CN101435774A - 双色单光子横向超分辨成像的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

一种双色单光子横向超分辨成像的方法和装置，该方法最大的特点是采用敏化光束和激发光束的重叠部分同时敏化和激发被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品，才能实现荧光激发。物镜收集荧光信号，经过敏化双色镜和激发双色镜以及陷波滤光片和长通滤光片，最后由聚焦透镜聚焦通过一个小孔光阑由雪崩二极管测量荧光强度，计算机记录荧光强度值，计算机关闭快门使可逆光敏荧光蛋白在敏化光照明下恢复到可激发态，计算机驱动三维平移台移动可逆光敏荧光蛋白标记的样品，实现三维扫描成像。本发明可提高超分辨荧光成像的横向分辨率1.55－2.81倍。

Description

双色单光子横向超分辨成像的方法和装置
技术领域
本发明与生物医学有关，涉及双色单光子荧光成像，特别是一种双色单光子横向超分辨成像的方法和装置，以适用于医学生物组织的检测。
背景技术
长期以来，远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤、可探测样品内部等优点，一直是生命科学中最常用的观测工具。但由于衍射极限的存在，使传统的宽场光学显微镜横向分辨率仅约为200nm。为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征，提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求。在远场荧光显微镜的基础上，科学家们已经发展出一些实用的提高分辨率甚至超越分辨率极限的成像技术。例如，采用横向结构光照明，提高横向分辨率到约100nm，这种技术需要复杂的解码处理，耗费时间。受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了30-50nm的三维分辨率。应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限，但这些技术往往需要非常苛刻的条件和昂贵的设备，过程也十分复杂。
近年来，光敏荧光蛋白作为一类新的荧光探针分子吸引了科研工作者们的广泛关注，这类荧光蛋白与普通荧光蛋白最大的不同之处是：通过一束特定波长的光敏化之后，才能够被激发发射荧光，或者极大地增强原有的荧光，直至漂白。换言之，光敏荧光蛋白需要两种不同波长的光共同作用才能激发荧光(参见George H.Patterson et al.，Science，vol.297，1873-1877，2000)。如今，这种荧光分子被应用于细胞内物质追踪等领域的研究。在光敏荧光蛋白中，有一种非常特殊的荧光蛋白称为可逆光敏荧光蛋白，这种可逆敏化蛋白相对于一般光敏荧光蛋白的独特性质表现在：漂白之后可以通过一束恢复光使荧光蛋白重新恢复到可激发态。例如：Dronpa，KFP1(kindling fluorescent protein-1)(以上两种可逆荧光蛋白暂无中文名称，市场上有商品)等。以下具体以Dronpa为例，它在405nm光照射下敏化，488nm照射下激发荧光，进入暂时的漂白，接着再次用405nm光照射，Dronpa将再次从漂白中恢复，敏化-激发-漂白-恢复这一循环可重复达上百次(参见Ryoko Andoet al.，Science，vol.306，1370-1373，2004)。在敏化光光强不太大的情况下，荧光强度与敏化光强度近似呈线性关系(参见Peter Dedecker et al.，BiophysicalLetters，vol.91，45-47，2006)。不难发现，Dronpa的敏化激发过程虽然需要两种波长的光，但直接激发荧光的只是其中一种波长的光，即488nm激发光，因此实质上是一种双色单光子的线性过程，相对于双色双光子非线性吸收过程效率有极大的提高。另外由于Dronpa敏化前无法激发荧光，可以有效抑制敏化光和激发光非重叠区域的背景噪声，可反复激发的特性使得它可能用于扫描成像。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述现有技术对生物组织横向分辨率不足的问题，提供了一种双色单光子横向超分辨成像的方法和装置，该发明可提高生物组织中成像的横向分辨率。
本发明技术解决方案如下：
一种双色单光子横向超分辨成像的方法，其特点是采用两束激光分别作为敏化光和激发光，利用聚焦后两束光的点扩散函数重叠部分同时敏化和激发被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品，被激发的荧光信号通过陷波滤光片和长通滤光片过滤由聚焦透镜聚焦，经过一个小孔光阑滤除背景噪声被雪崩二极管收集，计算机记录荧光信号强度数值后关闭快门阻挡所述的激发光，使所述样品上的可逆荧光蛋白分子在敏化光的作用下恢复到可激发态，每测量完所述样品的一个测量点后，计算机驱动三维平移台移动所述的的样品至下一个待测量点，所述的快门在计算机的控制下再次打开，重复上述测量过程，计算机依次获取所述的样品的所有测量点的荧光信号强度值，然后由计算机根据所采集的所有测量点的荧光信号强度值按几何位置排列重构，获得所述的样品的三维图像。
在敏化光强度不太高的情况下，荧光强度与敏化光强呈线性关系。所述的激发光所产生的荧光与所述的敏化光强和激发光强的关系处于线性区。
一种双色单光子横向超分辨的成像装置，其特点在于该装置包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：
照明部分包括：敏化光源，沿该敏化光源输出的敏化光束方向依次是敏化衰减片、敏化准直系统和敏化双色镜，该敏化双色镜与所述敏化光源输出的敏化光束成45°放置；激发光源，沿该激发光源输出激发光束方向依次是快门、激发衰减片、激发准直系统和激发双色镜，该激发双色镜与所述激发光源输出的激发光束成45°放置；所述的敏化双色镜与所述的激发双色镜平行放置；所述的敏化光束和激发光束分别经过所述的敏化双色镜和激发双色镜反射后平行出射，光斑宽度略小于物镜后表面的宽度，平行出射的敏化光束和激发光束经所述的物镜聚焦后的点扩散函数重叠，中心相距L，照明所述的被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品；
探测收集部分由陷波滤光片、长通滤光片、聚焦透镜、小孔光阑、雪崩二极管和计算机组成，沿着经样品发射的荧光方向，在激发双色镜的后，依次设置所述的陷波滤光片、长通滤光片、聚焦透镜、小孔光阑和雪崩二极管，所述的小孔光阑置于所述的聚焦透镜的焦平面，中心对准焦点，所述的雪崩二极管接收荧光信号后输入计算机；
扫描部分包括供放置所述的被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品的三维平移台，所述的计算机驱动并控制所述的三维平移台的移动和所述的快门的开合，以实现对可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品的扫描。
在所述的敏化准直系统和敏化双色镜之间还有敏化光瞳滤波器，在所述的激发准直系统和激发双色镜之间还有激发光瞳滤波器。
所述的敏化光源输出光束的波长为405nm，所述的激发光源输出光束的波长为488nm。
所述的敏化双色镜是对波长为405nm的光束高反，波长为488-550nm的光束高透的双色镜。
所述的激发双色镜是对波长为488nm的光束高反，波长为500-550nm的光束高透的双色镜。
所述的敏化光瞳滤波器和所述的激发光瞳滤波器为三区位相型光瞳滤波器，由内向外三区位相依次为0、π、0，归一化半径依次为0.12:0.6:1。
所述的陷波滤光片是对波长为488nm的光束高反，其它波长的光束高透的滤光片。
所述的长通滤光片是对波长为500nm以上的光束高透，500nm以下的光束高反的滤光片。
本发明的技术效果：
所述的光轴平行的所述的敏化光束和激发光束充满物镜后表面，充分利用物镜的数值孔径。
根据可逆光敏蛋白仅在所述的敏化光束和激发光束共同照明的区域才会被敏化并激发荧光的特性，具有较高的信噪比，可获得比由阿贝远场衍射极限限制的爱里斑尺度更小的有效激发区域，从而提高分辨率。
本发明是双色单光子激发的线性过程，具有很高的荧光激发效率；
本发明仅使用一个物镜同时照明样品和采集荧光信号，两束光的强度可独立控制，操作方便。
附图说明
图1为本发明双色单光子荧光成像装置具体实施例的光路原理图；
其中：1为敏化光源(405nm)，2为激发光源(488nm)，3为物镜，4为可逆光敏荧光蛋白标记的样品，5为敏化衰减片，6为敏化准直系统，7为敏化光瞳，8为敏化双色镜，9为快门，10为激发衰减片，11为激发扩束系统，12为激发光瞳，13为激发双色镜，14为陷波滤光片，15为长通滤光片，16为聚焦透镜，17为小孔光阑，18为雪崩二极管，19为计算机，20为三维平移台。
图2为荧光光强随敏化光光强的变化示意图。
其中曲线a、b、c分别对应在激发光在120kW/cm2、135kW/cm2、160kW/cm2时的情形，分别对激发光在120kW/cm2、135kW/cm2、160kW/cm2时敏化光光强较低的部分进行线性拟合。
图3为三区位相型光瞳滤波器示意图。
由内向外A、B、C三区同心，位相依次为0、π、0，归一化半径依次为0.12:0.6:1。
图4为488nm激发光点扩散函数。
图5为双束光同轴传播，敏化光和激发光点扩散函数乘积，即此时的等效点扩散函数。
图6为双束光平行非同轴传播，且焦平面x轴向L＝220nm时，敏化光和激发光点扩散函数乘积，即此时的等效点扩散函数。
图7为两束光都经过光瞳滤波器，平行非同轴传播，且焦平面x轴向L＝1010nm时，敏化光和激发光点扩散函数乘积，即此时的等效点扩散函数。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。
首先请参阅图1，图1为本发明双色单光子荧光成像装置具体实施例的光路原理图，由图可见，本发明双色单光子横向超分辨的成像装置，该装置包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：
照明部分包括：敏化光源1，波长为λ1，沿该敏化光源1输出的敏化光束方向依次是敏化衰减片5、敏化准直系统6、敏化光瞳滤波器7和敏化双色镜8，该敏化双色镜8与所述的敏化光源1输出的敏化光束成45°放置；激发光源2，波长为λ2，沿该激发光源2输出激发光束方向依次是快门9、激发衰减片10、激发准直系统11、激发光瞳滤波器12和激发双色镜13，该激发双色镜13与所述激发光源2输出的激发光束成45°放置；所述的敏化双色镜8与所述的激发双色镜13平行放置；所述的敏化光束和激发光束分别经过敏化双色镜8和激发双色镜13反射后平行出射，光斑宽度略小于物镜3后表面的宽度，平行出射的敏化光束和激发光束经所述的物镜3聚焦后的点扩散函数重叠，中心相距L，照明所述的被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品4；
探测收集部分由陷波滤光片14、长通滤光片15、聚焦透镜16、小孔光阑17、雪崩二极管18和计算机19组成，沿着经所述的样品4发射的荧光方向，在激发双色镜13的后，依次设置所述的陷波滤光片14、长通滤光片15、聚焦透镜16、小孔光阑17和雪崩二极管18，所述的小孔光阑17置于所述的聚焦透镜16的焦平面，中心对准焦点，所述的雪崩二极管18接收荧光信号后输入计算机19；
扫描部分包括供放置所述的被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品4的三维平移台20，所述的计算机19驱动并控制所述的三维平移台20的移动和所述的快门9的开合，以实现对可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品4的扫描。
本实施例中，所述的可逆光敏荧光蛋白为Dronpa，因此，相应的所述的敏化光源1输出光束的波长λ1为405nm，所述的激发光源2输出光束的波长λ2为488nm。所述的敏化双色镜8是对波长为405nm的光束高反，波长为488-550nm的光束高透的双色镜。所述的激发双色镜12是对波长为488nm的光束高反，波长为500-550nm的光束高透的双色镜。所述的敏化光瞳滤波器7和所述的激发光瞳滤波器12为三区位相型光瞳滤波器，由内向外A、B、C三区位相依次为0、π、0，归一化半径依次为0.12:0.6:1。所述的陷波滤光片13是对波长为488nm的光束高反，其它波长的光束高透的滤光片。所述的长通滤光片14是对波长为500nm以上的光束高透，500nm以下的光束高反的滤光片。
关键是利用可逆光敏荧光蛋白需要敏化后才能激发荧光的性质，分别采用λ1和λ2的两束光作为敏化光和激发光，两束光在进入物镜3前平行传播，且光斑宽度分别被敏化准直系统6和激发准直系统11调节至稍小于物镜3后表面宽度，聚焦后两束光点扩散函数重叠，中心相距L，取特定的L值可获得相应的高分辨率。被激发的荧光信号通过陷波滤光片14和长通滤光片15过滤由聚焦透镜16聚焦，经过一个小孔光阑17滤除背景噪声被雪崩二极管18收集，计算机19记录强度数值，接下来计算机19关闭快门9阻挡激发光使可逆荧光蛋白分子在敏化光的作用下恢复到可激发态，快门9将在测量下一待测点时会再次打开。每扫描完一个点计算机19驱动三维平移台20移动可逆光敏荧光蛋白标记的样品4至下一待测量点，依次获取样品内所有测量点强度值后由计算机20重构，获得可逆光敏荧光蛋白标记的样品4的三维图像。
基本工作过程如下所述：
通过敏化衰减片5和激发衰减片9分别控制405nm敏化光和488nm激发光光强，再分别通过敏化准直系统6和激发准直系统10将两束光调节为平行光出射，且使光斑半径其略小于物镜后表面半径以充分利用物镜的数值孔径；接着两束光分别经敏化双色镜8和激发双色镜13反射进入物镜3聚焦敏化荧光蛋白分子并激发荧光。为了说明本方法分辨率提高的程度，以普通荧光蛋白标记样品时的分辨率为参照依据。普通荧光蛋白标记的样品时，其分辨率由激发光在物镜3焦平面的点扩散函数的半高全宽决定，当激发光波长为488nm、物镜数值孔径为1.4时，分辨率约为180nm，如图4所示。采用可逆光敏荧光蛋白Dronpa标记样品4时，可逆光敏荧光蛋白仅在405nm敏化光和488nm激发光共同作用的区域被激发荧光，由图2可知，在敏化光强度不太高的情况下，荧光强度与敏化光强呈线性关系。此时，可以认为有效点扩散函数PSFeff近似等于敏化光与激发光点扩散函数PSFact和PSFexc的乘积，即：
PSFeff＝PSFact·PSFexc
此时的分辨率由有效点扩散函数的半高全宽决定。
下面是本发明实施例的三种具体方案：
1、实施例1
光路图如图1所示，光路中不加所述的敏化光瞳7和激发光瞳12，通过在x轴方向上调节激发双色镜13使两束光同轴传播，经物镜3聚焦后两束光的点扩散函数中心重合，即L＝0。此时等效点扩散函数如图5所示，横向半高全宽为116nm，横向分辨率提高1.55倍。
2、实施例2
光路图如图1所示，光路中不加敏化光瞳7和激发光瞳12，通过在x轴方向上调节激发双色镜13使两束光平行非同轴传播，但经物镜3聚焦后两束光点扩散函数中心在x轴向距离L＝220nm。此时仅在敏化光和激发光爱里斑边沿交叠区域可实现可逆光敏荧光蛋白的荧光激发，其他非交叠区域无法满足可逆光敏荧光蛋白荧光激发条件而不发射荧光。等效点扩散函数如图6所示，x轴向半高全宽为79nm，x方向上分辨率提高2.28倍；y轴向半高全宽100nm，y方向上分辨率提高1.80倍。
3、实施例3
光路图如图1所示，光路中加入敏化光瞳7和激发光瞳12，所述的敏化光瞳7和激发光瞳12为三区位相型光瞳滤波器，由内向外A、B、C三区位相依次为0、π、0，归一化半径依次为0.12:0.6:1。光瞳的加入改变原来点扩散函数分布，使三级衍射极大峰增强。通过在x轴方向上调节激发双色镜13使两束光平行非同轴传播，且经物镜3聚焦后两束光点扩散函数中心x轴向距离L＝1010nm。此时仅在敏化光和激发光爱里斑第三级衍射环焦点边沿交叠区域可实现可逆光敏荧光蛋白的荧光激发，其他非交叠区域无法满足可逆光敏荧光蛋白荧光激发条件而不发射荧光。等效点扩散函数如图7所示，x轴向半高全宽为64nm，x方向上分辨率提高2.81倍；y轴向半高全宽186nm，y方向上分辨率没有提高。
以上三个实施例所激发的荧光由物镜3收集，依次经过敏化双色镜8反射部分405nm光；经过激发双色镜13，反射部分488nm光；经过陷波滤光片14，滤除488nm光；经过长通滤光片15，滤除低于500nm光；通过聚焦透镜16收集荧光信号；通过小孔光阑17滤除点扩散函数中心附近的背景噪声；雪崩二极管18测量荧光光强由计算机19记录数据。每采集完一点，在计算机19的控制下，关闭快门9，阻隔激发光源2发射的激发光光束，使光敏荧光蛋白标记的样品4中被暂时漂白的敏化荧光分子在敏化光源1发射的敏化光的照射下重新回到可激发态。接下来在计算机19驱动三维平移台20将样品移动到下一个待测量点。实施中，如图1所示，以光束行进方向作为Z轴，逐步改变层析深度，依次获取生物样品在不同深度处的X-Y图像，从而重构样品三维图像。
实验表明，本发明提高横向分辨率达1.55-2.81倍。本发明是双色单光子激发的线性过程，具有很高的荧光激发效率；由于可逆光敏蛋白仅在两束光共同照明的区域会被敏化并激发荧光，具有较高的信噪比；本发明仅使用一个物镜同时照明样品和采集荧光信号，两束光的波长和强度独立控制，操作简单，易于实现。

Claims (10)

1、一种双色单光子横向超分辨成像的方法，其特征是采用两束激光分别作为敏化光和激发光，利用聚焦后两束光的点扩散函数重叠部分同时敏化和激发被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品(4)，被激发的荧光信号通过陷波滤光片(14)和长通滤光片(15)过滤由聚焦透镜(16)聚焦，经过一个小孔光阑(17)滤除背景噪声被雪崩二极管(18)收集，计算机(19)记录荧光信号强度数值，接下来计算机(19)关闭快门(9)阻挡所述的激发光，使所述样品上的可逆荧光蛋白分子在敏化光的作用下恢复到可激发态，每测量完所述样品(4)的一个测量点后，计算机(19)驱动三维平移台(20)移动所述样品(4)至下一个待测量点，所述的快门(9)在计算机(19)的控制下再次打开，重复上述测量过程，计算机(19)依次获取所述样品(4)的所有测量点的荧光信号强度值，然后由计算机(20)根据所采集的所有测量点的荧光信号强度值按几何位置排列重构，获得所述的样品(4)的三维图像。
2、根据权利要求1所述的双色单光子横向超分辨成像的方法，其特征在于所述的激发光所产生的荧光与所述的敏化光强和激发光强的关系处于线性区。
3、一种实施权利要求1所述方法的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于该装置包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：
照明部分包括：敏化光源(1)，沿该敏化光源(1)输出的敏化光束方向依次是敏化衰减片(5)、敏化准直系统(6)和敏化双色镜(8)，该敏化双色镜(8)与所述敏化光源(1)输出的敏化光束成45°放置；激发光源(2)，沿该激发光源(2)输出激发光束方向依次是快门(9)、激发衰减片(10)、激发准直系统(11)和激发双色镜(13)，该激发双色镜(13)与所述激发光源(2)输出的激发光束成45°放置；所述的敏化双色镜(8)与所述的激发双色镜(13)平行放置；所述的敏化光束和激发光束分别经过所述的敏化双色镜(8)和激发双色镜(13)反射后平行出射，所述的敏化光束和激发光束的光斑宽度略小于物镜(3)后表面的宽度，平行出射的敏化光束和激发光束经所述的物镜(3)聚焦后的点扩散函数重叠，中心相距L，照明所述的被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品(4)；
探测收集部分由陷波滤光片(14)、长通滤光片(15)、聚焦透镜(16)、小孔光阑(17)、雪崩二极管(18)和计算机(19)组成，沿着经样品(4)发射的荧光方向，在所述的激发双色镜(13)的后，依次设置所述的陷波滤光片(14)、长通滤光片(15)、聚焦透镜(16)、小孔光阑(17)和雪崩二极管(18)，所述的小孔光阑(17)置于所述的聚焦透镜(16)的焦平面，中心对准焦点，所述的雪崩二极管(18)接收荧光信号后输入计算机(19)；
扫描部分包括供放置所述的样品(4)的三维平移台(20)，所述的计算机(19)驱动并控制所述的三维平移台(20)的移动和所述的快门(9)的开合，以实现对所述的样品(4)的扫描。
4、根据权利要求3所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于：在所述的敏化准直系统(6)和敏化双色镜(8)之间还有敏化光瞳滤波器(7)，在所述的激发准直系统(11)和激发双色镜(13)之间还有激发光瞳滤波器(12)。
5、根据权利要求4所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的敏化光瞳滤波器(7)和所述的激发光瞳滤波器(11)为三区位相型光瞳滤波器，由内向外三区(A、B、C)位相依次为0、π、0，归一化半径依次为0.12:0.6:1。
6、根据权利要求3所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的敏化光源(1)输出光束的波长为405nm，所述的激发光源(2)输出光束的波长为488nm。
7、根据权利要求3所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的敏化双色镜(8)是对波长为405nm的光束高反，波长为488-550nm的光束高透的双色镜。
8、根据权利要求3所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的激发双色镜(12)是对波长为488nm的光束高反，波长为500-550nm的光束高透的双色镜。
9、根据权利要求1至8任一项所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的陷波滤光片(13)是对波长为488nm的光束高反，其它波长的光束高透的滤光片。
10、根据权利要求1至8任一项所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的长通滤光片(14)是对波长为500nm以上的光束高透，500nm以下的光束高反的滤光片。
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