CN104634766A - 一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于泵浦-探针技术的超分辨方法，第一光束照射样品并使样品的原子跃迁至激发态，第二光束经相位调制后在样品上形成空心光斑并激发信号光，第三光束在样品上形成实心光斑并激发信号光；其中，控制第三光束的频率为V₁，探测频率为V₁的信号光得到第一信号光强I₁(x,y)，控制第二光路的频率为V₂，探测频率为V₂的信号光得到第二信号光强I₂(x,y)，并计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标，得到超分辨显微图像。本发明还公开了一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置。本发明成像速度快，可以同时扫描被差分图像，而且受激辐射相比原本方法的自发辐射要来的快。

Description

一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置和方法

技术领域

本发明属于超分辨领域，尤其涉及一种快速的基于pump-probe技术的超分辨显微方法和装置。

背景技术

由于光学系统衍射的影响，常规远场光学显微方法可实现的分辨率存在限制。根据阿贝衍射极限理论，光束经显微物镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽表示为其中λ为显微镜的工作波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，常规远场光学显微镜的极限分辨率一般被限制在了半波长左右。

泵浦-探针(Pump-probe)技术作为一种标准的非线性测量工具，Pump-probe技术已经存在了几十年，它用于表征激发介质的光致光学变化特性。基本概念就是一个泵浦光脉冲用于激发样品使样品跃迁到高能级，第二个探测光经过可调节时延后探测样品，泵浦导致的光谱透射率的变化，成为泵浦和探测之间的一个时延函数。通过监控探针信号的时延功能，可以获取信息衰变或是在其他流程中的泵浦脉冲产生的激励。这种测量方法的分辨率高，精度好，但缺点在于没能突破衍射极限。

近年来，为了突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微方法。

例如：受激发射损耗显微术(STED：Stimulated Emission DepletionMicroscopy)，即利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少荧光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；结构光照明荧光显微术(SIM：StructuredIllumination Microscopy)；随机光场重建显微术(STORM:StochasticOptical Reconstruction Microscopy)以及在STED基础上进行改进的荧光辐射差分显微术(FED：Fluorescence Emisson Difference Microscopy)。

上述几种方法均可以在远场实现荧光超分辨显微，在实际测试中也得到了相应的应用，但是都还仍然存在着不足。其中，STED显微术的分辨率由所加损耗光的光功率决定，因此当实现高分辨率时，其所要求的光功率很强，容易导致荧光分子的漂白。此外，STED显微术的系统较为复杂，造价一般比较。SIM显微术对光功率的要求虽然不高，但是由于其需要光栅扫描，成像速度较慢，成像系统也较为复杂。STORM显微术的成像速度也很慢，目前还很难运用于活体细胞的实时检测当中。FED显微术虽然比之前有所改进，但需要前后两次扫描成空心和实心像，成像速度相对较慢。

发明内容

本发明提供了一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置和方法，可以在远场实现超衍射极限的分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、可以同时扫描、成像速度快、分辨率高等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。

一种基于泵浦-探针技术的超分辨方法，包括以下步骤：

1)将第一激光器发出的第一束激光光束经扫描振镜后投射到待测样品上，使待测样品上的原子向上跃迁至激发能级；

2)第二激光器发出激光照射到位相板上，对第二束线偏振光进行相位调制，调制函数为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

3)将所述相位调制后的线偏振光进行光路偏转；

4)偏转后的光束经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上,待测样品上的处于激发态的发光原子在外来辐射场的作用下，向低能态跃迁，辐射光子发光，以实现对待测样品的第一次二维扫描；

5)辐射出的光子经过放置在样品台下方的显微镜后进入探测系统，探测器与锁相环和计算机相连，因为第二光路的锁相环接收到特定频率的参考光，经调制后的激光束也会在特定的第二探测器上成像，像返回到计算机。

6)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I₁(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

7)由第三激光器发出光，因为没有经过位相板，相当于调制函数为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

8)对各扫描点进行第二次扫描，收集得到的第二信号光强I₂(x,y)；

9)根据公式I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)计算有效信号光强I(x,y)，并利用I(x,y)得到超分辨图像，其中，为第一信号光强I₁(x,y)中的最大值，第二信号光强I₂(x,y)中的最大值。

当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品，第一激光器发出光线投射到样品上，使样品上发光原子跃迁到激发态，第二、三束光通过样品后使样品产生受激辐射产生相同的光束，记为第1、2号信号光，所述信号光透过样品后进入样品下的显微物镜，经过二色镜后分别被探测器接收。

待测样品上的x，y轴方向由二维扫描方向决定。

所述有效信号光强值I(x,y)为负时，设置I(x,y)＝0。

本发明提供了一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置，包括第一光源、第二光源、第三光源，承载待测样品的样平台和将光线投射到所述样品台的显微物镜以及样品台下的显微物镜及两个探测系统，还包括:

位于第一光路上的第一起偏器，

沿第二光路依次布置的第二起偏器和位相板，

第三光路上的起偏器，

对二、三路光束进行偏转的二色镜。

用于将所述第一、二、三光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统，

依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜，

用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上；

并设有控制所述第一、二、三光源和扫描振镜系统的锁相环及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

探测系统包括：

用于滤去分束镜出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非荧光样品时可以省略；

布置在样品之下显微镜后的二色镜，所述分束镜在第二、第三光源发出相同波长激光时应选为分束镜；

用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；

用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径。

所述第一光源与第一起偏器之间依次设有第一单模光纤和第一准直透镜，所述第二光源和第二起偏器之间依次设有第二单模光纤和第二准直透镜，同理第三光路。

所述位相板的调制函数为其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，φ为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

第二激光器连接一个特定的锁相环，用一特定频率信号调制形成空心光斑的光束的激光器，使其发出的第一光束的频率为v，并用此频率信号作为锁相放大器的参考信号。第一、第二和第三光束通过相应的调制函数调制后经过分束棱镜合并成一路光，光轴重合，通过显微物镜照射到样品表面。在被光斑照射的范围内样品所发出的信号光通过分光棱镜分成三束，其中一束由锁相放大器探测。锁相放大器根据参考信号v，从两束信号光中提取其被调制过的第一光束对应的空心斑信号光强I₁(x，y)。同理第三激光器和它对应的锁相环、探测器。

同时，激光器发出光与探测器接收光的频率应与扫描振镜系统的帧扫描频率相同，从而实现扫描振镜系统每扫描一帧图像，激光器每发出一次，接收器也每接收一次。

所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

针对当第二、第三激光光源发出激光波长相同时。第二光路上布置由第二起偏器和位相板，以及在位相板后面的分束镜，分束镜后在放置一二色镜，第三光路上设有的第三起偏器，起偏器方向与第一光路的起偏器方向垂直，起偏器后放置一面反射镜，将光束反射到第二光路处。

本发明原理如下：

由于光学系统衍射的影响，平行入射的照明光束经显微物镜聚焦之后，在待测样品上所成的光斑并非一个理想的点，而是一个具有一定尺寸的衍射斑。在衍射斑照射范围内的样品均会发出相应的信号光，从而使得这一范围内样品的细节无法被分辨，由此限制了显微系统的分辨率。因此，要突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，如何减小在扫描点处有效信号光的发光面积便成为了关键。

在本发明方法中，第一光源发出的光λ1用于照射样品，使样品台上处于低能级S₀的非荧光样品原子跃迁到高能级激发态S₁，当第三束未经调制的泵浦光λ3照射时便可以受激辐射发出与第三束光波长相同的出射光λ3，光束相应受激辐射到低能级，第二束波长为λ2经过位相板或者空间光调制器调制的光照射到样品平台时，便可使样品产生类似STED损耗光的光λ2。若经过位相板当未经过位相板时，调制函数为时，由德拜积分计算可得，调制后光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个实心光斑。该实心光斑的尺寸与常规光学显微术中所用照明光束聚焦所成衍射斑的尺寸相同。该实心光斑照射范围内的样品所发出的信号光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第一信号光强I₁；当位相板的调制函数为时，由德拜积分计算可得，调制后光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个面包圈型的空心光斑。调制后的光束穿过样品台后分成两路光，该空心光斑照射范围内的样品所发出的信号光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第二信号光强I₂。利用公式I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)计算得到I(x,y)，显然I(x,y)所对应的各扫描点处的有效信号光发光面积将小于I₁(x,y)所对应的各扫描点处的第一信号光发光面积。因此，与常规光学显微方法相比，本发明减小了有效信号光的发光面积，从而可以实现超衍射极限的分辨率。

本发明根据激发光波长λ2和λ3波长之间大小不同对应第一和第二种装置，如果扫描方式由振镜扫描换成平台扫描，又可以对应第三、第四种装置。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)可以在较低的光功率条件下实现超衍射极限的分辨率,结合STED的受激辐射的原理，先用一束光将样品直接激发到高能级，一般FED需要使用荧光标记样品，，可以用于非荧光样品；

(2)对比传统的FED，同时设两个激发光路，可以将空心斑和实心斑分别成像转化为成同时成像，在不改变横向分辨率的同时提高扫描速度。

(3)运用锁相环减小噪声，特定频率的激光器激发的的光束被特定接收频率的探测器接收，减小了噪声，提高分辨率。

附图说明

图1为实施例1中超分辨显微装置的示意图；

图2为第一、第二、第三三束不同波长激光投射样品台的光束跃迁和受激辐射图；

图3为本发明中所成实心光斑的归一化光强分布曲线；

图4为本发明中所成面包圈型空心光斑的归一化光强分布曲线；

图5为本发明中有效信号光光斑与常规光学显微术中信号光光斑的归一化光强分布比较曲线；

图6为实施例2中超分辨显微装置的示意图；

图7为另一实施例中超分辨显微装置的示意图；

图8为另一实施例中超分辨显微装置的示意图。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，一种超分辨显微装置，包括：分别发射波长λ₁、λ₂、λ₃激光器1a、激光器1b和激光器1c，单模光纤2a、单模光纤2b、单模光纤2c，准直透镜3a、准直透镜3b、准直透镜3c，起偏器4a、起偏器4b、起偏器4c，反射镜5，二色镜6、二色镜7，扫描振镜系统8、扫描透镜9、场镜10，1/4波片11、显微物镜12、显微物镜15，0～2π涡旋位相板13(涡旋位相板也可以用空间光调制器SLM替换)，透光样品台14，二色镜16，滤光片17、滤光片21，聚焦透镜18、聚焦透镜22，针孔24、针孔25，探测器19a、探测器19b，锁相环23、锁相环27，信号发生器26，计算机28。

单模光纤2a、单模光纤2b、单模光纤2c，准直透镜3a、准直透镜3b、准直透镜3c，起偏器4a、起偏器4b、起偏器4c依次位于激光器1a、激光器1b、激光器1c对应出射光束的光轴之上；起偏器4a、4b、起偏器4c的透光轴与水平方向平行，反射镜5放置在激光器1a出射的第一光路上与光轴成45度角。

分束镜6、分束镜7依次位于第一路光经反射之后光束的光轴之上。

扫描透镜9、场镜10、1/4波片11、显微物镜12、显微物镜15、样品台14依次位于扫描振镜系统8出射光束的光轴之上，扫描振镜8也可替换为平台扫描。样品台14位于显微物镜12的焦平面附近，显微物镜15与样品台垂直，位于光轴上，在往下的光轴上装有一面二色镜16，方向与光轴成45度角，滤光片17、聚焦透镜18、针孔24、探测器19a分别位二色镜反射光束光轴之上；24位于聚焦透镜18的焦平面处。

滤光片21、聚焦透镜22、针孔25、探测器19b分别位于二色镜透射光束光轴之上，针孔25位于聚焦透镜22的焦平面处。

锁相环27与激光器1b相连，同时锁相环27也连接着探测器19a、函数信号发生器26和计算机28，探测器19b与计算机28相连，信号发生器发出特定频率的激光也会用于调制激光，计算机28与锁相环23、函数信号发生器26以及扫描振镜8、探测器19b相连，用于控制扫描频率。

其中，位相板13也可由空间光调制器(SLM)代替，扫描振镜也可以替换成平台扫描方法。

上述装置中，显微物镜12、显微物镜15的数值孔径NA＝1.4；所用针孔24、针孔25的直径为0.73个艾里斑直径，探测器19a、探测器19b为雪崩光电二极管(APD)。

采用图1所示的装置进行超分辨显微的方法如下：

从第一激光器1a发出的波长为λ₁激光光束，首先被导入第一单模光纤2a，从第一单模光纤2a出射的激光光束，经过第一准直透镜3a完成准直。经过准直后的光束入射到第一起偏器4a转换为线偏振光，之后通过反射镜5进行光路折转。

经反射镜5反射的光束依次透过二色镜6和分束镜7，之后入射到扫描振镜系统8上。经扫描振镜系统8出射的光束依次被扫描透镜9聚焦、场镜10准直，之后通过1/4波片11转换为圆偏振光。圆偏振光束经显微物镜11投射到位于样品台12上的待测样品之上，如配图2所示，使得待测样品上原子跃迁到激发态。

从第二激光器1b发出的激光光束，首先被导入第二单模光纤2b，从第二单模光纤2b出射的激光光束，经过第二准直透镜3b完成准直。经过准直后的光束入射到第二起偏器4b转换为线偏振光，之后通过0～2π涡旋位相板13进行相位调制，0～2π涡旋位相板13也可替换成空间光调制器。

0～2π涡旋位相板13的相位调制函数为：

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

因此，经0～2π涡旋位相板13进行相位调制之后，出射光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，为入射到位相板上的光束在处的电矢量强度，为经过位相板相位调制后的出射光束在处的电矢量强度，i为虚数单位。

由位相板出射的光束经过二色镜6反射，之后通过二色镜7透射，入射到扫描振镜系统8上。经扫描振镜系统8出射的光束依次被扫描透镜9聚焦、场镜10准直，之后通过1/4波片11转换为圆偏振光。圆偏振光束经显微物镜12投射到位于样品台14上的待测样品之上。

入射圆偏振光在显微物镜12的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

$\stackrel{\→}{E}(r_2,{\mathrm{\φ}}_2,z_2)-\mathrm{iC}{\∫\∫}_{\mathrm{\Ω}}\sin \left(\mathrm{\θ}\right)\·A_1(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·A_2(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]\·e^{\mathrm{ikn}(2_z\cos \mathrm{\θ}+r_2\sin \mathrm{\θ}\cos (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_2))}\mathrm{d\θd\φ}$

式中，是以显微物镜12的焦点位置为原点的柱坐标系，代表了处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，是入射光的振幅分布，表征了显微物镜12的结构， $\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]$ 则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

由上式计算可以发现，此时入射的圆偏振光经显微物镜12聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个面包圈型空心光斑，其光场分布与图4所示光斑相同。

由待测样品所出射的信号光被显微物镜15收集，通过二色镜16后，波长为λ₂的光进入右边探测系统，之后依次通过带通滤波器17滤去杂散光，之后经聚焦透镜18聚焦并通过针孔25进行空间滤波，最终被探测器19a所探测。记此时探测器19a探测得到的信号光强值为I₂，将其作为在当前扫描点处的第二信号光强。

激光器1b连接锁相环27，锁相环还连接信号发生器26和对应的探测器19b，探测器19b连接着计算机28。当信号发生器26发出一束特定频率的参考光到锁相环27，锁相环因此调制第二激光器使激光器发出相同频率的激光，此激光经过光路后会被只接收相同频率的相应探测器接收19a，探测器19a接收后的数据传输到计算机28，从而实现高分辨率，低噪声。同理第三激光器和它对应的锁相环、探测器。

通过计算机28调节扫描振镜系统8，实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第二信号光强I₂(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标。

从第三激光器1c发出的激光光束，首先被导入第一单模光纤2c，从第一单模光纤2c出射的激光光束，经过第一准直透镜3c完成准直。经过准直后的光束入射到第一起偏器4c转换为线偏振光，再通过二色镜7反射后入射到扫描振镜系统8上。经扫描振镜系统8出射的光束依次被扫描透镜9聚焦、场镜10准直，之后通过1/4波片11转换为圆偏振光。圆偏振光束经显微物镜12投射到位于样品台14上的待测样品之上，使得待测样品上受激辐射发出同样波长λ₃光，如配2所示。上述入射圆偏振光在显微物镜12的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定。经计算可以发现，此时入射的圆偏振光经显微物镜12聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个实心光斑，其光场分布与图3所示光斑相同。

待测样品所出射波长为λ₂的信号光被显微物镜15收集，之后依次通过二色镜16后通过带滤光片21滤去杂散光，之后经聚焦透镜22聚焦并通过针孔24进行空间滤波，最终被探测器19b所探测。记此时探测器19b探测得到的信号光强值为I₁，将其作为在当前扫描点处的第一信号光强。

此处锁相环23的应用于第二光路相同，信号发生器产生另一频率的参考光通过锁相环控制激光器，从而使得19b只接收这特定频率的受激辐射光。

通过计算机28调节扫描振镜系统8，实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第一信号光强I₁(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标

利用公式I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y)，并最终得到超分辨显微图像。

本发明中有效信号光光斑与常规共聚焦显微方法中信号光光斑的归一化光强分布曲线比较如图5所示。由图5可以看出，本发明中有效信号光的光斑尺寸(半高全宽值为0.34个波长)较常规共聚焦显微方法中信号光光斑尺寸(半高全宽值为0.41个波长)有所减小，因此本发明方法可以实现超衍射极限的分辨率。

实施例2

当激光器1b、1c发射波长λ₂＝λ₃时，为了有效分开实心光斑和空心光斑，稍微改动原装置采用图6装置进行。

如图6所示的超分辨显微装置，包括：分别发射波长λ₁、λ₂＝λ₃激光器1a、激光器1b、激光器1c，单模光纤2a、单模光纤2b、单模光纤2c，准直透镜3a、准直透镜3b、准直透镜3c，起偏器4a、起偏器4b、起偏器4c，反射镜5，二色镜6，扫描振镜系统8、扫描透镜9、场镜10，1/4波片11、显微物镜12、显微物镜15，0～2π涡旋位相板13(可以替换成空间光调制器)，透光样品台14，滤光片17、滤光片21，反射镜29，聚焦透镜18、聚焦透镜22，针孔24、针孔25，探测器19a、探测器19b，计算机28，锁相环23、锁相环27，分束棱镜30，偏振分束棱镜31，函数信号发生器26。

其中，激光器1b、1c发出的激光波长相同即λ₂＝λ₃，起偏器4b、起偏器4c分别为水平、垂直放置，用于产生不同偏振态的偏振光。分束镜6位于第一路光经反射之后光束的光轴之上。位相板13、分束棱镜30位于激光器1b出射光光轴之上，分束棱镜30下平面与激光器1c出射后经反射镜27反射光路垂直。

与实施例1中的装置原理相同，锁相环23、锁相环27分别与激光器1c、激光器1b以及计算机28、信号发生器26相连，用于调制激光器出射光，计算机28也于扫描振镜系统8以及探测器19b相连，用于控制扫描振镜系统8的扫描，该扫描振镜8也可以替换成平台扫描方式。

本实施例中，显微物镜12、显微物镜15的数值孔径NA＝1.4，所用针孔24、针孔25的直径为0.73个艾里斑直径，探测器19a、探测器19b为雪崩光电二极管(APD)。

采用图6所示的装置进行超分辨显微的方法如下：

从第一激光器1a发出的波长为λ₀激光光束，首先被导入第一单模光纤2a，从第一单模光纤2a出射的激光光束，经过第一准直透镜3a完成准直。经过准直后的光束入射到第一起偏器4a转换为线偏振光，之后通过反射镜5进行光路折转。

经反射镜5反射的光束依次透过二色镜6，之后入射到扫描振镜系统8上。经扫描振镜系统8出射的光束依次被扫描透镜9聚焦、场镜10准直，之后通过1/4波片11转换为圆偏振光。圆偏振光束经显微物镜12投射到位于样品台14上的待测样品之上，使得待测样品上原子跃迁到激发态。

从第二激光器1b发出的激光光束，首先被导入第二单模光纤2b，从第二单模光纤2b出射的激光光束，经过第二准直透镜3b完成准直。经过准直后的光束入射到第二起偏器4b转换为线偏振光，之后通过位相板(或者是空间光调制器)13进行相位调制。

由位相板13出射的光束经过先经过二色镜6反射，入射到扫描振镜系统8或者是扫描平台上。经扫描振镜系统8出射的光束依次被扫描透镜9聚焦、场镜10准直，之后通过1/4波片11转换为圆偏振光。圆偏振光束经显微物镜12投射到位于样品台14上的待测样品之上，形成一个面包圈型空心光斑，其光场分布与图4所示光斑相同。

由待测样品所出射的信号光被显微物镜15收集，通过偏振分束棱镜后，激光器1b发出的光，也就是现在的空心光斑光进入右边探测系统，之后依次通过带通滤波器17滤去杂散光，之后经聚焦透镜18聚焦并通过针孔24进行空间滤波，最终被探测器19a所探测。记此时探测器19a探测得到的信号光强值为I₂，将其作为在当前扫描点处的第二信号光强。

锁相环的运用与实施例1相同，通过计算机28调节扫描振镜系统8，实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第二信号光强I₂(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标。

从第三激光器1c发出的激光光束，首先被导入第一单模光纤2c，从第一单模光纤2c出射的激光光束，经过第一准直透镜3c完成准直。经过准直后的光束入射到第一起偏器4c转换为线偏振光，再通过反射镜29反射后入射分束棱镜30上，反射后经过二色镜6反射到达扫描振镜系统(或是空间光调制器)8。经扫描振镜系统8出射的光束依次被扫描透镜9聚焦、场镜10准直，之后通过1/4波片11转换为圆偏振光。圆偏振光束经显微物镜11投射到位于样品台12上的待测样品之上，使得待测样品上受激辐射发出同样波长λ₃光，如配图2所示。上述入射圆偏振光在显微物镜12的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定。经计算可以发现，此时入射的圆偏振光经显微物镜12聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个实心光斑，其光场分布与图3所示光斑相同。

待测样品所出射波长为λ₃的信号光被显微物镜15收集，之后依次通过偏振分束棱镜最后被反射镜20反射。经反射镜20反射的信号光束通过滤光片21滤去杂散光，之后经聚焦透镜22聚焦并通过针孔24进行空间滤波，最终被探测器19b所探测。记此时探测器19b探测得到的信号光强值为I₁，将其作为在当前扫描点处的第一信号光强。

通过计算机28调节扫描振镜系统8，实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第一信号光强I₁(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标。

利用公式I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y)，并最终得到超分辨显微图像。本发明中有效信号光光斑与常规共聚焦显微方法中信号光光斑的归一化光强分布曲线比较如图5所示。由图5可以看出，本发明中有效信号光的光斑尺寸(半高全宽值为0.34个波长)较常规共聚焦显微方法中信号光光斑尺寸(半高全宽值为0.41个波长)有所减小，因此本发明方法可以实现超衍射极限的分辨率。

本发明中有效信号光光斑与常规共聚焦显微方法中信号光光斑的归一化光强分布曲线比较如图5所示。由图5可以看出，本发明中有效信号光的光斑尺寸(半高全宽值为0.34个波长)较常规共聚焦显微方法中信号光光斑尺寸(半高全宽值为0.41个波长)有所减小，因此本发明方法可以实现超衍射极限的分辨率。

前文中提到，涡旋位相板也可以由空间光调制器(SLM)替换，对应两种稍微改动的装置，这里不累述。

在另外两个实施例中，装置无需振镜扫描，将上述两种装置的平台更换为2维平移样品台，并增加样品台控制系统，装置图分别为图7和图8。

Claims (10)

1.一种基于泵浦-探针技术的超分辨方法，第一光束照射样品并使样品的原子跃迁至激发态，第二光束经相位调制后在样品上形成空心光斑并激发信号光，第三光束在样品上形成实心光斑并激发信号光，其特征在于，控制第三光束的频率为V₁，探测频率为V₁的信号光得到第一信号光强I₁(x,y)，控制第二光路的频率为V₂，探测频率为V₂的信号光得到第二信号光强I₂(x,y)，并计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标，得到超分辨显微图像。

2.如权利要求1所述的基于泵浦-探针技术的超分辨方法，其特征在于，所述的第二光束对应的相位调制函数为：

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

3.如权利要求1所述的基于泵浦-探针技术的超分辨方法，其特征在于，计算有效信号光强I(x,y)的公式为：

I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)

$\mathrm{\γ}=\frac{I_1^{\max }}{2I_2^{\max }}$

其中，为第一信号光强I₁(x,y)中的最大值，为第二信号光强I₂(x,y)中的最大值。

4.如权利要求3所述的基于泵浦-探针技术的超分辨方法，其特征在于，所述的有效信号光强值I(x,y)为负时，设置I(x,y)＝0。

5.如权利要求1所述的基于泵浦-探针技术的超分辨方法，其特征在于，所述的第一光束、第二光束和第三光束具有不同的波长。

6.一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置，包括第一光源、第二光源、第三光源，承载待测样品的样平台，将光线投射到所述样品台的显微物镜，样品台下的显微物镜，两个探测系统，和计算机；其特征在于，设有连接第二光源和第一探测系统的第一锁相器；该第一锁相器用于调控第二光源的发光频率，还用于控制第一探测系统所接受的信号光频率；还设有连接第三光源和第二探测系统的第二锁相器；

所述的计算机用于根据第一探测系统和第二探测系统得到的信号光强，计算有效信号光强，得到超分辨显微图像。

7.如权利要求6所述的基于泵浦-探针技术的超分辨装置，其特征在于，所述的第一锁相器和第二锁相器接入同一信号发生器，该信号发生器用于确定第一锁相器和第二锁相器所调控的光束频率。

8.如权利要求6所述的基于泵浦-探针技术的超分辨装置，其特征在于，所述第二光源的光路上设有涡旋位相板，该涡旋位相板的相位调制函数为：

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

9.如权利要求6所述的基于泵浦-探针技术的超分辨装置，其特征在于，所述第一光源和第二光源发出的激光波长相同，第一光源和第二光源的光路上分别设有水平放置的第一起偏器和垂直放置的第二起偏器。

10.如权利要求6所述的基于泵浦-探针技术的超分辨装置，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。