CN112326609A - 基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置 - Google Patents

基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置，该方法将入射激光分成三路，光束二和光束三的光偏振态相同，光束一的光偏振态与光束二、光束三的光偏振态垂直；光束先分束，后合束，并投射到样品上；光束一在样品某点上形成的三维光场分布反射后再经显微物镜、光束整形元件、扫描镜、偏振元件在探测器一上形成物点的共焦像；光束二和光束三在物点上形成的三维光场分布反射后再经显微物镜、光束整形元件、扫描镜、偏振元件在探测器二上同时、并行形成物点的负共焦像；将共焦像减去附带一定权重的负共焦像即为超分辨点像，即完成一次扫描即可获得某一深度的二维图像；通过对样品不同深度进行扫描，即可建立三维超分辨图像。

Description

基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置
技术领域
本发明涉及超分辨成像技术领域，尤其涉及一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置。
背景技术
超分辨显微术是近二十年来成像与传感领域的热点课题，它为分子、细胞、纳米粒子等微观成像提供了基本工具。其目标是通过压缩成像系统的点扩散函数达到打破衍射受限分辨率的目的。高速三维超分辨显微术使得对细胞和纳米粒子的动态时空特性进行监测成为可能。人们已提出了数种近场和远场超分辨成像技术，其中远场超分辨技术包括受激辐射损耗显微术(stimulated emission depletion(STED)microscopy)、随机光学重构显微术(stochastic optical reconstruction microscopy(STORM))、光激活定位显微术(photoactivated localization microscopy(PALM))、结构光显微术(structuredillumination microscopy(SIM))等。基于深度学习的图像处理技术也能实现超分辨。
在这些技术当中，随机光学重构显微术和光激活定位显微术需要获取和处理大量原始图像才能得到一幅超分辨图像，通常要3秒钟以上。结构光显微术是一种有效的宽场超分辨显微技术，但通常也要获取9幅原始图像。受激辐射损耗显微术需要用两束波长不同的激光同时照明，而且其中一个光源是昂贵的飞秒激光器，其波长对应特定的标记蛋白的光谱性质。总的来说，这些技术还不适合低成本、快速超分辨成像与传感。
最近荧光发射差分显微术(fluorescence emission difference(FED)microscopy)被用于超分辨成像，其打破衍射受限分辨率的方法是从共焦点扩散函数中减去环状空心点扩散函数，结果是一个比共焦点扩散函数涵盖的区域更小的点像。在有的文献中，这个环状空心点扩散函数也被称为负共焦点像。相应地，通过二维横向扫描，最终图像为共焦点扩散函数图像减去环状空心点扩散函数图像。环状空心点扩散函数可以通过螺旋形位相分布的傅里叶变换实现。这一方法可以从二维延伸到三维。这时轴向的环状空心点扩散函数可以通过一个二值位相分布的傅里叶变换实现，这个二值位相元件在中心区域的位相为π弧度，其它区域为0。轴向环状空心点扩散函数与横向环状空心点扩散函数非相干叠加，产生一个三维环状空心点扩散函数。从三维共焦点扩散函数中减去这个三维环状空心点扩散函数即可实现三维超分辨。但是现有的具有二维超分辨本领的荧光差分显微术为了得到一幅二维图像，需要扫描某一深度的样品两次，分别得到样品的共焦图像和样品的基于环状空心点扩散函数图像；现有的具有三维超分辨本领的荧光差分显微术为了得到一幅二维图像，需要扫描某一深度的样品两次或三次，分别得到共焦图像和基于环状空心点扩散函数(横向与纵向)图像(CN 106970055 A，一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置；D.Zhu，et al，Compact three-dimensional super-resolution system based onfluorescence emission difference microscopy”，Opt.Commun.405，157-163(2017))。每次扫描需要2秒以上，这对较快动态变化的样品不适用。共焦与负共焦图像之间的延迟将导致动态信息的不匹配或丢失。
综上所述，现有的荧光差分超分辨显微术，不管具有二维超分辨本领或者三维超分辨本领，都不能通过单次聚焦获得某一物点的图像所对应的完整信息，都不能通过单次二维扫描获得某一面上物点的图像所对应的完整信息，都不能通过单次三维扫描获得某一立体内物点的图像所对应的完整信息。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置，具体技术方案如下：
一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法，该方法具体包括如下步骤：
S1：将入射激光分成三路，即光束一、光束二和光束三，其中，所述的光束二和光束三的光偏振态相同，所述的光束一的光偏振态与所述的光束二、光束三的光偏振态垂直；
S2：使所述的光束二经过0-2π涡旋相位元件、所述的光束三经过π-0二值相位元件后，再将三束光合束，并投射到样品上进行成像；
S3：所述的光束一在样品某点上形成的三维光场分布反射后再经显微物镜、光束整形元件、扫描镜、偏振元件在探测器一上形成物点的共焦像；所述的光束二和光束三在物点上形成的三维光场分布反射后再经所述的显微物镜、所述的光束整形元件、所述的扫描镜、所述的偏振元件在探测器二上同时、并行形成物点的环状空心点扩散函数所对应的像，也被称为负共焦像；
S4：收集所述的共焦像和负共焦像，将所述的共焦像减去附带一定权重的负共焦像即为超分辨点像，即完成一次扫描即可获得某一深度的二维图像；
S5：通过对样品不同深度进行扫描，即可建立三维超分辨图像。
一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像装置，该装置包括依次设置的激光器、准直器、偏振器、第一半波片、第一偏振分光镜，在所述的第一偏振分光镜的透射光路上依次布置第二半波片、第一反射镜，在所述的第一偏振分光镜的反射光路上依次布置第一分光镜、第二反射镜，在所述的第一分光镜的反射光路上依次布置涡旋相位板、第二偏振分光镜，在所述的第二反射镜的反射光路上依次布置π-0二值相位板、第二分光镜，且所述的第二偏振分光镜、第二分光镜也依次位于所述的第一反射镜的反射光路上；
所述的激光器发射的光经过上述元件后先被分为三路，再经过所述的第二偏振分光镜、所述的第二分光镜合束后，在合束的光路上布置双色镜，所述的双色镜的反射光经过X轴扫描镜反射后，再被Y轴扫描镜反射，然后依次经过扫描透镜、场镜、物镜后照射在样品上，从而使光透射在样品上成像；
在所述的双色镜的透射光路上布置第三偏振分光镜，在所述的第三偏振分光镜的透射光路上依次布置第一透镜、第一探测器，在所述的第三偏振分光镜的反射光路上依次布置第二透镜、第二探测器；光束在样品上反射后的光再依次经过所述的物镜、场镜、扫描透镜、Y轴扫描镜、X轴扫描镜、双色镜后，在所述的第一探测器上形成物点的共焦像，在所述的第二探测器上形成物点的负共焦像。
进一步地，所述的物镜为变焦物镜。
进一步地，在所述的第一偏振分光镜和第一分光镜之间布置第三半波片。
进一步地，在所述的涡旋相位板、第二偏振分光镜之间布置第四半波片。
进一步地，在所述的π-0相位板、第二分光镜之间布置第五半波片。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置，能通过单次聚焦获得某一物点的具有三维超分辨本领的图像所对应的完整信息，能通过单次二维扫描获得某一面上物点的具有三维超分辨本领的图像所对应的完整信息，能通过单次三维扫描获得某一立体内物点的具有三维超分辨本领的图像所对应的完整信息，实现快速成像。本发明的方法还具有潜在的能量效率高、结构紧凑、体积小、不受空间光调制器帧速限制等有利因素。
附图说明
图1是本发明的基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像装置的其中一种实施方式的结构示意图；
图2为本发明的成像装置的另一种实施方式的结构示意图；
其中，1，激光器；2，准直器；3，偏振器；4，第一半波片；5，第一偏振分光镜；6，第二半波片；7，第一反射镜；8，第一分光镜；9，涡旋相位板；10，第二偏振分光镜；11，第二反射镜；12，π-0相位板；13，第二分光镜；14，双色镜；15，x轴扫描镜；16，y轴扫描镜；17，扫描透镜；18，场镜；19，物镜；20，样品；21，第三偏振分光镜；22，第一透镜；23，第一探测器；24，第二透镜；25，第二探测器；26，计算机；27，第三半波片；28，第四半波片；29，第五半波片。
具体实施方式
下面根据附图和优选实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明白。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本发明的基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像装置，包括激光器1、准直器2、偏振器3、第一半波片4、第一偏振分光镜5，在所述的第一偏振分光镜5的透射光路上依次布置第二半波片6、第一反射镜7，在所述的第一偏振分光镜5的反射光路上依次布置第一分光镜8、第二反射镜11，在所述的第一分光镜8的反射光路上依次布置涡旋相位板9、第二偏振分光镜10，在所述的第二反射镜11的反射光路上依次布置π-0二值相位板12、第二分光镜13，且所述的第二偏振分光镜10、第二分光镜13也依次位于所述的第一反射镜7的反射光路上；
所述的激光器1发射的光经过上述元件后先被分为三路，其中，所述的光束二和光束三的光偏振态相同，所述的光束一的光偏振态与所述的光束二、光束三的光偏振态垂直，再经过所述的第二偏振分光镜10、所述的第二分光镜13合束后，在合束的光路上布置双色镜14，所述的双色镜14的反射光经过X轴扫描镜15反射后，再被Y轴扫描镜16反射，然后依次经过扫描透镜17、场镜18、物镜19后照射在样品20上，从而使光透射在样品20上成像；
在所述的双色镜14的透射光路上布置第三偏振分光镜21，在所述的第三偏振分光镜21的透射光路上依次布置第一透镜22、第一探测器23，在所述的第三偏振分光镜21的反射光路上依次布置第二透镜24、第二探测器25；光束在样品上反射后的光再依次经过所述的物镜19、场镜18、扫描透镜17、Y轴扫描镜16、X轴扫描镜15、双色镜14后，在所述的第一探测器23上形成物点的共焦像，在所述的第二探测器25上形成物点的环状空心点扩散函数所对应的像，即负共焦像。
通过计算机26收集所述的共焦像和负共焦像，将所述的共焦像减去附带一定权重的负共焦像即为超分辨点像，即完成一次扫描即可获得某一深度的二维图像；通过对样品不同深度进行扫描，即可建立三维超分辨图像。
为了提高扫描速度，消除传统的机械扫描对样品带来的干扰，上述装置中所述的物镜优选为变焦物镜。
如图2所示，为了调节每一路的光强，因此，在所述的第一偏振分光镜5和第一分光镜8之间布置第三半波片27，在所述的涡旋相位板9、第二偏振分光镜10之间布置第四半波片28，在所述的π-0相位板12、第二分光镜13之间布置第五半波片29。
本领域普通技术人员可以理解，以上所述仅为发明的优选实例而已，并不用于限制发明，尽管参照前述实例对发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在发明的精神和原则之内，所做的修改、等同替换等均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
S1：将入射激光分成三路，即光束一、光束二和光束三，其中，所述的光束二和光束三的光偏振态相同，所述的光束一的光偏振态与所述的光束二、光束三的光偏振态垂直；
S2：使所述的光束二经过0-2π涡旋相位元件、所述的光束三经过π-0二值相位元件后，再将三束光合束，并投射到样品上进行成像；
S3：所述的光束一在样品某点上形成的三维光场分布反射后再经显微物镜、光束整形元件、扫描镜、偏振元件在探测器一上形成物点的共焦像；所述的光束二和光束三在物点上形成的三维光场分布反射后再经所述的显微物镜、所述的光束整形元件、所述的扫描镜、所述的偏振元件在探测器二上同时、并行形成物点的环状空心点扩散函数所对应的像，也被称为负共焦像；
S4：收集所述的共焦像和负共焦像，将所述的共焦像减去附带一定权重的负共焦像即为超分辨点像，即完成一次扫描即可获得某一深度的二维图像；
S5：通过对样品不同深度进行扫描，即可建立三维超分辨图像。
2.一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像装置，其特征在于，该装置包括依次设置的激光器(1)、准直器(2)、偏振器(3)、第一半波片(4)、第一偏振分光镜(5)，在所述的第一偏振分光镜(5)的透射光路上依次布置第二半波片(6)、第一反射镜(7)，在所述的第一偏振分光镜(5)的反射光路上依次布置第一分光镜(8)、第二反射镜(11)，在所述的第一分光镜(8)的反射光路上依次布置涡旋相位板(9)、第二偏振分光镜(10)，在所述的第二反射镜(11)的反射光路上依次布置π-0二值相位板(12)、第二分光镜(13)，且所述的第二偏振分光镜(10)、第二分光镜(13)也依次位于所述的第一反射镜(7)的反射光路上；
所述的激光器(1)发射的光经过上述元件后先被分为三路，再经过所述的第二偏振分光镜(10)、所述的第二分光镜(13)合束后，在合束的光路上布置双色镜(14)，所述的双色镜(14)的反射光经过X轴扫描镜(15)反射后，再被Y轴扫描镜(16)反射，然后依次经过扫描透镜(17)、场镜(18)、物镜(19)后照射在样品上，从而使光透射在样品上成像；
在所述的双色镜(14)的透射光路上布置第三偏振分光镜(21)，在所述的第三偏振分光镜(21)的透射光路上依次布置第一透镜(22)、第一探测器(23)，在所述的第三偏振分光镜(21)的反射光路上依次布置第二透镜(24)、第二探测器(25)；光束在样品上反射后的光再依次经过所述的物镜(19)、场镜(18)、扫描透镜(17)、Y轴扫描镜(16)、X轴扫描镜(15)、双色镜(14)后，在所述的第一探测器(23)上形成物点的共焦像，在所述的第二探测器(25)上形成物点的负共焦像。
3.根据权利要求2所述的基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像装置，其特征在于，所述的物镜为变焦物镜。
4.根据权利要求2所述的基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像装置，其特征在于，在所述的第一偏振分光镜(5)和第一分光镜(8)之间布置第三半波片(27)。
5.根据权利要求2所述的基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像装置，其特征在于，在所述的涡旋相位板(9)、第二偏振分光镜(10)之间布置第四半波片(28)。
6.根据权利要求2所述的基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像装置，其特征在于，在所述的π-0相位板(12)、第二分光镜(13)之间布置第五半波片(29)。
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