CN105572044A - 超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法与装置，该装置包括激光器和半导体激光器，所述激光器的激光输出光路依次设有偏振器、第一会聚透镜组、光阑、第一反射镜、空间光调制器、第三会聚透镜、挡光板、第二会聚透镜组和二向色镜，所述二向色镜的反射光输出光路依次设有光学显微镜的物镜和载物台，所述二向色镜的透射光输出光路依次设有滤波片、可切换反射镜、第六会聚透镜和CCD探测器，所述半导体激光器的激光输出光路依次设有第二反射镜、由三维控制器驱动的探针和位置敏感探测器，所述CCD探测器、三维控制器和位置敏感探测器均连接至数据采集控制系统。本发明可实现超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性的信息获取。
Description
技术领域
本发明涉及光学显微成像和原子力扫描成像不同模态成像技术的耦合，特别是一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法与装置。
背景技术
在微纳米尺度上对细胞膜上特定及相关生物学过程进行观察是近年来的热点，普通荧光光学显微术由于对样本具有无损特点，在活细胞显微和检测研究中占据重要位置。然而，由于荧光显微术，包括激光共焦扫描显微术受到衍射极限制约，空间分辨率都只能接近半个波长。为了突破衍射极限（超衍射极限），即空间分辨率在200nm以下，近年来各种超分辨光学成像技术，如受激发射损耗显微术STED、随机光学重建显微术STORM、光活化定位显微术PLAM和结构光照明显微术SIM等应运而生。在上述的几种超分辨光学显微术中，结构光照明显微术SIM是基于对光的照明方式进行改变，即改变系统的光学传递函数，实现分辨率的提高（线性SIM技术分辨率最高可提高1倍，约为四分之一波长）；此外，SIM技术还具有技术方案简单、成本较低、成像速度快、光漂白效应不明显等优点，使其在100nm量级的超衍射分辨率相关研究如细胞膜上微区、细胞微丝、微管等细胞器的光学显微成像中获得青睐。
原子力显微术AFM是扫描探针显微术的一种。它是基于探针针尖与样本表面分子相互作用的原理，具有很高的横向和纵向分辨率（nm量级），可以对样品表面形貌实现精确扫描和成像。在过去的几十年，AFM技术已在材料领域获得了广泛应用。然而原子力探针无特异性识别能力，而SIM则不具备获取纳米量级超微结构相关功能信息的能力。
发明内容
为了实现对特定区域微结构和功能信息的获取，本发明所要解决的技术问题是提供一种将结构光照明显微术SIM和原子力显微术AFM有机融合的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法与装置。
为了解决上述问题，本发明的技术方案是：一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，包括激光器和半导体激光器，所述激光器的激光输出光路依次设置有偏振器、第一会聚透镜组、光阑、第一反射镜、空间光调制器、第三会聚透镜、挡光板、第二会聚透镜组和二向色镜，所述二向色镜的反射光输出光路依次设置有光学显微镜的物镜和载物台，所述二向色镜的透射光输出光路依次设置有滤波片、可切换反射镜、第六会聚透镜和CCD探测器，所述半导体激光器的激光输出光路依次设置有第二反射镜、由三维控制器驱动的探针和位置敏感探测器，所述CCD探测器、三维控制器和位置敏感探测器均连接至数据采集控制系统。
在本发明的进一步技术方案中，所述第一会聚透镜组包含第一会聚透镜和第二会聚透镜。
在本发明的进一步技术方案中，所述第二会聚透镜组包含第四会聚透镜和第五会聚透镜。
在本发明的进一步技术方案中，所述第一反射镜输出的激光束入射到空间光调制器的入射角度应小于10°。
在本发明的进一步技术方案中，所述挡光板是用于阻挡空间光调制器0级衍射光而只允许+1级衍射光和-1级衍射光通过的0级挡光板。
为了解决上述问题，本发明的另一技术方案是：一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法，采用上述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，将样品放置于载物台上，并按以下步骤进行：
（1）SIM成像模态：激光器辐射出的激光依次经过偏振器、第一会聚透镜组、光阑、第一反射镜、空间光调制器、第三会聚透镜、挡光板和第二会聚透镜组，第二会聚透镜组输出的激光束经二向色镜反射后再依次经过物镜和载物台，样品反射回的激光束依次经过载物台和物镜后再经二向色镜透射到滤波片，滤波片过滤后的激光束依次经过可切换反射镜和第六会聚透镜后由CCD探测器接收光信号，最后由数据采集控制系统完成图像采集和数据处理；
（2）AFM成像模态：在实施和完成SIM成像模态后，将数据采集控制系统的工作方式切换到AFM成像模态；在此工作模态下，由数据采集控制系统控制三维控制器使探针接近样品的选定区域，并通过倒置的光学显微镜从底部的方向向上观察探针；由半导体激光器发射出的激光经过第二反射镜后从探针上表面反射到位置敏感探测器；当探针在样品表面扫描，探针会因为与样品之间的相互作用力而弯曲，激光光斑会随之偏移，位置敏感探测器接收到信号，记录下偏移量，通过信号转换相应的生物物理特性参数，并被数据采集控制系统所接收。
在本发明的进一步技术方案中，步骤（1）中的数据采集控制系统按以下步骤进行图像采集：
（1.1）放置好样品后，在三维控制器上装上探针，使针尖略浸入样品的细胞液面，调节激光光斑在位置敏感探测器上的位置；
（1.2）校准探针；
（1.3）选定样品的区域，做光学校准，CCD探测器采集荧光图像；
（1.4）进行亚衍射极限细胞结构的荧光高分辨成像；
（1.5）设置空间光调制器的相位控制图像，在相位φ、φ+Δφ、φ+2Δφ、φ+90°、φ+90°+Δφ和φ+90°+2Δφ控制的结构光照明下，CCD探测器依次采集荧光图像Ⅱ、荧光图像Ⅲ、荧光图像Ⅳ、荧光图像Ⅴ、荧光图像Ⅵ和荧光图像Ⅶ；
（1.6）重构获得超分辨图像Ⅷ；
（1.7）打开半导体激光器，依据超分辨图像Ⅷ，调整探针至样品所选定区域位置或目标；
（1.8）关闭空间光调制器，选用相应AFM工作模式，进行AFM数据采集。
在本发明的进一步技术方案中，步骤（1.5）中的空间光调制器按以下步骤进行设置相位控制图像：
（1.5.1）空间光调制器的相位控制图像设置为0°相位的结构光照明图像，调节偏振器，使得挡光板后的+1级衍射光和-1级衍射光达到最强，CCD探测器采集荧光图像Ⅱ；
（1.5.2）空间光调制器的相位控制图像设置为Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅲ；
（1.5.3）空间光调制器的相位控制图像设置为2Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅳ；
（1.5.4）空间光调制器的相位控制图像设置为90°相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅴ；
（1.5.5）空间光调制器的相位控制图像设置为90°+Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅵ；
（1.5.6）空间光调制器的相位控制图像设置为90°+2Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅶ。
在本发明的进一步技术方案中，步骤（1.5.4）调节偏振器，使得挡光板后的+1级衍射光和-1级衍射光达到最强。
在本发明的进一步技术方案中，步骤（1.6）按以下步骤重构获得超分辨图像VIII：
（1.6.1）对图像采集步骤中CCD探测器采集到的6张原始图像Ⅱ-Ⅶ进行图像亮度均一化处理，以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
（1.6.2）对上述处理后的图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
（1.6.3）由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级、+1级和-1级频谱成像信息；
（1.6.4）由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位φ；
（1.6.5）将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的-1级频谱平移-k0；
（1.6.6）将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
（1.6.7）对步骤（1.6.6）得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得CCD探测器采集的超分辨图像。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明有机融合了结构光照明方式显微术SIM和原子力扫描成像AFM二种不同模态的成像技术，可以实现超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性的信息获取，对纳米生物医学及其相关研究具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例的原理示意图。
图2为空间光调制器0°相位控制的结构光照明图像。
图3为空间光调制器Δφ相位控制的结构光照明图像。
图4为空间光调制器2Δφ相位控制的结构光照明图像。
图5为空间光调制器90°相位控制的结构光照明图像。
图6为空间光调制器90°+Δφ相位控制的结构光照明图像。
图7为空间光调制器90°+2Δφ相位控制的结构光照明图像。
图中标记：1-激光器，2-偏振器，3-第一会聚透镜，4-第二会聚透镜，5-光阑，6-第一反射镜，7-空间光调制器，8-第三会聚透镜，9-挡光板，10-第四会聚透镜，11-第五会聚透镜，12-位置敏感探测器，13-三维控制器，14-第二反射镜，15-半导体激光器，16-探针，17-载物台，18-物镜，19-二向色镜，20-滤波片，21-可切换反射镜，22-第六会聚透镜，23-CCD探测器，24-数据采集控制系统。
具体实施方式
为了让本发明的上述特征和优点更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图，作详细说明如下。
如图1所示，一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，包括激光器1和半导体激光器15，所述激光器1的激光输出光路依次设置有偏振器2、第一会聚透镜组、光阑5、第一反射镜6、空间光调制器7、第三会聚透镜8、挡光板9、第二会聚透镜组和二向色镜19，所述二向色镜19的反射光输出光路依次设置有光学显微镜的物镜18和载物台17，所述二向色镜19的透射光输出光路依次设置有滤波片20、可切换反射镜21、第六会聚透镜22和CCD探测器23，所述半导体激光器15的激光输出光路依次设置有第二反射镜14、由三维控制器13驱动的探针16和位置敏感探测器12，所述CCD探测器23、三维控制器13和位置敏感探测器12均连接至数据采集控制系统24。
在本发明实施例中，所述第一会聚透镜组包含第一会聚透镜3和第二会聚透镜4，所述第二会聚透镜组包含第四会聚透镜10和第五会聚透镜11。
在本发明实施例中，所述第一反射镜6输出的激光束入射到空间光调制器7的入射角度应小于10°。
在本发明实施例中，所述挡光板9是用于阻挡空间光调制器70级衍射光而只允许+1级衍射光和-1级衍射光通过的0级挡光板。
在本发明实施例中，所述数据采集控制系统24为计算机，所述三维控制器13控制探针16移动到XYZ坐标轴上的选定位置。
其中，所述激光器1、偏振器2、第一会聚透镜3、第二会聚透镜4、光阑5、第一反射镜6、空间光调制器7、第三会聚透镜8、挡光板9、第四会聚透镜10、第五会聚透镜11、载物台17、物镜18、二向色镜19、滤波片20、可切换反射镜21、第六会聚透镜22、CCD探测器23和数据采集控制系统24构成了结构光照明方式显微术SIM。
其中，所述位置敏感探测器12、三维控制器13、第二反射镜14、半导体激光器15、探针16、载物台17、物镜18、二向色镜19、滤波片20、可切换反射镜21、第六会聚透镜22、CCD探测器23和数据采集控制系统24构成了原子力扫描成像技术AFM。
如图1~7所示，一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法，采用上述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，将样品放置于载物台17上，并按以下步骤进行：
（1）SIM成像模态：激光器1辐射出的激光依次经过偏振器2、第一会聚透镜组、光阑5、第一反射镜6、空间光调制器7、第三会聚透镜8、挡光板9和第二会聚透镜组，第二会聚透镜组输出的激光束经二向色镜19反射后再依次经过物镜18和载物台17，样品反射回的激光束依次经过载物台17和物镜18后再经二向色镜19透射到滤波片20，滤波片20过滤后的激光束依次经过可切换反射镜21和第六会聚透镜22后由CCD探测器23接收光信号，最后由数据采集控制系统24完成图像采集和数据处理；
（2）AFM成像模态：在实施和完成SIM成像模态后，将数据采集控制系统24的工作方式切换到AFM成像模态；在此工作模态下，由数据采集控制系统24控制三维控制器13使探针16接近样品的选定区域，并通过倒置的光学显微镜从底部的方向向上观察探针16；由半导体激光器15发射出的激光经过第二反射镜14后从探针16上表面反射到位置敏感探测器12；当探针16在样品表面扫描，探针16会因为与样品之间的相互作用力而弯曲，激光光斑会随之偏移，位置敏感探测器12接收到信号，记录下偏移量，通过信号转换相应的生物物理特性参数，并被数据采集控制系统24所接收。
在本发明实施例中，步骤（1）中的数据采集控制系统24按以下步骤进行图像采集：
（1.1）放置好样品后，在三维控制器13上装上探针16，使针尖略浸入样品的细胞液面，调节激光光斑在位置敏感探测器12上的位置；
（1.2）校准探针16；
（1.3）选定样品的区域，做光学校准，CCD探测器23采集荧光图像；
（1.4）进行亚衍射极限细胞结构的荧光高分辨成像；
（1.5）设置空间光调制器7的相位控制图像，在相位φ、φ+Δφ、φ+2Δφ、φ+90°、φ+90°+Δφ和φ+90°+2Δφ控制的结构光照明下，CCD探测器23依次采集荧光图像Ⅱ、荧光图像Ⅲ、荧光图像Ⅳ、荧光图像Ⅴ、荧光图像Ⅵ和荧光图像Ⅶ；
（1.6）重构获得超分辨图像Ⅷ；
（1.7）打开半导体激光器15，依据超分辨图像Ⅷ，调整探针16至样品所选定区域位置或目标；
（1.8）关闭空间光调制器7，选用相应AFM工作模式，进行AFM数据采集。
在本发明实施例中，作为空间光调制器7的一种具体的实现方式，空间光调制器7控制的结构光照明如图2-图4所示（图2-图4的三个相位分别0°、Δφ、2Δφ）和如图5-图7所示（图5-图7的三个相位分别90°、90°+Δφ、90°+2Δφ）。也就是说，步骤（1.5）中的空间光调制器7可以按以下步骤进行设置相位控制图像：
（1.5.1）空间光调制器7的相位控制图像设置为0°相位的结构光照明图像，调节偏振器2，使得挡光板9后的+1级衍射光和-1级衍射光达到最强，CCD探测器23采集荧光图像Ⅱ；
（1.5.2）空间光调制器7的相位控制图像设置为Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器23采集荧光图像Ⅲ；
（1.5.3）空间光调制器7的相位控制图像设置为2Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器23采集荧光图像Ⅳ；
（1.5.4）空间光调制器7的相位控制图像设置为90°相位的结构光照明图像，CCD探测器23采集荧光图像Ⅴ；
（1.5.5）空间光调制器7的相位控制图像设置为90°+Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器23采集荧光图像Ⅵ；
（1.5.6）空间光调制器7的相位控制图像设置为90°+2Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器23采集荧光图像Ⅶ。
在本发明实施例中，根据偏振器2的不同而不同，若选用1/4λ波片，只要步骤（1.5.1）调节+1级衍射光和-1级衍射光光强；若选用普通偏振器，换一次模式光方向调整一次+1级衍射光和-1级衍射光光强。也就是说，所述偏振器2为普通偏振器时，步骤（1.5.4）也调节偏振器2，使得挡光板9后的+1级衍射光和-1级衍射光达到最强。
在本发明实施例中，步骤（1.6）可以按以下步骤重构获得超分辨图像VIII：
（1.6.1）对图像采集步骤中CCD探测器23采集到的6张原始图像Ⅱ-Ⅶ进行图像亮度均一化处理，以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
（1.6.2）对上述处理后的图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
（1.6.3）由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级、+1级和-1级频谱成像信息；
（1.6.4）由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位φ；
（1.6.5）将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的-1级频谱平移-k0；
（1.6.6）将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
（1.6.7）对步骤（1.6.6）得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得CCD探测器23采集的超分辨图像。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可以得出其他各种形式的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法与装置。凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (10)
1.一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，其特征在于，包括激光器和半导体激光器，所述激光器的激光输出光路依次设置有偏振器、第一会聚透镜组、光阑、第一反射镜、空间光调制器、第三会聚透镜、挡光板、第二会聚透镜组和二向色镜，所述二向色镜的反射光输出光路依次设置有光学显微镜的物镜和载物台，所述二向色镜的透射光输出光路依次设置有滤波片、可切换反射镜、第六会聚透镜和CCD探测器，所述半导体激光器的激光输出光路依次设置有第二反射镜、由三维控制器驱动的探针和位置敏感探测器，所述CCD探测器、三维控制器和位置敏感探测器均连接至数据采集控制系统。
2.根据权利要求1所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，其特征在于：所述第一会聚透镜组包含第一会聚透镜和第二会聚透镜。
3.根据权利要求1或2所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，其特征在于：所述第二会聚透镜组包含第四会聚透镜和第五会聚透镜。
4.根据权利要求1所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，其特征在于：所述第一反射镜输出的激光束入射到空间光调制器的入射角度应小于10°。
5.根据权利要求1或4所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，其特征在于：所述挡光板是用于阻挡空间光调制器0级衍射光而只允许+1级衍射光和-1级衍射光通过的0级挡光板。
6.一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法，其特征在于，采用权利要求1至5中任一项所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取装置，将样品放置于载物台上，并按以下步骤进行：
（1）SIM成像模态：激光器辐射出的激光依次经过偏振器、第一会聚透镜组、光阑、第一反射镜、空间光调制器、第三会聚透镜、挡光板和第二会聚透镜组，第二会聚透镜组输出的激光束经二向色镜反射后再依次经过物镜和载物台，样品反射回的激光束依次经过载物台和物镜后再经二向色镜透射到滤波片，滤波片过滤后的激光束依次经过可切换反射镜和第六会聚透镜后由CCD探测器接收光信号，最后由数据采集控制系统完成图像采集和数据处理；
（2）AFM成像模态：在实施和完成SIM成像模态后，将数据采集控制系统的工作方式切换到AFM成像模态；在此工作模态下，由数据采集控制系统控制三维控制器使探针接近样品的选定区域，并通过倒置的光学显微镜从底部的方向向上观察探针；由半导体激光器发射出的激光经过第二反射镜后从探针上表面反射到位置敏感探测器；当探针在样品表面扫描，探针会因为与样品之间的相互作用力而弯曲，激光光斑会随之偏移，位置敏感探测器接收到信号，记录下偏移量，通过信号转换相应的生物物理特性参数，并被数据采集控制系统所接收。
7.根据权利要求6所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法，其特征在于，步骤（1）中的数据采集控制系统按以下步骤进行图像采集：
（1.1）放置好样品后，在三维控制器上装上探针，使针尖略浸入样品的细胞液面，调节激光光斑在位置敏感探测器上的位置；
（1.2）校准探针；
（1.3）选定样品的区域，做光学校准，CCD探测器采集荧光图像；
（1.4）进行亚衍射极限细胞结构的荧光高分辨成像；
（1.5）设置空间光调制器的相位控制图像，在相位φ、φ+Δφ、φ+2Δφ、φ+90°、φ+90°+Δφ和φ+90°+2Δφ控制的结构光照明下，CCD探测器依次采集荧光图像Ⅱ、荧光图像Ⅲ、荧光图像Ⅳ、荧光图像Ⅴ、荧光图像Ⅵ和荧光图像Ⅶ；
（1.6）重构获得超分辨图像Ⅷ；
（1.7）打开半导体激光器，依据超分辨图像Ⅷ，调整探针至样品所选定区域位置或目标；
（1.8）关闭空间光调制器，选用相应AFM工作模式，进行AFM数据采集。
8.根据权利要求7所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法，其特征在于，步骤（1.5）中的空间光调制器按以下步骤进行设置相位控制图像：
（1.5.1）空间光调制器的相位控制图像设置为0°相位的结构光照明图像，调节偏振器，使得挡光板后的+1级衍射光和-1级衍射光达到最强，CCD探测器采集荧光图像Ⅱ；
（1.5.2）空间光调制器的相位控制图像设置为Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅲ；
（1.5.3）空间光调制器的相位控制图像设置为2Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅳ；
（1.5.4）空间光调制器的相位控制图像设置为90°相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅴ；
（1.5.5）空间光调制器的相位控制图像设置为90°+Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅵ；
（1.5.6）空间光调制器的相位控制图像设置为90°+2Δφ相位的结构光照明图像，CCD探测器采集荧光图像Ⅶ。
9.根据权利要求8所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法，其特征在于：步骤（1.5.4）调节偏振器，使得挡光板后的+1级衍射光和-1级光达到最强。
10.根据权利要求7所述的超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法，其特征在于：步骤（1.6）按以下步骤重构获得超分辨图像VIII：
（1.6.1）对图像采集步骤中CCD探测器采集到的6张原始图像Ⅱ-Ⅶ进行图像亮度均一化处理，以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；
（1.6.2）对上述处理后的图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；
（1.6.3）由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级、+1级和-1级频谱成像信息；
（1.6.4）由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位φ；
（1.6.5）将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的-1级频谱平移-k0；
（1.6.6）将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
（1.6.7）对步骤（1.6.6）得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得CCD探测器采集的超分辨图像。
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