CN109387496A - 高分辨率显微成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高分辨率显微成像系统，包括光源、第一聚焦透镜、第一针孔、准直透镜、激发滤光片、双色镜、二维扫描器、扫描镜、管镜、物镜、成像样品、发射滤光片、第二聚焦透镜、第二针孔、探测器及图像处理器；其中，光源投射出模式交替的激发光，由图像处理器获取探测器接收到的荧光信号，并利用预设的成像算法，计算得到成像样品对应的高分辨率图像数据。该系统可以适用于活细胞动态成像。

Description

高分辨率显微成像系统
技术领域
本发明涉及光学显微成像领域，尤其涉及一种高分辨率显微成像系统。
背景技术
目前，远场光学显微镜已经成为生命科学领域广泛应用的重要工具，但由于光学衍射极限的限制，一般可见光成像最高分辨率仅能达到约200nm，而生命科学的发展对光学成像系统及其分辨率提出了越来越高的要求，迫切需要超衍射极限分辨率的显微成像新技术。
在现有技术中，有人提出并验证了一种新的突破衍射极限显微成像方法--STED(Stimulated Emission Depletion，激发射耗尽显微技术)。该技术利用聚焦的实心激发光使基态粒子跃迁到激发态，随后聚焦的空心的STED光照射样品，引起受激发射，消耗了荧光态上的粒子，通过光谱滤波技术滤除受激发射光波，记录空心区域粒子发射的荧光信号，空心区域小于衍射极限，实现突破衍射极限，空心区域越小，分辨率越高。理论上该方法的空间分辨率可以无限小，但空心的STED光功率高，对生物样品损伤较大，特别是活细胞，因此，不适合活细胞动态成像。
发明内容
本申请提供了一种高分辨率显微成像系统，可以适用于活细胞动态成像。
具体的，上述系统包括光源、第一聚焦透镜、第一针孔、准直透镜、激发滤光片、双色镜、二维扫描器、扫描镜、管镜、物镜、成像样品、发射滤光片、第二聚焦透镜、第二针孔、探测器及图像处理器；
所述光源用于投射出模式交替的激发光，所述激发光依次穿过所述第一聚焦透镜、所述第一针孔及所述准直透镜后形成平行光；
所述平行光穿过所述激发滤光片后，照射于所述双色镜，由所述双色镜透射出透射激发光，以及反射出荧光信号；
所述透射激发光依次穿过所述二维扫描器、所述扫描镜、所述管镜、所述物镜后，汇聚到所述成像样品；
所述荧光信号依次穿过所述发射滤光片、所述第二聚焦透镜及所述第二针孔后，由所述探测器接收；
所述图像处理器获取所述探测器接收到的荧光信号，并利用预设的成像算法，计算得到所述成像样品对应的高分辨率图像数据。
可选地，所述图像处理器具体用于：
利用以下公式计算所述成像样品对应的高分辨率图像数据：
ΔIn＝I2n-1-γI2n，n＝N/2
其中，ΔIn表示所述成像样品对应的第n个高分辨率图像数据，I2n-1表示探测器接收到的第2n-1个荧光信号，I2n表示探测器接收到的第2n个荧光信号，γ表示预设的修正系数，N表示探测器接收到的荧光信号的数量。
可选地，所述探测器接收所述荧光信号的频率与所述光源的模式交替频率同步。
可选地，所述第一针孔与所述第二针孔之间成物象共轭关系。
可选地，所述光源为单脉冲交替输出光源或脉冲串交替输出光源。
可选地，所述单脉冲交替输出光源包括脉冲光源、半波片、第一偏振棱镜、第二偏振棱镜、涡旋相位片及位移台，所述位移台中设置有第一反射镜与第二反射镜；
所述脉冲光源用于投射出脉冲光，所述脉冲光依次经过所述半波片与所述第一偏振棱镜之后分为透射脉冲光与反射脉冲光；
所述透射脉冲光穿过所述第二偏振棱镜后透射出第一脉冲光；
所述反射脉冲光穿过所述涡旋相位片后进入所述位移台，经所述移动台中的所述第一反射镜与所述第二反射镜反射之后投射至所述第二偏振棱镜，并由所述第二偏振棱镜反射后输出第二脉冲光，其中，所述第一脉冲光与所述第二脉冲光的光轴位于同一直线上。
可选地，所述半波片用于调整所述脉冲光的偏振方向，所述涡旋相位片用于对所述反射脉冲光进行相位涡旋调制，使所述反射脉冲光聚焦为空心光，所述第一反射镜与所述第二反射镜用于调整所述反射脉冲光的光程，以使所述第一脉冲光与所述第二脉冲光交替输出。
可选地，所述脉冲串交替输出光源包括脉冲光源、半波片、电光相位调制器、第一偏振棱镜、第二偏振棱镜、涡旋相位片及位移台，所述位移台中设置有第一反射镜与第二反射镜；
所述脉冲光源用于投射出脉冲光，所述脉冲光依次经过所述半波片、所述电光相位调制器及所述第一偏振棱镜之后分为透射脉冲光与反射脉冲光；
所述透射脉冲光穿过所述第二偏振棱镜后透射出第一脉冲光；
所述反射脉冲光穿过所述涡旋相位片后进入所述位移台，经所述移动台中的所述第一反射镜与所述第二反射镜反射之后投射至所述第二偏振棱镜，并由所述第二偏振棱镜反射后输出第二脉冲光，其中，所述第一脉冲光与所述第二脉冲光的光轴位于同一直线上。
可选地，所述半波片用于调整所述脉冲光的偏振方向，所述电光相位调制器用于根据接收到的电信号对所述脉冲光进行相位调制，所述涡旋相位片用于对所述反射脉冲光进行相位涡旋调制，使所述反射脉冲光聚焦为空心光，所述第一反射镜与所述第二反射镜用于调整所述反射脉冲光的光程，以使预设数量且连续的所述第一脉冲光与所述预设数量且连续的所述第二脉冲光交替输出。
本发明所提供的高分辨率显微成像系统，采用模式交替的激发光作为光源，并通过探测器来接收光源分束后生成的荧光信号，利用预设的成像算法，计算得到成像样品对应的高分辨率图像数据，从而重构出高分辨率图像，其中，由于汇聚在成像样品上的透射激发光作为一种空心光不需要引发受激发射，因此本发明中汇聚在成像样品上空心光能量很小；同时，本发明中的光源可以交替激发出空心光与实心光，并相应交替记录荧光信号，不需要单独利用实心光扫描获取一幅图像，再单独利用空心光扫描获取一幅图像，然后两幅图像相减，即两次扫描图像相减，因此本发明方法成像速度更快，时间同步性更好。综上，本发明所提供的系统能够适用于活细胞动态成像，且具有较好的成像性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中高分辨率显微成像系统的结构示意图；
图2a与图2b为本发明实施例中光源310投射出的激发光的脉冲示意图；
图3a与图3b为本发明实施例中探测器315接收荧光信号的时序示意图；
图4为本发明实施例中光源310的结构示意图；
图5为本发明实施例中光源310的另一结构示意图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，图1为图1为本发明实施例中高分辨率显微成像系统的结构示意图，本发明实施例中，上述系统包括光源301、第一聚焦透镜201、第一针孔303、准直透镜304、激发滤光片308、双色镜309、二维扫描器305、扫描镜306、管镜307、物镜310、成像样品311、发射滤光片312、第二聚焦透镜313、第二针孔314探测器315及图像处理器(图1中未示出)。
其中，光源310用于投射出模式交替的激发光，该激发光依次穿过第一聚焦透镜302、第一针孔303及准直透镜304后形成平行光；该平行光穿过激发滤光片308后，照射于双色镜309，由双色镜309透射出透射激发光，以及反射出荧光信号。
透射激发光依次穿过二维扫描器305、扫描镜306、管镜307、及物镜310后，汇聚到成像样品311；荧光信号依次穿过发射滤光片312、第二聚焦透镜313及第二针孔314后，由探测器315接收。
图像处理器获取探测器315接收到的荧光信号，并利用预设的成像算法，计算得到成像样品311对应的高分辨率图像数据。
其中，光源301为单脉冲交替输出光源或脉冲串交替输出光源。具体可参加图2a与图2b，图2a与图2b为本发明实施例中光源310投射出的激发光的脉冲示意图。
具体的，当光源301为单脉冲交替输出光源时，光源310投射出的激发光如图2a所示，由实心脉冲与空心脉冲交替排列输出；当光源301为脉冲串交替输出光源时，光源310投射出的激发光如图2b所示，由若干个实心脉冲串与若干个空心脉冲串交替排列。
具体的，二维扫描器305用于对透射激发光进行光线角度扫描，扫描镜306与管镜307用于对透射激发光进行扩束，激发滤光片308用于滤除透射激发光以外的光噪声，发射滤光片312用于滤除荧光信号中的光噪声。其中，第一针孔303与第二针孔314之间成物象共轭关系。
其中，探测器315接收荧光信号的频率与光源301的模式交替频率同步，即光源301的模式每切换一次，探测器315接收并记录一次荧光信号。
其中，图像处理器具体用于：
利用以下公式计算成像样品311对应的高分辨率图像数据：
ΔIn＝I2n-1-γI2n，n＝N/2
其中，ΔIn表示成像样品311对应的第n个高分辨率图像数据，I2n-1表示探测器315接收到的第2n-1个荧光信号，I2n表示探测器315接收到的第2n个荧光信号，γ表示预设的修正系数，N表示探测器315接收到的荧光信号的数量。
为了更好的理解本发明实施例，参照图3a与图3b，图3a与图3b为本发明实施例中探测器315接收荧光信号的时序图。其中，当光源301为单脉冲交替输出光源时，探测器315接收到荧光信号的时序图如图3a所示；当光源301为脉冲串交替输出光源时，探测器315接收到荧光信号的时序图如图3b所示。
本发明实施例所提供的高分辨率显微成像系统，采用模式交替的激发光作为光源，并通过探测器来接收光源分束后生成的荧光信号，利用预设的成像算法，计算得到成像样品对应的高分辨率图像数据，从而重构出高分辨率图像，其中，由于汇聚在成像样品上的透射激发光作为一种空心光不需要引发受激发射，因此本发明中汇聚在成像样品上空心光能量很小；同时，本发明中的光源可以交替激发出空心光与实心光，并相应交替记录荧光信号，不需要单独利用实心光扫描获取一幅图像，再单独利用空心光扫描获取一幅图像，然后两幅图像相减，即两次扫描图像相减，因此本发明方法成像速度更快，时间同步性更好。综上，本发明所提供的系统能够适用于活细胞动态成像，且具有较好的成像性能。
进一步地，参照图4，图4为本发明实施例中光源310的结构示意图，本发明实施例中，当光源301为单脉冲交替输出光源时，光源310包括脉冲光源101、半波片102、第一偏振棱镜103、第二偏振棱镜108、涡旋相位片104及位移台107，位移台107中设置有第一反射镜105与第二反射镜106。
其中，脉冲光源101用于投射出脉冲光，该脉冲光依次经过半波片102与第一偏振棱镜103之后分为透射脉冲光与反射脉冲光；透射脉冲光穿过第二偏振棱镜108后透射出第一脉冲光；反射脉冲光穿过涡旋相位片104后进入位移台107，经移动台107中的第一反射镜105与第二反射镜106反射之后投射至第二偏振棱镜108，并由第二偏振棱镜108反射后输出第二脉冲光，其中，第一脉冲光与第二脉冲光的光轴位于同一直线上。
其中，半波片102用于调整脉冲光的偏振方向，涡旋相位片104用于对反射脉冲光进行相位涡旋调制，使反射脉冲光聚焦为空心光，第一反射镜105与第二反射镜106用于调整反射脉冲光的光程，使得第一脉冲光与第二脉冲光交替输出。
具体的，光源101投射出脉冲光，半波片102旋转输出脉冲光的偏振方向，使经第一偏振棱镜103分开的透射脉冲光(P光)与反射脉冲光(S光)的强度相等，透射脉冲光从第二偏振棱镜108透射输出第一脉冲光，而涡旋相位片104将反射脉冲光进行相位涡旋调制后，使反射脉冲光经透镜汇聚形成聚焦的空心光，经移动台107中的第一反射镜105与第二反射镜106反射之后投射至第二偏振棱镜108，并由第二偏振棱镜108反射后输出第二脉冲光，通过调节位移台107使第一脉冲光与第二脉冲光中的光脉冲间隔相等，形成单脉冲光场模式交替输出。具体的，可参见图2a。
进一步地，参照图5，图5为本发明实施例中光源310的结构示意图，本发明实施例中，当光源301为脉冲串交替输出光源时，光源310包括脉冲光源101、半波片102、电光相位调制器109、第一偏振棱镜103、第二偏振棱镜108、涡旋相位片104及位移台107，位移台107中设置有第一反射镜105与第二反射镜106。
其中，脉冲光源101用于投射出脉冲光，该脉冲光依次经过半波片102、电光相位调制器109及第一偏振棱镜103之后分为透射脉冲光与反射脉冲光；透射脉冲光穿过第二偏振棱镜108后透射出第一脉冲光；反射脉冲光穿过涡旋相位片104后进入位移台107，经移动台107中的第一反射镜105与第二反射镜106反射之后投射至第二偏振棱镜108，并由第二偏振棱镜108反射后输出第二脉冲光，其中，第一脉冲光与第二脉冲光的光轴位于同一直线上。
其中，半波片102用于调整脉冲光的偏振方向，电光相位调制器109用于根据接收到的电信号对所述脉冲光进行相位调制，涡旋相位片104用于对反射脉冲光进行相位涡旋调制，使反射脉冲光聚焦为空心光，第一反射镜105与第二反射镜106用于调整反射脉冲光的光程，以使预设数量且连续的第一脉冲光与预设数量且连续的第二脉冲光交替输出。
具体的，光源101投射出脉冲光，半波片102旋转输出脉冲光的偏振方向，使脉冲光的偏振方向与电光相位调制器109的主轴平行；当电光相位调制器109不加电压时，脉冲光经过电光相位调制器109的偏振方向不改变，脉冲光透过第一偏振棱镜103后继续经第二偏振棱镜108透射输出，当电光相位调制器109加半波电压时，经过电光相位调制器109偏振方向改变90度。而涡旋相位片104将反射脉冲光进行相位涡旋调制后，使反射脉冲光经透镜汇聚形成聚焦的空心光，经移动台107中的第一反射镜105与第二反射镜106反射之后投射至第二偏振棱镜108，并由第二偏振棱镜108反射后输出第二脉冲光，通过调节位移台107使第一脉冲光与第二脉冲光中的光脉冲间隔相等，形成脉冲串交替输出，具体可参见图2b。
本发明实施例所提供的高分辨率显微成像系统，提供了一种单脉冲交替输出光源与脉冲串交替输出光源，可以实现聚焦的实心脉冲光和聚焦的空心脉冲光交替激发，利用上述光源，上述系统通过一次扫描即可完成共焦图像和调制图像的获取，无需二次扫描，而且聚焦在成像样品的空心光不需要产生受激发射，其能量远低于STED光的能量，以及该系统可以用于双光子荧光、二次谐波等非线性光学超分辨显微成像，适用于活细胞动态成像。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
以上为对本发明所提供的一种高分辨率显微成像系统的描述，对于本领域的技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种高分辨率显微成像系统，其特征在于，所述系统包括光源、第一聚焦透镜、第一针孔、准直透镜、激发滤光片、双色镜、二维扫描器、扫描镜、管镜、物镜、成像样品、发射滤光片、第二聚焦透镜、第二针孔、探测器及图像处理器；
所述光源用于投射出模式交替的激发光，所述激发光依次穿过所述第一聚焦透镜、所述第一针孔及所述准直透镜后形成平行光；
所述平行光穿过所述激发滤光片后，照射于所述双色镜，由所述双色镜透射出透射激发光，以及反射出荧光信号；
所述透射激发光依次穿过所述二维扫描器、所述扫描镜、所述管镜及所述物镜后，汇聚到所述成像样品；
所述荧光信号依次穿过所述发射滤光片、所述第二聚焦透镜及所述第二针孔后，由所述探测器接收；
所述图像处理器获取所述探测器接收到的荧光信号，并利用预设的成像算法，计算得到所述成像样品对应的高分辨率图像数据。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述图像处理器具体用于：
利用以下公式计算所述成像样品对应的高分辨率图像数据：
ΔIn＝I2n-1-γI2n，n＝N/2
其中，ΔIn表示所述成像样品对应的第n个高分辨率图像数据，I2n-1表示探测器接收到的第2n-1个荧光信号，I2n表示探测器接收到的第2n个荧光信号，γ表示预设的修正系数，N表示探测器接收到的荧光信号的数量。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述探测器接收所述荧光信号的频率与所述光源的模式交替频率同步。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一针孔与所述第二针孔之间成物象共轭关系。
5.如权利要求1至4任意一项所述的系统，其特征在于，所述光源为单脉冲交替输出光源或脉冲串交替输出光源。
6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述单脉冲交替输出光源包括脉冲光源、半波片、第一偏振棱镜、第二偏振棱镜、涡旋相位片及位移台，所述位移台中设置有第一反射镜与第二反射镜；
所述脉冲光源用于投射出脉冲光，所述脉冲光依次经过所述半波片与所述第一偏振棱镜之后分为透射脉冲光与反射脉冲光；
所述透射脉冲光穿过所述第二偏振棱镜后透射出第一脉冲光；
所述反射脉冲光穿过所述涡旋相位片后进入所述位移台，经所述移动台中的所述第一反射镜与所述第二反射镜反射之后投射至所述第二偏振棱镜，并由所述第二偏振棱镜反射后输出第二脉冲光，其中，所述第一脉冲光与所述第二脉冲光的光轴位于同一直线上。
7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述半波片用于调整所述脉冲光的偏振方向，所述涡旋相位片用于对所述反射脉冲光进行相位涡旋调制，使所述反射脉冲光聚焦为空心光，所述第一反射镜与所述第二反射镜用于调整所述反射脉冲光的光程，以使所述第一脉冲光与所述第二脉冲光交替输出。
8.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述脉冲串交替输出光源包括脉冲光源、半波片、电光相位调制器、第一偏振棱镜、第二偏振棱镜、涡旋相位片及位移台，所述位移台中设置有第一反射镜与第二反射镜；
所述脉冲光源用于投射出脉冲光，所述脉冲光依次经过所述半波片、所述电光相位调制器及所述第一偏振棱镜之后分为透射脉冲光与反射脉冲光；
所述透射脉冲光穿过所述第二偏振棱镜后透射出第一脉冲光；
所述反射脉冲光穿过所述涡旋相位片后进入所述位移台，经所述移动台中的所述第一反射镜与所述第二反射镜反射之后投射至所述第二偏振棱镜，并由所述第二偏振棱镜反射后输出第二脉冲光，其中，所述第一脉冲光与所述第二脉冲光的光轴位于同一直线上。
9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述半波片用于调整所述脉冲光的偏振方向，所述电光相位调制器用于根据接收到的电信号对所述脉冲光进行相位调制，所述涡旋相位片用于对所述反射脉冲光进行相位涡旋调制，使所述反射脉冲光聚焦为空心光，所述第一反射镜与所述第二反射镜用于调整所述反射脉冲光的光程，以使预设数量且连续的所述第一脉冲光与所述预设数量且连续的所述第二脉冲光交替输出。
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