函数可表示为，

其中，a_j和

分别对应第j个环带振幅透过率的振幅及相位值。

3.如权利要求2所述的受激发射损耗显微成像方法，其中聚焦透镜数值孔径为0.95，第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束满足P为5且l为3，第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束满足P为5且l为2。

4.一种基于高级次轴对称偏振涡旋光束的受激发射损耗显微成像装置，包括如下部分：

第一激光器，所述第一激光器发出一连续或脉冲激光束，用作激发激光光束；

第一滤波和准直系统，所述激发激光光束经过所述第一滤波和准直部分消除了杂散光，并被准直成一平行光束；

第一偏振转换系统，该平行光束经过所述第一偏振转换系统转换为第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束；

第一聚焦反射系统，所述第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束经过所述聚焦反射系统获得一聚焦实心光斑；

第二激光器，所述第二激光器发出一连续或脉冲激光束，用作受激发射损耗光束；

第二滤波和准直系统，所述受激发射损耗光束经过所述第二滤波和准直系统后获得一强度均匀的准直光束；

第二光束偏振转换系统，所述准直光束被所述第二光束偏振转换系统转换为第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束；

第二聚焦反射系统，所述第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束进一步被所述第二聚焦反射系统聚焦，得到一聚焦中空光斑，用作受激发射损耗光斑；

其中所述聚焦中空光斑与所述聚焦实心光斑重叠，聚焦实心光斑所激发的样品上的荧光基团发出荧光，而聚焦中空光斑抑制了该荧光基团外围所发出的荧光，这样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到；

探测系统，被激发的荧光经过所述探测系统探测，得到超分辨受激发射损耗显微图像，

其中，高级次轴对称偏振涡旋光束具有如下的光场复振幅分布，

${\stackrel{\→}{E}}_{\mathrm{in}}=\mathrm{AP}\left(\mathrm{\θ}\right)\exp \left(\mathrm{il\φ}\right)\left\{\cos \right[(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]{\stackrel{\→}{e}}_r+\sin [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0\left]{\stackrel{\→}{e}}_{\mathrm{\φ}}\right\},$

上式中，A是一常数，代表光场的平均振幅大小；P(θ)为光束的光瞳函数，表征了光束的相对振幅及相位分布；l称为拓扑电荷数，表征沿圆周方向变化一周时光束涡旋相位变化的周期数；P为光束的偏振级次；

分别为沿着径向和切向的单位矢量，其中P>1，l>0，

当上述高级次轴对称偏振涡旋光束满足条件|l+P-1|=0或者|l-P+1|=0或者|l-P+2|=0或者|l+P-2|=0或者|l-P|=0或者|l+P|=0时，即为第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，可聚焦获得实心光斑，否则即为第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束，聚焦获得空心光斑。

5.如权利要求4所述的受激发射损耗显微成像装置，其中所述第一和第二滤波和准直系统包括光瞳滤波器，所述光瞳滤波器是能够对入射光束的振幅和相位进行调制的衍射光学元件，采用圆环形结构，其滤波函数可表示为，

其中，a_j和分别对应第j个环带振幅透过率的振幅及相位值。

6.如权利要求5所述的受激发射损耗显微成像装置，其中聚焦透镜数值孔径为0.95，第一形式的高级次轴对称偏振涡旋光束满足P为5且l为3，第二形式的高级次轴对称偏振涡旋光束满足P为5且l为2。

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