CN112485232B

CN112485232B - 基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法和装置

Info

Publication number: CN112485232B
Application number: CN202011131677.0A
Authority: CN
Inventors: 匡翠方; 詹政以; 李传康; 刘旭
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2040-10-21
Also published as: CN112485232A

Abstract

本发明公开了一种基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法和装置，同一光源产生的激光被电光调制器周期地调制线偏方向，得到两种光束，其中一束光经空间光调制器调制后在样品上聚焦形成Y方向一维暗斑，另一束光被空间光调制器调制为X方向一维暗斑。两种光斑分别被两台放置在光路上的电光偏转器偏转，进行分时照明，从而得到荧光分子被不同方向一维暗斑的不同位置激发出的光子数，再基于极大似然概率估计的数学模型，对荧光分子进行二维空间定位和取向求解。本发明创新性的采用两个正交方向的一维暗斑通过偏振调制进行分时照明，较之传统方法，在获取分子位置信息的同时可以获取其偶极子取向信息。

Description

基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法和装置

技术领域

本发明属于超分辨领域，尤其涉及一种基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法和装置。

背景技术

早在1926年，荧光的偏振特性(Fluorescence Polarization)就已被发现。进一步的研究显示，这种偏振特性由偶极子取向引起，并与被标记的蛋白的空间方向密切相关，进而可以用于研究活细胞中靶蛋白的结构及其动力学变化。

近几十年来，荧光偏振显微技术迅速演进，已经是一种比较成熟的光学成像技术。并且，它还拥有很强的兼容性，可与各种成像技术(如：宽场荧光显微、共聚焦扫描显微、全内反射荧光显微等)相结合。但是，这些技术都会受到衍射极限的限制，空间分辨率和定位精度都较低，无法达到单分子水平。这严重限制了其在生物医学领域的应用范围。

近年来，一种新型的纳米分辨技术——最小光通量显微术(minimal photonfluxes,MINFLUX)被提出。与随机坐标定位技术通过高斯中心拟合定位，或者确定坐标分辨技术使用空心光束进行荧光损耗不同，在单分子定位过程中，MINFLUX只使用空心光束激发荧光并进行确定坐标的暗斑中心定位。相比高斯中心定位，MINFLUX采用的暗斑中心定位具有很强的光敏感性，其空间分辨能力可以达到亚十纳米。MINFLUX定位单个荧光分子所需的光子数极低，大大降低荧光染料漂白的风险，可以长时间对荧光分子进行定位。因此该技术是一种长时程、高精度、高分辨的定位手段。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法和装置。本装置利用电光调制器进行偏振调制，分时调制为S偏振态或P偏振态。之后用偏振分束棱镜将这束偏振调制光分成两路，一路使用空间光调制器产生X方向一维暗斑，并使用电光偏转器实现其在X方向的移动；另一路使用空间光调制器产生Y方向一维暗斑，并使用另一电光偏转器实现其在Y方向的移动。之后使用一分束棱镜对这两路光进行合束。通过两台电光调制器分别进行强度调制和偏振调制，以固定的时序实现对单分子位置和取向的探测。探测器收集一维暗斑不同位置处激发的荧光信号，基于极大似然概率估计重构出荧光分子的二维精确位置信息和取向信息。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明一方面提供了一种基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法，该方法包括以下步骤：

1)调整准直后激光光束的偏振情况，使激光光束分时地被调制为两种线偏振光，即P光和S光；

2)将P光调制为Y方向一维暗斑，S光调制为X方向一维暗斑；

3)将经过相位调制的P光和S光共轴，并分别使用电光偏转器高精度地调整光斑位置；

4)使步骤3)调整后的光束投射到样品以对样品进行扫描；

5)使用单光子计数器接收荧光分子被不同方向的一维暗斑不同位置激发出的信号光；

6)利用步骤5)中所得到的光子数信息，基于极大似然概率估计重构出荧光分子的二维空间信息和取向信息；

7)经过压电偏摆镜选区扫描并重复步骤1)到6)，以实现更大视场的探测。

进一步地，利用空间光调制器将P光调制为Y方向一维暗斑，将S光调制为X方向一维暗斑。

本发明另一方面提供了一种基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向装置，该装置包括激发光光源、承载待测样品的样品台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，所述光源与显微物镜之间依次设有：

用于将经单模光纤输出的激光光源准直扩束的准直镜；

用于快速调整光强的第一电光调制器；

用于快速调整激光线偏振方向的第二电光调制器；

用于将偏振特性改变后的光束分成两路的偏振分束棱镜，两束线偏振光分别为P光和S光；

偏振分束棱镜的透射光路依次设有：

用于对所述P光进行Y方向一维暗斑调制的第一空间光调制器；

用于对所述Y方向一维暗斑进行缩束的第一望远系统；

用于对所述Y方向一维暗斑进行小范围快速移动的第一电光偏转器；

偏振分束棱镜的反射光路依次设有：

用于对所述S光进行X方向一维暗斑调制的第二空间光调制器；

用于对所述X方向一维暗斑进行缩束的第二望远系统；

用于对所述X方向一维暗斑进行小范围快速移动的第二电光偏转器；

偏振分束棱镜的透射光路和反射光路的两束激光通过分束棱镜进行合束，并在后续光路依次设有：

用于补偿二向色镜出射的光束偏振改变而依次设置的1/2波片和1/4波片；

用于反射激光光束和透射荧光信号的二向色镜；

用于将偏振相位调制后的两束激光进行光路偏转实现对样品选区扫描的压电偏摆镜；

用于实现压电偏摆镜与显微物镜入瞳共轭的4f系统，包括扫描透镜和场镜；

并设有控制所述第一电光调制器、第二电光调制器、第一电光偏转器、第二电光偏转器和压电偏摆镜的控制器及收集待测样品发出的信号光的探测系统。

进一步地，所述准直镜与偏振分束棱镜之间设有分别用于快速开关激光和快速调整激光线偏振方向的两台电光调制器。

进一步地，所述第一空间光调制器，其相位调制原理在于调制函数

其中，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；所述第二空间光调制器，其相位调制原理在于调制函数

进一步地，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

进一步地，所述探测系统包括：

用于滤除二向色镜出射的荧光中的杂散光和部分激光的窄带滤波片；

用于将滤光后的荧光光束聚焦到探测器上的收集透镜；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述收集透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径；

用于探测信号光束光强信号的探测器，所述探测器选用雪崩光电二极管(APD)。

基于上述亚十纳米定位测向装置的定位测向方法，包括以下步骤：

1)将激发光激光器发出的激光光束汇聚耦合进入单模光纤；

2)使用第二电光调制器对从单模光纤输出的激光进行偏振调制，首先调制为P光；

3)经第二电光调制器出射的P光透过偏振分束棱镜，被空间光调制器调制为Y方向一维暗斑，经望远系统缩束、电光偏转器偏转后透过一分束棱镜进行合束；

4)将上述分束棱镜合束的光投射到样品上，在每次移动光束时使用第一电光调制器将光强调制至0，以避免产生任何不想要的激发；

5)探测器获得Y方向一维暗斑在不同位置时激发出的光子数；

6)将第二电光调制器出射的激光调制为S光；

7)经第二电光调制器出射的S光被偏振分束棱镜反射，经过空间光调制器被调制为X方向一维暗斑，随后被一分束棱镜反射进行合束；

8)将上述偏振分束棱镜合束的光投射到样品上，在每次移动光束时使用第一电光调制器将光强调制至0，以避免产生任何不想要的激发；

9)探测器获得X方向一维暗斑在不同位置时激发出的光子数；

10)根据探测器接收到的不同照明和不同位置处光子数以及照射荧光分子样品的一维暗斑参数，可得到产生该光子流分布的极大似然概率，反解即可得到荧光分子的发光位置和取向信息；

11)经过压电偏摆镜扫描，并重复步骤(2)至步骤(10)，则可获得一定区域内的荧光分子的二维分布信息和取向信息。

本发明原理如下：

在传统的MINFLUX系统中，使用甜甜圈型的空心暗斑进行小范围的快速移动，可以获取同一荧光分子被不同位置的该空心暗斑激发出的光子数。根据其光子数信息以及该横向空心暗斑的参数，结合极大似然估计算法，可反解出该分子的二维发光位置。

本发明创新性地使用X方向和Y方向的一维暗斑代替传统的甜甜圈型的空心暗斑，由于其线偏的特性，可以在对单分子进行定位的同时探测偶极子取向。并且使用两台电光调制器对激光进行快速开关，和调制激光的线偏振态。随后使用偏振分束棱镜分光，将透射偏振分束棱镜的一路，调制为Y方向一维暗斑，且将偏振分束棱镜反射的一路，调制为X方向一维暗斑。上述两种暗斑各使用一电光偏转器实现各自方向上的移动。之后再使用一分束棱镜进行合束。由于电光调制器将激光调制为S光或者P光，上述两路激光不会同时产生，且配合另一电光调制器可控制照明的时序。

使用极大似然概率估计得到荧光分子位置的原理是：在一个定位周期内，由于我们将激发暗斑移动了多个位置，该荧光分子先后多次被暴露在不同的激发光强下，因而探测器会接收到不同的光子数，从而形成一个定位周期内光子数的特定分布。对于待定位区域的各个空间点，我们可以计算出假设荧光分子就在该点时，产生和实验结果相同的光子数分布的概率大小，根据极大似然概率估计原理，选择该概率最大值所对应的空间点，则就是荧光分子最有可能存在的位置。

使用极大似然概率估计得到偶极子取向的原理与得到荧光分子位置的原理是类似的，两者可在一个过程中同时解出：

假设一荧光分子处于

位置，被K个不同光强激发

产生一个光子数集为

其中，每个光子数n_i都服从一个均值为λ_i的泊松分布。当背景和暗计数可以忽略，且避免荧光饱和的情况下，泊松分布的均值可被近似为：

其中，Q是一个包含系统收集效率、荧光量子产率、吸收截面等参数的常数，

是偶极子取向，θ_i是激发光线偏方向。

因为其光子数集分布属于多项式分布：

其中，

N＝n₀+...+n_K-1

N是收集到的光子数总和，K是一个定位周期中激发光斑放置位置的总次数，n_i代表在一个定位周期内第i个位置收集到的光子数，p_i代表接收到的该光子是由在第i个放置位置一维暗斑中心点对准的荧光分子产生的概率，其中I_i代表第i个放置位置荧光分子暴露在激发光的强度。

由于加入了偶极子取向，导致极大似然估计的计算量变大，由于在特定范围内，该似然函数为凸函数，所以本发明采用梯度下降法加速极大似然估计求解。

相较于现有的技术，本发明的创新点如下：

(1)首次提出基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法；

(2)对激发光进行偏振调制，分时产生S光和P光，分别进行X方向或Y方向的探测，并由于线偏特性，可获得取向信息。

附图说明

图1为本实施例的定位测向装置的结构示意图；

图2为本实施例经过空间光调制器调制后的两种不同的一维暗斑被物镜聚焦后在焦点附近的光场分布的横向截面示意图；

图3为本实施例一个调制周期的具体时序及光斑移动位置示意图；

图4为本实施例的选区扫描模式示意图；

图5为本实施例的横向定位示意图；

图6为本实施例的测向示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，本实施例的基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向装置，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，第一电光调制器4，第二电光调制器5，偏振分束棱镜6，第一空间光调制器7，第二空间光调制器10，第一望远系统8，第二望远系统11，第三望远系统15，第一电光偏转器9，第二电光偏转器12，分束棱镜13，第一反射镜14，第二反射镜18，第三反射镜21，第四反射镜22，1/2波片16，1/4波片17，二向色镜19，压电偏摆镜20，扫描透镜23，场镜24，显微物镜25，样品台26，窄带滤波片27，收集透镜28，多模光纤29，单光子计数器30。

其中，单模光纤2、准直透镜3、第一电光调制器4、第二电光调制器5以及偏振分束棱镜6依次位于激光器1出射光束的光轴之上。

其中，第一空间光调制器7、第一望远系统8和第一电光偏转器9依次位于偏振分束棱镜6透射的光轴之上，而第二空间光调制器10、第二望远系统11和第二电光偏转器12依次位于偏振分束棱镜6反射的光轴之上。

其中，分束棱镜13位于经第一空间光调制器7和经第二空间光调制器10调制后光束的光轴之上。

其中，第三望远系统15、1/2波片16、1/4波片17和第二反射镜18依次位于分束棱镜13的出射光经第一反射镜14偏折之后的光轴之上。

其中，二向色镜19位于经第二反射镜18偏折之后的光轴之上；压电偏摆镜20位于经二向色镜19反射后光束的光轴之上。

其中，第三反射镜21、第四反射镜22、扫描透镜23、场镜24、显微物镜25和样品台26依次位于经压电偏摆镜20出射光束的光轴之上。

其中，窄带滤波片27、收集透镜28、多模光纤29和单光子计数器30依次位于经二向色镜19后的光轴之上。

上述装置中，显微物镜25的数值孔径NA＝1.4；所用多模光纤29的直径为0.8个艾里斑直径，单光子计数器30为雪崩光电二极管(APD)。

采用图1所示的装置进行超分辨定位测向的方法如下：

从激光器1发出的激光光束，首先被导入单模光纤2，经过准直透镜3完成准直。经过准直后的光束入射到第一电光调制器4和第二电光调制器5，通过第一电光调制器4被分时开关，通过第二电光调制器5偏振调制为S光或者P光，其中透射偏振分束棱镜6的P光经第一空间光调制器7被调制为Y方向一维暗斑，随后经过第一望远系统8缩束，最后通过第一电光偏转器9偏转；而被偏振分束棱镜6反射的S光经第二空间光调制器10被调制为X方向一维暗斑，随后经过第二望远系统11缩束，最后通过第二电光偏转器12偏转。这两束光经分束棱镜13合束后共轴。

经分束棱镜13出射的这束光，通过第三望远系统15扩束，1/2波片16和1/4波片17补偿因二向色镜19引起的偏振态改变，以及第二反射镜18偏转后，再经二向色镜19反射。

调制后的光入射到压电偏摆镜20上，经压电偏摆镜20出射的光束依次通过扫描透镜23聚焦、场镜24准直，之后经显微物镜25投射到位于样品台26上的待测样品之上。

入射光在显微物镜25的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

式中，(r₂,φ₂,z₂)是以显微物镜25的焦点位置为原点的柱坐标系下的坐标，

代表了

处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，φ为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，A₁(θ,φ)是入射光的振幅分布，A₂(θ,φ)是一个与物镜结构相关的3×3矩阵，

则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率，λ为入射光波长，Ω表示显微物镜的入瞳面。

由上式计算可以发现，此时入射的线偏光经显微物镜25聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个X方向或Y方向一维暗斑，其光场分布的横向截面如图2所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜25收集，之后依次通过场镜24、扫描透镜23、压电偏摆镜20，最后通过二向色镜19。信号光束通过窄带滤波片27滤去杂散光，之后被收集透镜28聚焦，然后通过多模光纤29，最终被单光子计数器30接收。

通过控制器调节第一电光调制器4和第二电光调制器5，实现对单分子的分时探测，以获取分子的二维发光位置，每个周期的时序如图3所示。

通过控制器调节压电偏摆镜20，实现对于待测样品的选区扫描，扫描模式如图4所示。

对采集到的数据使用极大似然概率估计，即可以获得较为精准的荧光分子位置和取向，如图5、6所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何的简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims

1.一种基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)将P光调制为Y方向一维暗斑，S光调制为X方向一维暗斑；

4)使步骤3)调整后的光束投射到样品以对样品进行扫描；

2.如权利要求1所述的基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法，其特征在于，利用空间光调制器将P光调制为Y方向一维暗斑，将S光调制为X方向一维暗斑。

3.一种基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向装置，其特征在于，包括激发光光源、承载待测样品的样品台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，所述激发光光源与显微物镜之间依次设有：

用于将经单模光纤输出的激光光源准直扩束的准直镜；

用于快速调整光强的第一电光调制器；

用于快速调整激光线偏振方向的第二电光调制器；

所述准直镜与偏振分束棱镜之间设有分别用于快速开关激光和快速调整激光线偏振方向的两台电光调制器；

偏振分束棱镜的透射光路依次设有：

用于对所述Y方向一维暗斑进行缩束的第一望远系统；

偏振分束棱镜的反射光路依次设有：

用于对所述X方向一维暗斑进行缩束的第二望远系统；

用于反射激光光束和透射荧光信号的二向色镜；

并设有控制所述第一电光调制器、第二电光调制器、第一电光偏转器、第二电光偏转器和压电偏摆镜的控制器及收集待测样品发出的信号光束的探测系统；所述探测系统包括：

用于将滤光后的荧光光束聚焦到探测器上的收集透镜；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器；

用于探测信号光束光强信号的探测器。

4.如权利要求3所述的基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向装置，其特征在于，所述第一空间光调制器，其相位调制原理在于调制函数

其中，

5.如权利要求3所述的基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向装置，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。