CN105068232A - 一种双通道结构光照明超分辨成像方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双通道结构光照明超分辨成像方法与装置，包括普通荧光显微镜，还包括光源、第Ⅰ反射镜、第Ⅱ反射镜、第Ⅰ透镜，光阑，第Ⅱ透镜，空间光调制器、第Ⅲ透镜、挡光板、第Ⅳ透镜、第Ⅱ二色镜、第Ⅰ带通滤光片、第Ⅱ带通滤光片、第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器。同时，本发明还公开了基于该成像系统的显微成像方法。该成像系统及成像方法可以在超空间分辨率尺度测量细胞膜上脂筏的多相性。
Description
技术领域
本发明涉及一种双通道结构光照明超分辨成像方法与装置。
背景技术
脂筏在细胞质膜上信号传导中起重要作用，利用荧光显微成像技术直接观察脂筏微结构及其相应细胞功能具有重要意义。由于传统荧光显微镜的分辨率存在衍射极限，无法对脂筏进行检测。近年来发展的一些超分辨成像技术，如受激辐射耗损显微术(STED)、光激活定位显微术(PALM)等最近也开始被用于脂筏研究，然而，它们都只是被用于探测脂筏簇，而无法检测脂筏周围的物理环境。近来发展的一些可通过其发射光谱的变化来反映所处物理环境的环境敏感探针。这类探针需要使用双荧光探测通道同时探测，并结合发射光谱平移来确定和区分细胞膜上液态有序相与无序相。目前，这类探针都只局限于在传统型的双通道荧光显微镜上进行探测，所获得图像的空间分辨率受衍射极限限制。
发明内容
为了解决上述问题，本发明方案提出了一种单光源激发的双通道同时探测的结构光照明超越衍射极限空间分辨率的显微成像方法与装置。利用本方案，可以在亚衍射分辨率尺度实现细胞膜上脂筏多相性的检测。
本发明的第一具体实施方案是：一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，包括光源及用于控制光路方向的沿光传输方向依次设置的第Ⅰ反射镜、第Ⅰ透镜、光阑、第Ⅱ透镜及位于第Ⅱ透镜后侧的能改变结构光照明方向的空间光调制器；
沿所述空间光调制器导出光路方向依次设有第Ⅲ透镜、挡光板、第Ⅳ透镜，所述光调制器导出的光经第Ⅲ透镜受到挡光板阻挡形成仅允许+1级衍射光和-1级光通过的光路；
所述第Ⅳ透镜导出光经一荧光显微镜传输至第Ⅱ二色镜，所述第Ⅱ二色镜光的导出方向分别设置有第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器，所述第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器与第Ⅱ二色镜光之间设有带通滤光片。
进一步的，所述入射到空间光调制器的光入射角度＜10°。
进一步的，所述荧光显微镜包括物镜、样品台以及用于接收第Ⅳ透镜导入光的第Ⅴ透镜，所述第Ⅴ透镜后侧设有接收第Ⅴ透镜导入光并向物镜导入光源及接收样品出射的经物镜导出光的第Ⅰ二色镜，所述第Ⅰ二色镜导出光经第Ⅵ透镜导向所述第Ⅱ二色镜。
进一步的，所述光源为激光器。
本发明的第二具体实施方案是：利用上述的一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置的双通道结构光照明超分辨成像方法，包括以下步骤：
（1）采集相关荧光图像
步骤S1：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为0时，利用第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S2：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为时，利用第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S3：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S4：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为0时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像。
步骤S5：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像。
步骤S6：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像。
（2）重构超分辨率图像步骤：
步骤S1：对图像采集步骤（1）中第Ⅰ探测器采集到的6张原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
步骤S2：对上述图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
步骤S3：由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级，+1级和-1级频谱成像信息；
步骤S4：由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位；
步骤S5：将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的和-1级频谱平移-k0；
步骤S6：将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
步骤S7：对上一步骤得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得第Ⅰ探测器采集的超分辨图像。
步骤S8：对图像采集步骤（1）中第Ⅱ探测器采集到的6张原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
步骤S9：对上述图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
步骤S10：由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级，+1级和-1级频谱成像信息；
步骤S11：由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位；
步骤S12：将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的和-1级频谱平移-k0；
步骤S13：将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
步骤S14：对上一步骤得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得第Ⅱ探测器采集的超分辨图像。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明公开一种双通道结构光照明超分辨成像方法与装置，利用该装置通过合理的采集及重构超分辨率图像方法，克服了现有技术中探针都只局限于在传统型的双通道荧光显微镜上进行探测，所获得图像的空间分辨率受衍射极限限制的缺陷，可以在超空间分辨率尺度测量细胞膜上脂筏的多相性。
附图说明
图1为本发明实施例方案的原理示意图；
图2为本发明实施例提供的双通道结构光照明超分辨显微成像系统在光照方向为90°、相位为0时的空间光调制器的控制图像；
图3为本发明实施例提供的双通道结构光照明超分辨显微成像系统在光照方向为90°、相位为时的空间光调制器的控制图像；
图4为本发明实施例提供的双通道结构光照明超分辨显微成像系统在光照方向为90°、相位为时的空间光调制器的控制图像；
图5为本发明实施例提供的双通道结构光照明超分辨显微成像系统在光照方向为0°、相位为0时的空间光调制器的控制图像；
图6为本发明实施例提供的双通道结构光照明超分辨显微成像系统在光照方向为0°、相位为时的空间光调制器的控制图像；
图7为本发明实施例提供的双通道结构光照明超分辨显微成像系统在光照方向为0°、相位为时的空间光调制器的控制图像；
图中：1-激光器,2-第Ⅰ反射镜,3-第Ⅱ反射镜,4-第Ⅰ透镜,5-光阑,6-第Ⅱ透镜,7-空间光调制器,8-第Ⅲ透镜,9-挡光板,10-第Ⅳ透镜,11-荧光显微镜,12-第Ⅴ透镜,13-第Ⅰ二色镜,14-物镜,15-样品台,16-第Ⅵ透镜,17-第Ⅱ二色镜,18-第Ⅰ带通滤光片,19-第Ⅱ带通滤光片,20-第Ⅰ探测器,21-第Ⅱ探测器。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。
参见附图1，本发明实施例一提供的双通道结构光照明超分辨显微成像系统包括普通荧光显微镜11，普通荧光显微镜11包括依次设置的第Ⅴ透镜12、第Ⅰ二色镜13、物镜14、样品台15、第Ⅵ透镜16。该成像系统还包括光源1、第Ⅰ反射镜2、第Ⅱ反射镜3、第Ⅰ透镜4，光阑5，第Ⅱ透镜6，空间光调制器7、第Ⅲ透镜8、挡光板9、第Ⅳ透镜10、第Ⅱ二色镜17、第Ⅰ带通滤光片18、第Ⅱ带通滤光片19、第Ⅰ探测器20和第Ⅱ探测器21。激光入射到空间光调制器7的入射角度＜10°，挡光板9用于阻挡空间光调制器的0级衍射光而允许+1级衍射光和-1级光通过。
由光源1发射的光依次经过第Ⅰ反射镜2、第Ⅱ反射镜3、第Ⅰ透镜4，光阑5，第Ⅱ透镜6，空间光调制器7、第Ⅲ透镜8、挡光板9、第Ⅳ透镜10后，经过普通物镜14后，激发的荧光经第Ⅱ二色镜17分成两路，一路经第Ⅰ带通滤光片18、第Ⅰ探测器20接收，另一路经第Ⅱ带通滤光片19、和第Ⅱ探测器21接收。
为了深入了解本发明，下面结合附图及具体实施例对本发明进行详细说明。
其中，作为空间光调制器7的一种具体的实现方式，空间光调制器7控制的结构光照明方向包括90°（其三个相位的控制图像分别如图2～4所示）和0°（其三个相位的图像分别如图5～7所示）。
(二)利用上述的一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置的双通道结构光照明超分辨成像方法如下，具体包括图像采集与处理两个部分：
（1）采集相关荧光图像:
步骤S1：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为0时，利用第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S2：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为时，利用第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S3：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S4：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为0时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S5：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像;
步骤S6：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像;
（2）重构超分辨率图像步骤：
步骤S1：对图像采集步骤（1）中第Ⅰ探测器采集到的6张原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
步骤S2：对上述图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
步骤S3：由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级，+1级和-1级频谱成像信息；
步骤S4：由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位；
步骤S5：将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的和-1级频谱平移-k0；
步骤S6：将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
步骤S7：对上一步骤得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得第Ⅰ探测器采集的超分辨图像。
步骤S8：对图像采集步骤（1）中第Ⅱ探测器采集到的6张原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
步骤S9：对上述图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
步骤S10：由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级，+1级和-1级频谱成像信息；
步骤S11：由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位；
步骤S12：将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的和-1级频谱平移-k0；
步骤S13：将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
步骤S14：对上一步骤得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得第Ⅱ探测器采集的超分辨图像。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，包括光源及用于控制光路方向的沿光传输方向依次设置的第Ⅰ反射镜、第Ⅰ透镜、光阑、第Ⅱ透镜及位于第Ⅱ透镜后侧的能改变结构光照明方向的空间光调制器；
沿所述空间光调制器导出光路方向依次设有第Ⅲ透镜、挡光板、第Ⅳ透镜，所述光调制器导出的光经第Ⅲ透镜受到挡光板阻挡形成仅允许+1级衍射光和-1级光通过的光路；
所述第Ⅳ透镜导出光经一荧光显微镜传输至第Ⅱ二色镜，所述第Ⅱ二色镜光的导出方向分别设置有第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器，所述第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器与第Ⅱ二色镜光之间设有带通滤光片。
2.根据权利要求1所述的一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述入射到空间光调制器的光入射角度＜10°。
3.根据权利要求1所述的一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述荧光显微镜包括物镜、样品台以及用于接收第Ⅳ透镜导入光的第Ⅴ透镜，所述第Ⅴ透镜后侧设有接收第Ⅴ透镜导入光并向物镜导入光源及接收样品出射的经物镜导出光的第Ⅰ二色镜，所述第Ⅰ二色镜导出光经第Ⅵ透镜导向所述第Ⅱ二色镜。
4.根据权利要求1所述的一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述光源为激光器。
5.一种利用如权利要求3所述的一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置的双通道结构光照明超分辨成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采集相关荧光图像：
步骤S1：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为0时，利用第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S2：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为时，利用第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S3：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S4：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为0时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S5：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
步骤S6：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；
（2）重构超分辨率图像步骤：
步骤S1：对图像采集步骤（1）中第Ⅰ探测器采集到的6张原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
步骤S2：对上述图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
步骤S3：由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级，+1级和-1级频谱成像信息；
步骤S4：由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位；
步骤S5：将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的和-1级频谱平移-k0；
步骤S6：将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
步骤S7：对上一步骤得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得第Ⅰ探测器采集的超分辨图像；
步骤S8：对图像采集步骤（1）中第Ⅱ探测器采集到的6张原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
步骤S9：对上述图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
步骤S10：由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级，+1级和-1级频谱成像信息；
步骤S11：由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位；
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步骤S13：将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |