CN102798622A - 一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于强度差分的三维超分辨显微方法，包括以下步骤：1)开启共焦成像模式，将第一光源发出的光束转换为第一线偏振光；2)将第一线偏振光投射到待测样品上；3)收集待测样品发出的信号光，得到第一信号光强I₁；4)切换为负共焦成像模式，将第二光源和第三光源发出的光束分别转换为第二线偏振光和第三线偏振光；5)将第二线偏振光和第三线偏振光经位相调制后分别转换为第一调制光束和第二调制光束；6)将第一调制光束和第二调制光束投射到待测样品上；7)收集待测样品发出的信号光，得到第二信号光强I₂；8)计算有效信号光强I，并得到超分辨图像。本发明还公开了一种基于强度差分的三维超分辨显微装置。

Description

一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置

技术领域

本发明属于光学显微领域，特别涉及一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置。

背景技术

常规光学显微镜的分辨率由于受到光学衍射极限的影响，一般很难小于200nm，因此无法对纳米量级的样品进行观测，从而限制了其在纳米技术和生物技术中的应用。

近年来，为了突破光学衍射极限的限制，研究人员们提出了多种超分辨显微方法，包括：

受激发射损耗显微术(STED：Stimulated Emission DepletionMicroscopy)：利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少荧光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；

结构光照明显微术(SIM：Structured Illumination Microscopy)：将多重相互衍射的光束照射到样品上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息，通过衍射放大作用，得到清晰的超分辨图像；

光激活定位显微术(PALM：Photoactivated localization Microscopy)：采用光敏蛋白质标记样品，并且用超低光强的激活光使得每次只有极少数的光敏蛋白质被敏化，因此只有极少数的光敏蛋白被激发发射荧光。记录单个荧光分子所发出的光子直至漂白并通过PSF数字化计算出中心位置。反复这一过程逐个获取样品上所有荧光分子的中心位置，最后叠加重构成一幅完整的图像；

以及随机光场重建显微术(STORM：Stochastic Optical ReconstructionMicroscopy)：与PALM基本原理类似，利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过PSF的数字化获得其中心位置。

以上几种方法均已被实验证明可以在远场实现超衍射极限的空间分辨率，但是各自都还存在着不足。STED和SIM对系统设备的要求很高，系统的造价非常昂贵；STORM和PALM的成像速度还比较慢，无法满足实时检测的需求。

发明内容

本发明提供了一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置，可以在远场实现超衍射极限的横向和轴向分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、信噪比好等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。

一种基于强度差分的三维超分辨显微方法，包括以下步骤：

1)控制第一光源处于开启状态，第二光源和第三光源处于关闭状态，所述第一光源发出的第一工作光束准直后转换为第一线偏振光；

2)将所述第一线偏振光进行光路偏转，偏转后的第一线偏振光经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，以实现对待测样品的扫描；

3)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I₁(x，y，z)，其中x，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；

4)控制第一光源处于关闭状态，第二光源和第三光源处于开启状态，所述第二光源和第三光源发出第二工作光束和第三工作光束分别准直后转换为第二线偏振光和第三线偏振光；

5)将所述第二线偏振光和第三线偏振光经位相调制后分别转换为第一调制光束和第二调制光束；

6)对所述第一调制光束和第二调制光束进行光路偏转，偏转后的第一调制光束和第二调制光束经聚焦和准直后转换为相应的圆偏振光投射到待测样品上，以实现对步骤3)中的扫描点的二次扫描；；

7)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第二信号光强I₂(x，y，z)，其中x，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；

8)根据公式I(x，y，z)＝I₁(x，y，z)-γI₂(x，y，z)计算有效信号光强I(x，y，z)，并利用I(x，y，z)得到超分辨图像。

当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑经样品表面反射的光束。

对所述第二线偏振光进行位相调制的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

对所述第三线偏振光进行位相调制的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，R为入射光束的剖面半径。

优选的所述第一光源与第二光源和第三光源之间的切换频率为对所述样品进行点扫描频率的两倍。在这种情况下，开启第一光源，完成对某一点的扫描并得到该点的第一信号光强后，关闭第一光源，并使第二光源和第三光源处于开启状态，重新对该点进行扫描并得到该点的第二信号光强，之后，重新开启第一光源对下一点进行扫描。

所述第一光源与第二光源和第三光源之间的切换频率也可与对所述样品进行帧扫描频率相等。此时，先在第一光源开启，第二光源和第三光源关闭的状态下，完成对样品上所有扫描点的扫描，之后关闭第一光源，开启第二光源和第三光源对样品上所有扫描点进行第二次扫描。

当有效信号光强值I(x，y，z)为负时，设置I(x，y，z)＝0，其中x，y，z为扫描点的三维坐标。

本发明还提供了一种基于强度差分的三维超分辨显微装置，包括，包括第一光源、第二光源、第三光源、承载待测样品的纳米位移台和将光线投射到所述待测样品的显微物镜，还包括：

位于所述第一光源的光路上的第一起偏器；

沿所述第二光源的光路依次布置的第二起偏器和第一位相调制器；

沿所述第三光源的光路依次布置的第三起偏器和第二位相调制器；

用于将所述第一光源、第二光源和第三光源的光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统；

依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；

用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上；

并设有控制所述第一光源、第二光源、第三光源、纳米位移台和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

当第一光源开启且第二光源和第三光源关闭时，整个系统处于共焦成像模式；当第一光源关闭且第二光源和第三光源开启时，系统处于负共焦成像模式。

所述的第一光源、第二光源和第三光源优选的为激光器，即为与所述第一光源、第二光源和第三光源相对应的第一激光器、第二激光器和第三激光器。

所述第一激光器、第二激光器和第三激光器与相应的起偏器之间依次设有分别用于对工作光束进行滤波和准直的单模光纤和准直透镜。

设有用于将所述第二位相调制器出射的第二调制光束转折90°的反射镜。

设有用于将所述第一位相调制器出射的第一调制光束转折90°的第二分束镜，所述反射镜出射的光束透过所述第二分束镜，且所述第二分束镜为偏振分光棱镜。

设有用于将所述第一起偏器出射的第一偏振光转折90°的第一分束镜，所述反射镜和第二分束镜出射的光束透过所述第一分束镜，且所述第一分束镜为中性分光棱镜。

所述第一位相调制器和第二位相调制器为空间光调制器或位相板。

所述探测系统包括：

布置在所述第一分束镜和扫描振镜系统之间的第三分束镜，所述第三分束镜用于将所述扫描振镜系统出射的信号光转折90°，所述第三分束镜在待测样品为荧光样品时应选用二色镜，当待测样品为非荧光样品时应选用中性分光棱镜；

用于滤去第三分束镜出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非荧光样品时可以省略；

用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；

用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径。

所述第一位相调制器的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

所述第二位相调制器的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，R为入射光束的剖面半径。

所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

本发明的基于强度差分的三维超分辨显微装置工作步骤如下：

(1)利用控制器控制第一激光器，第二激光器和第三激光器的启动和关闭，使显微系统分别工作在共焦成像模式和负共焦成像模式；当处于共焦成像模式时，第一激光器开启，第二激光器和第三激光器关闭；当处于负共焦成像模式时，第一激光器关闭，第二激光器和第三激光器开启；

(2)在共焦成像模式中，由第一激光器出射的第一工作光束经第一单模光纤和第一准直透镜进行滤波准直；准直后的第一工作光束经过第一起偏器作用转换为线偏振光，之后被第一分束镜反射；由第一分束镜反射的第一工作光束透过第三分束镜，之后入射到扫描振镜系统之中；由扫描振镜系统出射的第一工作光束依次经过扫描透镜聚焦和场镜准直之后，通过1/4波片转换为圆偏振光；转换得到的圆偏振光束经显微物镜投射到位于纳米位移台上的待测样品之上，形成实心照明光斑；由待测样品出射的信号光被显微物镜收集，之后依次通过1/4波片，场镜，扫描透镜和扫描振镜系统，最后被第三分束镜反射；经第三分束镜反射的信号光束，通过带通滤波片滤去其中的杂散光后由聚焦透镜聚焦；经聚焦透镜聚焦后的信号光束通过空间滤波器进行空间滤波，之后被探测器所收集，得到当前扫描点处的共焦信号光强I₁；通过调节扫描振镜系统和纳米位移台，实现对于待测样品的三维扫描，记录各扫描点处的共焦信号光强I₁(x，y，z)并生成相应的共焦图像，其中x，y，z为扫描点的三维坐标；

(3)切换为负共焦成像模式，由第二激光器出射的第二工作光束经第二单模光纤和第二准直透镜进行滤波准直；准直后的第二工作光束通过第二起偏器转换为线偏振光，之后通过第一位相调制器进行相位调制得到第一调制光束；所述第一调制光束被第二分束镜反射，之后依次透过第一分束镜和第三分束镜，入射到扫描振镜系统之中；由扫描振镜系统出射的第一调制光束依次经过扫描透镜聚焦和场镜准直之后，通过1/4波片转换为圆偏振光；转换得到的圆偏振光束经显微物镜投射到位于纳米位移台上的待测样品之上，形成横向空心照明光斑；

由第三激光器出射的第三工作光束经第三单模光纤和第三准直透镜进行滤波准直；准直后的第三工作光束通过第三起偏器转换为线偏振光，之后通过第二位相调制器进行相位调制得到第二调制光束；所述第二调制光束被反射镜反射，之后依次透过第二分束镜、第一分束镜和第三分束镜，入射到扫描振镜系统之中；由扫描振镜系统出射的第二调制光束依次经过扫描透镜聚焦和场镜准直之后，通过1/4波片转换为圆偏振光；转换得到的圆偏振光束经显微物镜投射到位于纳米位移台上的待测样品之上，形成轴向空心照明光斑；

所述横向空心照明光斑和所述轴向空心照明光斑在待测样品处光强叠加，形成三维空心照明光斑；由待测样品出射的信号光被显微物镜收集，之后依次通过1/4波片，场镜，扫描透镜和扫描振镜系统，最后被第三分束镜反射；经第三分束镜反射的信号光束，通过带通滤波片滤去其中的杂散光后由聚焦透镜聚焦；经聚焦透镜聚焦后的信号光束通过空间滤波器进行空间滤波，之后被探测器所收集，得到当前扫描点处的负共焦信号光强I₂；通过调节扫描振镜系统和纳米位移台，实现对于待测样品的三维扫描，记录各扫描点处的负共焦信号光强I₂(x，y，z)并生成相应的负共焦图像，其中x，y，z为扫描点的三维坐标；

(4)根据公式I(x，y，z)＝I₁(x，y，z)-γI₂(x，y，z)计算有效信号光强I(x，y，z)，并利用I(x，y，z)得到超分辨图像。

本发明原理如下：

由于光学系统衍射的影响，平行入射的照明光束经显微物镜聚焦之后，在待测样品上所成的光斑并非一个理想的点，而是一个具有一定体积的三维衍射斑。在该衍射斑照射范围内的样品均会发出相应的信号光。其中，只有由理想聚焦点处发出的是真正有效的信号光，而由三维衍射斑中其它位置所发出的光都被认为是杂散光。正是由于这一部分杂散光的存在，使得衍射斑范围内样品的细节无法被分辨，由此限制了显微系统的分辨率。因此，在一个显微系统中，如果可以抑制这部分杂散光的影响，那么衍射极限就可以被突破，该显微系统就能够实现超衍射极限的分辨率。

在本发明方法中，当显微系统工作在共焦成像模式时，第一工作光束未经相位调制，直接经显微物镜投射到样品上。此时，由德拜积分计算可得，第一工作光束在样品上所成光斑为一个实心光斑。该实心光斑的尺寸与常规光学显微术中所用照明光束聚焦所成衍射斑的尺寸相同。该实心光斑照射范围内的样品所发出的信号光均被探测器所收集，得到当前扫描点处的共焦信号光强I₁。

当显微系统工作在负共焦成像模式时，第二工作光束受到第一位相调制器的调制作用。第一位相调制器的相位调制函数为此时由德拜积分计算可得，调制后的第二工作光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个横向空心光斑。同时，第三工作光束受到第二位相调制器的调制作用。第二位相调制器的相位调制函数为

此时由德拜积分计算可得，调制后的第三工作光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个轴向空心光斑。该轴向空心光斑与第二工作光束聚焦所成的横向空心光斑在样品处光强叠加，形成一个三维空心光斑。该三维空心光斑照射范围内的样品所发出的信号光均被探测器所收集，得到当前扫描点处的负共焦信号光强I₂。

在负共焦模式中，照明光斑为三维空心光斑，此时探测器所收集到的信号I₂均是由理想聚焦点的周围位置所发出的杂散光。因此，通过将I₁和I₂进行强度差分，可以有效地抑制I₁中所包含的杂散光信号，从而提高显微系统的分辨率。换句话说，与常规光学显微方法相比，本发明通过强度差分使得所探测到的有效信号光所对应的发光范围大大减小，由此提高了对于细节的分辨能力。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)具有超衍射极限的横向及轴向分辨率；

(2)成像速度快，在每一帧图像的扫描点数为512×512的情况下，帧频可达到每秒15帧以上；

(3)装置简单，操作方便。

附图说明

图1为本发明一种基于强度差分的三维超分辨显微装置的示意图；

图2为本发明共焦成像模式中所成实心光斑的横向归一化光强分布曲线；

图3为本发明共焦成像模式中所成实心光斑的轴向归一化光强分布曲线；

图4为本发明负共焦成像模式中所成三维空心光斑的横向归一化光强分布曲线；

图5为本发明负共焦成像模式中所成三维空心光斑的轴向归一化光强分布曲线；

图6为本发明中有效信号光光斑与常规光学显微术中信号光光斑的横向归一化光强分布比较曲线；

图7为本发明中有效信号光光斑与常规光学显微术中信号光光斑的轴向归一化光强分布比较曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，一种基于强度差分的三维超分辨显微装置，包括：第一激光器1，第一单模光纤2，第一准直透镜3，第一起偏器4，第二激光器5，第二单模光纤6，第二准直透镜7，第二起偏器8，第一位相调制器9，第三激光器10，第三单模光纤11，第三准直透镜12，第三起偏器13，第二位相调制器14，反射镜15，第一分束镜16，第二分束镜17，第三分束镜18，扫描振镜系统19，扫描透镜20，场镜21，1/4波片22，显微物镜23，纳米位移台24，带通滤波片25，聚焦透镜26，针孔27，探测器28，控制器29。

其中，第一单模光纤2、第一准直透镜3、第一起偏器4依次位于第一激光器1出射光束的光轴之上。

其中，第二单模光纤6、第二准直透镜7、第二起偏器8、第一位相调制器9依次位于第二激光器5出射光束的光轴之上；所述第二起偏器8的透光轴方向与水平方向垂直；所述第一位相调制器9的相位调制函数为

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

其中，第三单模光纤11、第三准直透镜12、第三起偏器13、第二位相调制器14、反射镜15依次位于第三激光器10出射光束的光轴之上；所述第三起偏器13的透光轴方向与水平方向平行；所述第二位相调制器14的相位调制函数为

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，R为入射光束的剖面半径。

其中，第二分束镜17、第一分束镜16、第三分束镜18、扫描振镜系统19依次位于反射镜15反射光束的光轴之上。

其中，扫描透镜20、场镜21、1/4波片22、显微物镜23、纳米位移台24依次位于扫描振镜系统19出射光束的光轴之上；所述纳米位移台24位于显微物镜23的焦平面附近。

其中，带通滤波片25，聚焦透镜26，针孔27，探测器28依次位于第三分束镜18反射光束的光轴之上；所述针孔27位于聚焦透镜26的焦平面处。

其中，控制器29分别与第一激光器1、第二激光器5、第三激光器10、扫描振镜系统19以及纳米位移台24相连，用于控制显微系统成像模式的切换、扫描振镜系统19的横向扫描以及纳米位移台24的轴向扫描；显微系统成像模式的切换频率设置为扫描振镜系统的点扫描频率的两倍。

上述装置中，显微物镜23的数值孔径NA＝1.4；所用针孔27的直径为0.73个艾里斑直径，探测器28为雪崩光电二极管(APD)。

采用图1所示的装置进行基于强度差分的三维超分辨显微的方法如下：

利用控制器29启动第一激光器1，同时关闭第二激光器5和第三激光器10，使显微系统工作在共焦成像模式。

从第一激光器1发出的第一工作光束，首先被导入第一单模光纤2，从第一单模光纤2出射的激光光束，经过第一准直透镜3完成准直。经过准直后的第一工作光束入射到第一起偏器4转换为线偏振光，之后被第一分束镜16反射。

由第一分束镜16反射的第一工作光束透过第三分束镜18，入射到扫描振镜系统19上。经扫描振镜系统19出射的第一工作光束依次被扫描透镜20聚焦、场镜21准直，之后通过1/4波片22转换为圆偏振光。圆偏振的第一工作光束经显微物镜23投射到位于纳米位移台24上的待测样品之上。

所述第一工作光束在显微物镜23的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

$\stackrel{\→}{E}(r_2,{\mathrm{\φ}}_2,z_2)=\mathrm{iC}{\∫\∫}_{\mathrm{\Ω}}\sin \left(\mathrm{\θ}\right)\·A_1(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·A_2(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]\·e^{\mathrm{ikn}(z_2\cos \mathrm{\θ}+r_2\sin \mathrm{\θ}\cos (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_2))}\mathrm{d\θd\φ}$

式中，是以显微物镜23的焦点位置为原点的柱坐标系，

代表了

处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，

为光束垂直z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，

是入射光的振幅分布，

表征了显微物镜23的结构参数，

则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

由上式计算可以发现，此时第一工作光束经显微物镜23聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个三维实心光斑，其横向归一化光强分布曲线如图2所示，轴向归一化光强分布曲线如图3所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜23收集，之后依次通过1/4波片22、场镜21、扫描透镜20、扫描振镜系统19，最后被第三分束镜18反射。经分束镜18反射的信号光束通过带通滤波片25滤去杂散光，之后经聚焦透镜26聚焦并通过针孔27进行空间滤波，最终被探测器28所探测。记此时探测器28探测得到的信号光强值为I₁(x，y，z)，将其作为在当前扫描点处的共焦信号光强。

利用控制器29关闭第一激光器1，同时启动第二激光器5和第三激光器10，使显微系统工作在负共焦成像模式。

从第二激光器5发出的第二工作光束，首先被导入第二单模光纤6，从第二单模光纤6出射的激光光束，经过第二准直透镜7完成准直。经过准直后的第二工作光束入射到第二起偏器8转换为线偏振光，之后入射到第一位相调制器9上进行相位调制并得到第一调制光束。

第一位相调制器9的相位调制函数为

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

此时，经第一位相调制器9进行相位调制之后，第一调制光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，

为入射到第一位相调制器9上的第二工作光束在

处的电矢量强度，为经过第一位相调制器9相位调制后的第一调制光束在

处的电矢量强度，i为虚数单位。

由第一位相调制器9出射的第一调制光束被第二分束镜17反射，之后依次透过第一分束镜16和第三分束镜18，入射到扫描振镜系统19上。经扫描振镜系统19出射的第一调制光束依次被扫描透镜20聚焦、场镜21准直，之后通过1/4波片22转换为圆偏振光并通过显微物镜23投射到位于纳米位移台24上的待测样品之上。

所述第一调制光束在显微物镜23的焦点附近所成的光场分布同样可由德拜积分确定。通过计算可以发现，此时第一调制光束经显微物镜23聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个横向空心光斑。

从第三激光器10发出的第三工作光束，首先被导入第三单模光纤11，从第三单模光纤11出射的激光光束，经过第三准直透镜12完成准直。经过准直后的第三工作光束入射到第三起偏器13转换为线偏振光，之后入射到第二位相调制器14上进行相位调制并得到第二调制光束。

第二位相调制器14的相位调制函数为

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，R为入射光束的剖面半径。

此时，经第二位相调制器14进行相位调制之后，第二调制光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，

为入射到第二位相调制器14上的第三工作光束在

处的电矢量强度，

为经过第二位相调制器14相位调制后的第二调制光束在

处的电矢量强度，i为虚数单位。

由第二位相调制器14出射的第二调制光束被反射镜15反射，之后依次透过第二分束镜17、第一分束镜16和第三分束镜18，入射到扫描振镜系统19上。经扫描振镜系统19出射的第二调制光束依次被扫描透镜20聚焦、场镜21准直，之后通过1/4波片22转换为圆偏振光并通过显微物镜23投射到位于纳米位移台24上的待测样品之上。

所述第二调制光束在显微物镜23的焦点附近所成的光场分布同样可由德拜积分确定。通过计算可以发现，此时第二调制光束经显微物镜23聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个轴向空心光斑。

第三工作光束在样品上所形成的轴向空心光斑和第二工作光束在样品上所形成的横向空心光斑通过光强叠加，最终形成一个三维空心照明光斑，其横向归一化光强分布曲线如图4所示，轴向归一化光强分布曲线如图5所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜23收集，之后依次通过1/4波片22、场镜21、扫描透镜20、扫描振镜系统19，最后被第三分束镜18反射。经分束镜18反射的信号光束通过带通滤波片25滤去杂散光，之后经聚焦透镜26聚焦并通过针孔27进行空间滤波，最终被探测器28所探测。记此时探测器28探测得到的信号光强值为I₂(x，y，z)，将其作为在当前扫描点处的负共焦信号光强。

通过控制器29调节扫描振镜系统19和纳米位移台24，并重复上述过程，实现对于待测样品的三维扫描，记录各扫描点处的共焦信号光强I₁(x，y，z)和负共焦信号光强I₂(x，y，z)，其中x，y，z为扫描点的三维坐标。

利用公式I(x，y，z)＝I₁(x，y，z)-γI₂(x，y，z)计算各扫描点处的有效信号光强I(x，y，z)，并最终得到超分辨显微图像。

本发明中有效信号光光斑与常规共聚焦显微方法中信号光光斑的横向归一化光强分布曲线比较如图6所示，相应的轴向归一化光强分布曲线比较如图7所示。由图6和图7可以看出，本发明中有效信号光光斑的横向尺寸和轴向尺寸(以光强分布曲线的半高全宽值来衡量)较常规共聚焦显微方法均有所减小，此时由理想聚焦点周围位置所发出的杂散光受到了抑制，因此本发明方法可以在三维尺度上实现超衍射极限的分辨率。

Claims (10)

1.一种基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)控制第一光源处于开启状态，第二光源和第三光源处于关闭状态，所述第一光源发出的第一工作光束准直后转换为第一线偏振光；

2)将所述第一线偏振光进行光路偏转，偏转后的第一线偏振光经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，以实现对待测样品的扫描；

3)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I₁(x，y，z)，其中x，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；

4)控制第一光源处于关闭状态，第二光源和第三光源处于开启状态，所述第二光源和第三光源发出第二工作光束和第三工作光束分别准直后转换为第二线偏振光和第三线偏振光；

5)将所述第二线偏振光和第三线偏振光经位相调制后分别转换为第一调制光束和第二调制光束；

6)对所述第一调制光束和第二调制光束进行光路偏转，偏转后的第一调制光束和第二调制光束经聚焦和准直后转换为相应的圆偏振光投射到待测样品上，以实现对步骤3)中的扫描点的二次扫描；

7)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第二信号光强I₂(x，y，z)，其中x，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；

8)根据公式I(x，y，z)＝I₁(x，y，z)-γI₂(x，y，z)计算有效信号光强I(x，y，z)，并利用I(x，y，z)得到超分辨图像。

2.如权利要求1所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，对所述第二线偏振光进行位相调制的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

3.如权利要求1所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，对所述第三线偏振光进行位相调制的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，R为入射光束的剖面半径。

4.如权利要求3所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，所述第一光源与第二光源和第三光源之间的切换频率为对所述样品进行点扫描频率的两倍。

5.如权利要求3所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，所述第一光源与第二光源和第三光源之间的切换频率与对所述样品进行帧扫描频率相等。

6.如权利要求1所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，当有效信号光强值I(x，y，z)为负时，设置I(x，y，z)＝0，其中x，y，z为扫描点的三维坐标。

7.一种基于强度差分的三维超分辨显微装置，包括，包括第一光源、第二光源、第三光源、承载待测样品的纳米位移台和将光线投射到所述待测样品的显微物镜，其特征在于，还包括：

位于所述第一光源的光路上的第一起偏器；

沿所述第二光源的光路依次布置的第二起偏器和第一位相调制器；

沿所述第三光源的光路依次布置的第三起偏器和第二位相调制器；

用于将所述第一光源、第二光源和第三光源的光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统；

依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；

用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上；

并设有控制所述第一光源、第二光源、第二光源、纳米位移台和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

8.如权利要求7所述的基于强度差分的三维超分辨显微装置，其特征在于，所述第一位相调制器的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

9.如权利要求7所述的基于强度差分的三维超分辨显微装置，其特征在于，所述第二位相调制器的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，R为入射光束的剖面半径。

10.如权利要求7所述的基于强度差分的三维超分辨显微装置，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

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