CN101248986B - 提高双色双光子荧光成像层析深度的方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种提高双色双光子荧光成像层析深度的方法和装置，采用外光束包含内光束且同轴的双色光通过同一个聚焦物镜(3)聚焦到样品(4)中激发样品荧光的方法，利用两种不同频率的飞秒脉冲激光作为激发光源，一束横截面为环形，一束横截面为圆形，两者同轴互补，这样两束光只在焦点区域重合，通过延时线调整两束光在焦点处等光程激发双光子荧光信号，从而有效消除焦点之外的背景信号，本发明装置可有效地提高三维成像的层析深度，消除背景荧光，提高信噪比，而且操作方便。

Description

提高双色双光子荧光成像层析深度的方法和装置

技术领域

本发明与生物医学有关，涉及双光子荧光成像，特别是一种提高双色双光子荧光成像层析深度的方法和装置，以适用于医学中对生物组织内部的检测。

背景技术

随着生物医学领域的快速发展，人们对显微成像技术提出了越来越高的要求，不仅需要对物体表面形貌和光学特性进行分析，而且更需要对它内部的构造进行三维观察与处理，这就需要提高成像深度。

近年来，双光子激发荧光成像引起了人们广泛的兴趣(Denk W，Strickler J，Webb W.，Science，Vol.248，73～76，1997)。双光子激发(以下简称为TPE)是一种三阶非线性过程，这种非线性的特点，使得双光子激发需要更高的激发功率，并且荧光信号的强度与激发光强度的平方成正比，从而能够将双光子荧光的产生局域在焦点区域。因此双光子成像具有天然的对三维样品层析成像的能力。据报道，利用锁摸掺钛蓝宝石振荡器作为激发光源能实现的最大层析深度为600μm(参见Kleinfeld D.，Mitra P.P.，Helmchen F.，Denk W.，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.95，15741，1998)。2003年，Denk等人使用掺钛蓝宝石的再生放大器作为双光子荧光激发的光源，对小鼠大脑的在体层析深度达到1000um，即1mm(Theer P.，Hasan M.T.，Denk W.，Opt.Lett.，Vol.28，1022～1024，2003)。进一步提高层析深度将对生物医学研究有非常大的意义。在高散射介质中，激发光的强度随着深度的增加呈指数衰减，为了在更深处维持同样的信号强度，激发光强度需随深度指数增加。但随着激发光能量的提高，焦点之外区域的荧光发射也大大增强，这就不可避免地引起了背景信号的增强，因此导致成像对比度的降低，从根本上限制了层析深度的提高。

双光子激发时，两束光的波长不一定必须相等，两束不同波长光激发的双光子过程称为双色双光子激发(以下简称为TCTPE).双色双光子激发与双光子激发具有相同的物理机制，两个激发波长需要满足1/λ_e＝1/λ₁+1/λ₂，其中：λ_e为单光子激发波长，λ₁和λ₂为两个激发波长。TCTPE荧光信号的强度I_TC∝I₁(λ₁)I₂(λ₂)。TCTPE与TPE的最大区别是其在成像中的光学特性不同，TCTPE的两束激发光具有不同的波长，属于非相干激发，而TPE是相干激发过程。对于TCTPE，只有两束光交迭区域才能激发荧光，两束光非相干叠加，旁瓣要小的多，因此相对于TPE的信噪比更高。在典型的双色双光子方案中，两种不同波长的光成一定的角度入射，分别用两个物镜将两束光聚焦于样品中的同一点激发荧光。两束光在焦点前后在空间上是完全分开的，只在焦点区域重叠，因此只有焦点区域能够激发双色双光子荧光，背景噪声非常小。在高散射介质中，指数增加激发光强以维持更深处TCTPE荧光信号时，不会引起背景信号的大量增加。因此，双色双光子比双光子成像有较高的信噪比，层析深度更深。但该方案也有其不足之处：

(1)由于使用两个物镜，调节较困难；

(2)物镜之间成一定的角度，这缩短了物镜的有效工作距离；

(3)不容易对活体组织进行观测。

如何寻找一种合适的方案来提高层析深度是目前光学显微成像领域面临的重要问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服上述现有对生物组织深度层析成像方面的不足，提供一种提高层析深度的双色双光子荧光成像方法和装置，该发明可提高高散射介质中三维成像的层析深度，有效地消除背景荧光，提高信噪比，而且操作方便。

本发明的技术解决方案如下：

一种提高双色双光子荧光成像层析深度的方法，其特点是采用外光束包含内光束且同轴的双色光通过同一个聚焦物镜聚焦到样品中激发样品荧光的方法，内光束为一圆形光束，波长为λ₁，半径为r₁，外光束为一圆环形光束，波长为λ₂，内半径为r₁，外半径为r₂。

一种双色双光子荧光成像装置，其特点在于该装置包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：

照明部分包括：

第一光源，波长为λ₁，沿该第一光源输出光束方向依次是半波片、第一缩束系统、延时线和第一双色镜，该第一双色镜与所述的第一光源的光束成45°放置；

第二光源，波长为λ₂，沿该第二光源输出光束方向依次是第二缩束系统、滤波光瞳和第二双色镜，所述的第二光源的光束经所述的滤波光瞳后成为一圆环形光束，所述的第二双色镜与所述的圆环形光束成45°放置；

所述的第一双色镜和所述的第二双色镜相互平行，经所述的第一双色镜反射的半径为r₁圆形光束，通过所述的第二双色镜时，并与由所述的第二双色镜反射的内半径为r₁，外半径为r₂的圆环形光束同轴，形成圆形光束在内，圆环形光束在外，且同轴的双色光，该同轴的双色光经聚焦物镜聚焦后照射样品；

探测收集部分由收集透镜、光电倍增管、光子计数器和计算机组成，所述的收集透镜置于所述的第一双色镜的透射光方向，光电倍增管放置在收集透镜的焦平面收集荧光信号由光子计数器获得光子数信号后输入计算机；

扫描部分包括置放样品的三维平移台，所述的计算机驱动并控制所述的三维平移台的移动，以实现对样品的不同位置的扫描探测。

所述的第一光源输出光为垂直偏振，波长为1200nm。

所述的第二光源输出光为水平偏振，波长为800nm。

所述的第一双色镜是对波长为1200nm的光束高反，波长为480-640nm的光束高透的双色镜。

所述的第二双色镜是对波长为800nm的光束高反，波长为1200nm的光束高透，波长为480-640nm的光束高透的双色镜。

本发明的技术效果：

所述的同轴的双色光束充满聚焦物镜的整个入射光瞳，可充分利用物镜的数值孔径。焦点前后，两束光是完全分开的，只在焦点处重合。只有当两束光在时间和空间上重合时才有荧光的产生，因此该方案可以从很大程度上避免焦点之外的荧光背景，提高信噪比，从而提高层析深度。本发明使用同一个物镜聚焦，比现有的双色双光子方案易于实现，而且本发明装置操作方便，比较灵活，可以独立控制两束光的波长、强度和偏振等。

附图说明

图1为本发明方法的原理示意图；

图2为本发明双色双光子荧光成像装置具体实施例的光路图；

其中：1为第一(1200nm)光源，2为第二(800nm)光源，3为物镜，4为荧光素标记的样品，5为半波片，6为缩束系统(缩束比为5∶3)，7为延时线，8为滤波光瞳(中心遮挡比为1∶2)，9为第一双色镜(对1200nm高反，480-640nm高透)，10为第二双色镜(对800nm高反，1200nm高透，480-640nm高透)，11为三维平移台，12为收集透镜，13为光电倍增管，14为光子计数器，15为计算机。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。

先请参阅图1，图1为本发明方法的原理示意图，本发明提高双色双光子荧光成像层析深度的方法，关键是采用外光束包含内光束且同轴的双色光通过同一个聚焦物镜3聚焦到样品4中激发样品荧光的方法，内光束为一圆形光束，波长为λ₁，半径为r₁，外光束为一圆环形光束，波长为λ₂，内半径为r₁，外半径为r₂。

再请参阅图2，图2为本发明双色双光子荧光成像装置具体实施例的光路图，由图可见，本发明双色双光子荧光成像装置，包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：

照明部分包括：

第一光源1，波长为λ₁，沿该第一光源1输出光束方向依次是半波片5、第一缩束系统6、延时线7和第一双色镜9，该第一双色镜9与所述的第一光源1的光束成45°放置；

第二光源2，波长为λ₂，沿该第二光源2输出光束方向依次是第二缩束系统6’、滤波光瞳8和第二双色镜10，所述的第二光源2的光束经所述的滤波光瞳8后成为一圆环形光束，所述的第二双色镜10与所述的圆环形光束成45°放置；

所述的第一双色镜9和所述的第二双色镜10相互平行，经所述的第一双色镜9反射后成为半径为r₁的圆形光束，通过所述的第二双色镜10时，并与由所述的第二双色镜10反射的内半径为r₁，外半径为r₂的圆环形光束同轴，形成圆形光束在内圆环形光束在外且同轴的双色光，该同轴的双色光经聚焦物镜3聚焦后照射样品4；

探测收集部分由收集透镜12、光电倍增管13、光子计数器14和计算机15组成，所述的收集透镜12置于所述的第一双色镜9的透射光方向，光电倍增管13放置在收集透镜12的焦平面收集荧光信号由光子计数器14获得光子数信号后输入计算机15；

扫描部分包括置放样品4的三维平移台11，所述的计算机15驱动并控制所述的三维平移台11的移动，以实现对样品4的不同位置的扫描探测。

所述的第一光源1输出光为垂直偏振，波长为1200nm。

所述的第二光源2输出光为水平偏振，波长为800nm。

所述的第一双色镜9是对波长为1200nm的光束高反，波长为480-640nm的光束高透的双色镜。

所述的第二双色镜10是对波长为800nm的光束高反，波长为1200nm的光束高透，波长为480-640nm的光束高透的双色镜。本实施例中以800nm和1200nm两束光作为激发光源，如图2所示，系统主要包括照明部分，扫描部分和探测收集部分。1200nm光源1输出光为垂直偏振，光斑半径为2.5mm，利用半波片5改变为水平偏振，通过第一缩束系统6准直缩束，使光斑半径变为1.5mm。第二光源2为800nm光源，输出光为水平偏振，半径为5mm。经第二缩束系统6’变为3mm。通过滤波光瞳8将800nm光变为环形光束，其内半径为1.5mm，外半径为3mm。调节第一双色镜9和第二双色镜10的位置，使两束光同轴互补，经同一聚焦物镜3聚焦入样品4中，所用聚焦物镜3数值孔径为0.7，通光孔径为6mm(直径)，光束可以充满整个通光孔径，有效利用其数值孔径。调节延时线7使两束光等光程，在焦点处激发双色双光子荧光。探测收集部分主要包括收集透镜12、光电倍增管13、光子计数器14和计算机15。

基本工作过程为：两束光经缩束、滤波整形后，经由第一双色镜9和第二双色镜10变为同轴互补的两束光，通过聚焦物镜3聚焦到样品4中，照明光所激发的荧光再次被聚焦物镜3收集，经由第二双色镜10和第一双色镜9、收集透镜12，进入光电倍增管13。接着，在计算机的控制下，通过三维平移台11扫描样品的不同位置，同时根据光子计数器14记录的数据，计算机15可以重组出样品的显微图象。实施中，我们以光束行进方向作为Z轴，以垂直光束行进方向作为X-Y平面，将样品4的入射表面和聚焦物镜3焦点之间的距离定义为层析深度d。改变深度d，依次获取生物样品在不同d位置处的X-Y成像。

实验表明，本发明很大程度上避免焦点之外的荧光背景，提高了信噪比，从而提高层析深度。本发明使用同一个物镜聚焦，操作方便，比较灵活，可以独立控制两束光的波长、强度和偏振等。

Claims (5)

1.一种提高双色双光子荧光成像层析深度的方法，其特征是采用外光束包含内光束且同轴的双色光通过同一个聚焦物镜(3)聚焦，仅在焦点处重合的两光束照射样品(4)激发样品荧光的方法，所述的内光束为一圆形光束，波长为λ₁，半径为r₁，所述的外光束为一圆环形光束，波长为λ₂，内半径为r₁，外半径为r₂；实施该方法的双色双光子荧光成像装置，包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：

照明部分包括：第一光源(1)，波长为λ₁，沿该第一光源(1)输出光束方向依次是半波片(5)、第一缩束系统(6)、延时线(7)和第一双色镜(9)，该第一双色镜(9)与所述的第一光源(1)的光束成45°放置；第二光源(2)，波长为λ₂，沿该第二光源(2)输出光束方向依次是第二缩束系统(6’)、滤波光瞳(8)和第二双色镜(10)，所述的第二光源(2)的光束经所述的滤波光瞳(8)后成为一圆环形光束，所述的第二双色镜(10)与所述的圆环形光束成45°放置；所述的第一双色镜(9)和所述的第二双色镜(10)相互平行，经所述的第一双色镜(9)反射的半径为r₁圆形光束，通过所述的第二双色镜(10)时，并与由所述的第二双色镜(10)反射的内半径为r₁，外半径为r₂的圆环形光束同轴，形成圆形光束在内，圆环形光束在外，且同轴的双色光，该同轴的双色光经聚焦物镜(3)聚焦后照射样品(4)；

探测收集部分由收集透镜(12)、光电倍增管(13)、光子计数器(14)和计算机(15)组成，所述的收集透镜(12)置于所述的第一双色镜(9)的透射光方向，光电倍增管(13)放置在收集透镜(12)的焦平面收集荧光信号由光子计数器(14)获得光子数信号后输入计算机(15)；

扫描部分包括置放样品(4)的三维平移台(11)，所述的计算机(15)驱动并控制所述的三维平移台(11)的移动，以实现对样品(4)的不同位置的扫描探测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的第一光源(1)输出光为垂直偏振，波长为1200nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的第二光源(2)输出光为水平偏振，波长为800nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的第一双色镜(9)是对波长为1200nm的光束高反，波长为480-640nm的光束高透的双色镜。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的第二双色镜(10)是对波长为800nm的光束高反，波长为1200nm的光束高透，波长为480-640nm的光束高透的双色镜。

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