CN109154715A - 用于即时内部反射荧光/结构化照明显微术的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了涉及用于即时结构化显微术的系统和方法的实施例，其中全内反射荧光技术用于改善结构化照明显微术的光学切片和信噪比。

Description

用于即时内部反射荧光/结构化照明显微术的系统和方法
技术领域
本公开一般涉及即时(instant)结构化照明显微术(SIM)，并且具体涉及用于即时结构化照明显微术的系统和方法，其中全内反射荧光(TIRF)技术可被用于改善光学切片和信噪比。
背景技术
当高度倾斜的光照射(impinge)在折射率边界(第一介质折射率为n1并且第二介质折射率为n2，其中n1>n2)上时，发生全内反射。根据斯涅尔定律，n1sin(θ1)＝n2sin(θ2)，其中θl是入射光的角度(从表面法线测量)，并且θ2是折射光的相应出射角。对于θ2＝π/2，θl＝arcsin(n2/n1)是“临界角”。任何处于或超过该临界角的光线都被“全内反射”，并且没有光通过界面传播到该边界的较低折射率侧的远场中。然而，消逝(evanescent)波存在于该边界的界面处，并且可以激发n2侧的距该边界的距离为λ(激发波长)内的荧光分子。该消逝波用于TIRF中，以生成盖玻片边界处或盖玻片边界附近的荧光标记的样本(诸如细胞膜)的非常高对比度、高信噪比的图像。
设置TIRF条件的便利方法是：使用高数值孔径物镜(通常为1.4NA或更高，使得可以对具有n2约为1.33(其为细胞的折射率)的水性样本进行成像)，并且确保只有边缘光线通过物镜的后焦平面。这种“物镜侧TIRF”在细胞生物学应用中已经非常成功，其已被使用了数十年。
结构化照明显微术(SIM)是一种使用尖锐(sharply)图案化的光以及图像的后处理来增强图像分辨率(以其线性形式，加倍分辨率)的方法。在传统的SIM中，使用相机获取一系列图像并对其进行计算处理以改善分辨率。这种SIM实施方案也已经与TIRF结合，但是该实施方案相对于正常的TIRF显微术而言仍然需要9个原始图像，从而相对于传统的衍射受限成像减慢了9倍的获取。因此，需要一种将SIM与TIRF条件相结合的方法，该方法相对于传统的TIRF显微术不会导致速度损失。
考虑到这些观察，构思和开发了本公开的各个方面。
附图说明
图1是示出根据本公开的方面的具有径向孔径挡块的即时TIRF/SIM系统的第一实施例的简化图示；
图2是示出根据本公开的方面的具有数字微镜器件的即时TIRF/SIM系统的第二实施例的简化图示；
图3是示出根据本公开的方面的反射光线和消逝波对即时TIRF/SIM系统的影响的图示；
图4是示出根据本公开的方面的具有与径向孔径挡块组合的空间光调制器的即时TIRF/SIM系统的第三实施例的简化图示；
图5是示出根据本公开的方面的具有旋转盘实施方式的即时TIRF/SIM系统的第四实施例的简化图示；
图6是示出根据本公开的方面的即时TIRF/SIM系统的第一实施例的工作模型的图示；
图7A-7C示出了根据本公开的方面的用即时TIRF/SIM系统拍摄的各种图像，并且图7D和7E是示出了对比线轮廓的图形表示。
图8A-8H示出了根据本公开的方面的用即时TIRF/SIM系统在数百个时间点上对质膜分布附近的蛋白质分布拍摄的各种图像；
图9A-9D显示了根据本公开的方面的用即时TIRF/SIM系统对转染到U2OS细胞中的Rab11拍摄的各种图像；
图10A-10I示出了根据本公开的方面的常规显微术与即时TIRF/SIM系统之间的激发和发射图案的对比；
图11A-11C示出了根据本公开的方面的对放置在荧光染料中的二氧化硅珠的消逝场衰减长度的估计；
图12A-12D示出了根据本公开的方面的常规即时SIM系统与即时TIRF/SIM系统之间的对比图像；
图13A-13F示出了根据本公开的方面的常规SIM系统与即时TIRF/SIM系统之间的对比代表性珠图像；
图14A和14B示出了根据本公开的方面的即时TIRF/SIM系统的生物分辨率标准；
图15A和15B示出了根据本公开的方面的常规SIM系统与即时TIRF/SIM系统的对比图像；
图16A-16D是根据本公开的方面的跟踪粒子的总位移和平均速度的直方图；
图17A和17B示出了根据本公开的方面的图示出时间欠采样对自动跟踪的影响的图像；
图18是示出具有多个焦点的多焦点图案的简化图示；和
图19是示出缩放操作的简化图示，该缩放操作对由样本发射的多焦点荧光图案产生的合焦荧光发射进行缩放。
对应的附图标记表示附图中的对应元件。附图中使用的标题不限制权利要求的范围。
具体实施方式
本文公开了用于将全内反射荧光(TIRF)应用于即时结构化照明显微术(SIM)的系统和方法。在一些实施例中，即时TIRF/SIM系统包括位于与物镜的后焦平面共轭的平面处的径向孔径挡块(block)，因此仅允许来自激光源的高角度边缘环形光束来激发样本。在一些实施例中，即时TIRF/SIM系统的第一实施例的径向孔径挡块用数字微镜器件(DMD)来代替，从而改变消逝波以允许轴向上的特征的约nm定位。在一些实施方案中，空间光调制器(SLM)被用来改变激发的相位，以在样本处最佳地引起消逝的、图案化的激发。在一些实施例中，径向孔径挡块与旋转盘装置结合，该旋转盘装置包括具有会聚微透镜的一对旋转盘，该对旋转盘被布置有具有针孔的旋转盘，以产生由样本发射的荧光焦点的收缩的非倒置图像。SLM、DMD、旋转盘装置和孔径挡块的组合也是可能的。即时TIRF/SIM系统的各种实施例允许在非常高的信噪比(SNR)下进行高速、超分辨率显微术，用于在盖玻片表面约200nm内(例如，消逝波衰减长度)距离内的生物应用。参考附图，图示了即时TIRF/SIM系统的实施例，并且在图1-19中总体上表示为100、200、300和400。
参考图1，标记为100的即时TIRF/SIM系统的第一实施例实现了径向孔径挡块110，该径向孔径挡块110位于与物镜124的后焦平面共轭的平面处，因此仅允许边缘(marginal)环形(annular)激发光束通过，以用于扫描到样本125上，如图1所示。在该实施例中，即时TIRF/SIM系统100包括激发源102，例如激光器部件，其生成激发光束104，该激发光束104传输通过第一微透镜阵列106。第一微透镜阵列106将激发光束104分成激发焦点的阵列104A。第一透镜108位于远离第一微透镜阵列106的焦点的一个焦距处。此外，径向孔径挡块110位于第一透镜108的前焦平面处，以阻挡从第一透镜108出射的中心光线，从而仅允许从第一透镜108出射的高角度边缘光线104B通过径向孔径挡块110。
成像望远镜布置(arrangement)包括与第三透镜114对齐的第二透镜112，其共同对通过径向孔径挡块110的边缘光线104B成像。第二透镜112和第三透镜114对边缘光线104B成像，以通过二向色(dichroic)镜116并到达双面检流计镜118上。在一些实施例中，第二透镜112和第三透镜114以它们各自的焦距之和相隔开。检流计镜118重定向(redirect)并且扫描边缘光线104B以通过与管(tube)透镜122对齐的第四透镜120，并到达高数值孔径物镜124的后焦平面上。这种光学布置产生结构化照明，该结构化照明不会传播到样本125中，而是用由物镜124成像到样本125上的边缘光线104B来消逝地激发样本125。由于边缘光线以超过临界角的角度照射在样本上，因此它们不会传播到样本中，而是仅引起在样本内呈指数衰减的消逝波。(由径向环形挡块110产生的高角度光线引起的)消逝、(由微透镜阵列106引起的)图案化/结构化照明的组合在样本处引起非常尖锐/高对比度的激发。在一些实施例中，物镜124可具有大于1.4NA的数值孔径(即，大于样本125的折射率)，诸如1.65NA或1.70NA。
由样本125生成的、由检流计镜118扫描的结果(resulting)激发105产生图案化荧光发射105A，该图案化荧光发射105A可以以落射(epi)模式被收集，然后随荧光发射105A被与检流计镜118对准(align)的物镜124、管透镜122和第四透镜120的布置成像而被检流计镜118富集扫描(descan)。然后，由样本125发射的荧光发射105A经由对荧光发射105A重定向的二向色镜116而从结果激发105中被分离。
在一些实施例中，第五透镜126位于距检流计镜118一个焦距处。第五透镜126聚焦被富集扫描的荧光发射105A通过第二微透镜阵列128。在一些实施例中，第二微透镜阵列128具有与第一微透镜阵列106相同的俯仰角/图案和透镜间隔，使得荧光发射105A局部收缩(contract)成收缩的荧光发射105B，而不倒置或改变相邻荧光发射105A之间的相对距离，如图18和19所示的。
当收缩的荧光发射105B局部收缩时，“收缩因子”取决于激发光束104和荧光发射105A的相应波长以及径向孔径挡块110的特性，并且在大多数情况下，可以设定在近似为2的值。例如，在图18和19中示出了用于可以局部收缩成收缩的荧光发射105B的荧光发射105A的多焦点图案170。在一个实施例中，多焦点图案170可以包括布置在特定多焦点图案170中的多个焦点172，该特定多焦点图案170由多个光束限定，其中每个多焦点图案170限定多个光束的焦点的不同布置，使得多焦点图案170使对于焦点172的给定密度的情况下的任何两个最近焦点172之间的距离最大化，从而使串扰(crosstalk)最小化。如本文中使用的，术语“串扰”是指附近光束引起来自其他焦点的激发和荧光的能力，从而看起来像是焦点源自所讨论的焦点。在扫描操作中，每个多焦点照明图案中的多个光束被光栅化到被照明的样本125上，使得样本125发射多个荧光发射。在对多个荧光发射重定向的富集扫描操作中，由样本125发射的荧光发射被光栅化，以在聚焦操作中去除失焦(out-of-focus)荧光发射。在聚焦操作中，失焦荧光发射被阻挡，并且仅允许合焦(in-focus)荧光发射通过以用于处理。
然后，使用缩放操作来缩放由每个多焦点图案引起的合焦荧光发射，该缩放操作按预定因子局部地收缩每个荧光发射。在图19中所示的缩放操作的一个实施例中，发生了单个多焦点图案170中引起的荧光焦点172的局部收缩。例如，在多焦图案170中，荧光焦点172A和172B分别到缩放的荧光焦点172A'和172B'的局部收缩为使得：无论施加到多焦点图案170的荧光焦点172的缩放程度如何，荧光焦点172A和172B的几何中心175之间的距离500以及荧光焦点172A和172B的距离502都保持不变。换言之，缩放操作150在保持每个荧光焦点之间的相对距离相同的同时，局部地收缩荧光焦点172。
返回参照图1，在一些实施例中，第六透镜132位于相对的第一镜130和第二镜134之间。第六透镜132位于距收缩的荧光发射105B和检流计镜118一个焦距处，并用作将收缩的荧光发射105B傅里叶变换到检流计镜118上。在这种布置中，检流计镜118和第七透镜138用于重扫描(rescan)在检测器组件140(诸如相机)上形成图像的、收缩的荧光发射105B，以捕捉图像。
在一些实施例中，发射滤波器136可插入在第二镜134与检流计118之间，以从收缩的荧光发射105B移除任何残余的结果激发105。
参考图2，标记为200的即时TIRF/SIM系统的另一实施例用数字微镜器件210替换径向孔径挡块110，从而改变消逝波以允许轴向方向上的特征的约nm定位。在该实施例中，即时TIRF/SIM系统200包括激发源202，例如激光器组件，其生成被透射并通过第一微透镜阵列206的激发光束204。第一微透镜阵列206将激发光束204分成激发焦点的阵列204A。第一透镜208位于远离第一微透镜阵列206的焦点一个焦距处。如上所述，数字微镜器件210而不是径向孔径挡块110，可以与第一微透镜阵列206连通。在一些实施例中，数字微镜器件210位于第一透镜208的前焦平面处，以阻挡从第一透镜208出射的除了高角度边缘光线104B之外的所有光线。换言之，除了沿数字微镜器件210的周边(periphery)的那些像素之外，数字微镜器件210的所有像素都被设置为将低角度中心光线反射出轴，从而以类似于径向挡块孔径110的方式，有效地去除低角度中心光线以不照射样本225。通过改变在该反射区域中像素的数量和面积，透射边缘光线104B的程度也可以变化，最终对应于改变样本225处的消逝场的厚度。
在一些实施例中，成像望远镜布置包括与第三透镜214对齐的第二透镜212，其共同地对边缘光线204B成像，以通过二向色镜216并到达双面检流计镜218上。在一些实施例中，第二透镜212和第三透镜214以它们各自焦距的总和的距离隔开。检流计镜218沿着第三轴404对边缘光线204B重定向并且成像以通过与管透镜222对齐的第四透镜220，并且到达高数值孔径物镜224的后焦平面上。这种布置产生结构化照明，该结构化照明不会传播到样本225中，而是用由物镜224成像到样本225上的边缘光线204B来消逝地激发样本224。在一些实施例中，物镜224可具有大于1.4N的数值孔径，诸如1.65NA或1.70NA。
样本225的结果激发205产生图案化荧光发射205A，该图案化荧光发射205A可以以落射模式被收集，然后随荧光发射205A被物镜224、管透镜222和第四透镜220成像到检流计镜218上而被检流计镜218富集扫描。然后，荧光发射205A经由对荧光发射205A重定向的二向色镜216而从结果激发105中被分离。
在一些实施例中，第五透镜226位于距检流计镜218的一个焦距处。第五透镜226将被富集扫描的荧光发射205A聚焦通过第二微透镜阵列228。在一些实施例中，第二微透镜阵列228具有与第一微透镜阵列206相同的俯仰角/图案和透镜间隔，使得荧光发射205A局部收缩成收缩的荧光发射205B中，而不倒置或改变相邻荧光发射205A之间的相对距离。
当收缩的荧光发射205B局部收缩时，收缩因子取决于激发光束204和荧光发射205A的相应波长以及数字微镜器件210上显示的图案的特征，并且如上所述，可被设置为近似于2的值。在一些实施例中，第六透镜232位于相对的第一镜230和第二镜234之间，其与第一轴400、第三轴404和第四轴406垂直。第六透镜232位于距收缩的荧光发射205B和检流计镜218一个焦距处，并用作将收缩的荧光发射205B傅里叶变换到检流计镜218上。在这种布置中，检流计218和第七透镜238用于重扫描在检测器组件240(诸如相机)上形成图像的收缩的荧光发射205B，以捕捉图像。
在即时TIRF/SIM系统300的一些实施例中，激发微透镜阵列106可以被空间光调制器304或其他元件代替，其使激发光束303的相位能够被操纵，同时还在样本324处生成图案化的照明。通过在空间光调制器304上生成适当的图案，可以使否则由于高角度环形结构化照明的相互作用而会产生的不希望的干扰最小化。空间光调制器304的正面被成像到样本324上，如图4所示的光学系统所示。所有其他光学器件与图1中示出的即时TIRF/SIM系统100的第一实施例相同或相似。在一个实施例中，由图3的空间光调制器304产生的激发图案需要具有与图1的第二微透镜阵列128相同的俯仰角。
参照图4，标记为300的即时TIRF/SIM系统的第三实施例实现了径向孔径挡块308，该径向孔径挡块308位于与物镜322的后焦平面共轭的平面处，因此仅允许边缘环形激发光束303B通过，以用于扫描到样本324。替代地，径向孔径挡块308可以由数字微镜器件(未示出)代替，并且能够实现附加功能(即，在z方向上的nm定位)。在该实施例中，即时TIRF/SIM系统300包括激发源302，例如激光器组件，其生成激发光束303，激发光束303被透射到空间光调制器304上，空间光调制器304将激发光束303分成激发焦点的阵列303A。第一透镜306位于远离空间光调制器304的焦点一个焦距处。此外，径向孔径挡块308位于第一透镜306的前焦平面处，以阻挡从第一透镜306出射的中心光线303C，从而仅允许从第一透镜306出射的高角度边缘光线303B通过径向孔径挡块308。
成像望远镜布置包括与第三透镜312对齐的第二透镜310，其共同对通过径向孔径挡块308的高角度边缘光线303B成像。第二透镜310和第三透镜312对高角度边缘光线303B成像，以通过二向色镜314并到达双面检流计镜316上。在一些实施例中，第二透镜310和第三透镜312由它们各自的焦距之和隔开。检流计镜316重定向并扫描高角度边缘光线303B以通过与管透镜320对齐的第四透镜318，并且到达高数值孔径物镜322的后焦平面上。这种光学布置产生结构化照明，该结构化照明不会传播到样本324中，而是用由物镜322成像到样本324上的边缘光线303B来消逝地激发样本324。由于高角度边缘光线303B以超过临界角的角度照射在样本324上，因此高角度边缘光线303B不会传播到样本324中，而是仅引起在样本324内呈指数衰减的消逝波。(由径向环形挡块308产生的高角度边缘光线303B引起的)消逝波在样本324处产生非常尖锐/高对比度的激发。在一些实施例中，物镜322可具有大于1.4NA的数值孔径(即大于样本的折射率)，诸如1.65NA或1.70NA。
由样本324生成的、由检流计镜316扫描的结果激发305产生图案化荧光发射305A，该图案化荧光发射305A可以以落射模式被收集，然后随荧光发射305A被与检流计镜316对准的物镜322、管透镜320和第四透镜318的布置成像而被检流计镜316富集扫描。然后，荧光发射305A经由对荧光发射305A重定向的二向色镜314而从结果激发305中被分离。
在一些实施例中，第五透镜326位于距检流计镜316的一个焦距处。第五透镜326聚焦被富集扫描的荧光发射305A通过微透镜阵列328。在一些实施例中，微透镜阵列328具有使得荧光发射305A局部收缩成收缩的荧光发射305B、而不倒置或改变相邻荧光发射305A之间的相对距离的俯仰角/图案和透镜间隔。
当收缩的荧光发射305B局部收缩时，“收缩因子”取决于激发光束303和荧光发射305A的相应波长、空间光调制器304上显示的图案、以及径向孔径挡块308的特性，并且在大多数情况下，可以被设置为值2。在一些实施例中，第六透镜334位于相对的第一镜和第二镜330与332之间。第六透镜334位于距收缩的荧光发射305B和检流计镜316的一个焦距处，并用于将收缩的荧光发射305B傅立叶变换到检流计镜316上。在这种布置中，检流计镜316和第七透镜338用于重扫描在检测器组件340(诸如相机)形成图像的、收缩的荧光发射305B，以捕捉图像。
在一些实施例中，发射滤波器336可插入在第二镜332与检流计316之间，以从收缩的荧光发射305B移除任何残余的结果激发305。
参考图5，标记为400的即时TIRF/SIM系统的第四实施例实现了即时TIRF/SIM系统400的旋转盘布置。在该实施例中，即时TIRF/SIM系统400包括激发源402，例如激光器部件，其生成激发光束403，该激发光束403通过会聚微透镜的第一旋转盘404透射，该会聚微透镜的第一旋转盘404产生多个激发焦点403A，其中激发焦点403A覆盖样本418的整个成像场。如图所示，在一些实施例中，第一透镜406与第二透镜412形成望远镜布置，第二透镜412在多个激发焦点反射出位于第一透镜406和第二透镜412之间的二向色镜410之后，将多个激发焦点中继到中间像平面407，该第一透镜406位于远离多个激发焦点403A的一个焦距处。此外，径向孔径挡块408位于第一透镜406与第二透镜412之间的共焦点处，以便过滤低角度激发焦点403A，该低角度激发焦点403A否则会产生亚临界(sub-critical)的、传播的激发焦点到样本418中。如上所述，径向孔径挡块408阻挡从第一透镜406出射的激发焦点403A的中心光线，从而仅允许从第一透镜406出射的高角度边缘光线403B通过径向孔径挡块408。
如进一步所示，高角度边缘光线403B经由由管透镜414和物镜416的布置形成的望远镜，从中间像平面407被中继到样本418。物镜416可以具有比样本418的折射率更高的NA，例如，数值孔径大于1.33，以确保产生TIRF条件。在一些实施例中，可以选择第二透镜412和管透镜414的焦距和位置，使得径向孔径挡块408被成像到物镜416的后焦平面。一旦由高角度边缘光线403B照射样本418，由样本418发射的荧光发射405以落射模式被收集，并且通过第二透镜412然后通过第三透镜422(在通过二向色镜410之后)中继到旋转针孔盘424，该旋转针孔盘424具有与带有会聚微透镜的第一旋转盘404相同的俯仰角/间隔。旋转针孔盘424用于抑制散射的荧光发射405和荧光发射405中的不需要的旁瓣(sidelobe)。在荧光发射405通过旋转针孔盘424之后，带有会聚微透镜的第二旋转盘426被用于使用图18和19所示的缩放操作、以近似为2的收缩因子来局部收缩荧光发射405的每个荧光焦点，带有会聚微透镜的第二旋转盘426具有与旋转针孔盘424和第一旋转盘404相同俯仰角/间隔，从而产生收缩的、非倒置的荧光焦点405A。选择第一旋转盘404和第二旋转盘426的相应焦距以及第二旋转盘426的放置，以使荧光发射405的荧光焦点局部收缩所期望程度，而不使荧光焦点相对于样本418的整个图像倒置。最后，收缩的、非倒置荧光焦点405A经由第四透镜428和第五透镜430的最终望远镜布置，被中继到成像相机434。在一些实施例中，发射滤波器432可以放置在发射路径中以抑制激发光。在一些实施例中，第一旋转盘404和第二旋转盘426以及旋转针孔盘424可以串联地(in tandem)旋转，以在单次相机曝光期间产生超分辨率图像。在一些实施例中，当样本418被高角度边缘光线403B照射时，样本418可以被布置在盖玻片420上。
测试结果
参考图6，图示了用于测试即时TIRF/SIM系统100的工作模型。在一些实施例中，即时TIRF/SIM系统100包括一对488nm和561nm的激光器，它们被组合并通过声光可调谐滤波器(AOTF)，以用于遮蔽(shutter)、扩展光束以及空间上滤波(例如，f-45mm和f＝400mm消色差，其中100μm针孔放置在透镜之间的共焦点处)，并且被定向至激发微透镜阵列。另外，不透明的圆形掩模(mask)位于扫描透镜1与扫描透镜2之间的共焦点处(例如，距微透镜阵列产生的激发焦点一个焦距)，所述扫描透镜1与扫描透镜2共同起作用以阻挡亚临界激发光线，从而产生样本的环形照明。为清楚起见，仅示出了在掩模之后由中央微透镜产生的轴上激发焦点。如图所示，扫描透镜2和扫描透镜3在掩模通过补偿片之后，将该掩模中继到双面检流计镜，以减少否则由于激发焦点透射过厚的二向色镜时会导致的散光。与扫描透镜4组合的管透镜用于进一步放大并将掩模中继到高NA物镜(例如，NA＝1.7)的后焦平面。检流计镜的扫描将样本处的TIRF激发图案转换。一旦样本被扫描并照明后，来自样本的荧光发射沿相同光路被收集、从检流计镜被富集扫描、并被从二向色镜反射出去。发射侧光学器件与在即时TIRF/SIM系统100的描述中使用的光学器件几乎相同。注意，图6中所示的距离和光线图是近似渲染。
如上所述，当具有入射角θ≥θc＝arcsin(n2/n1)的高度倾斜的光照射在具有折射率n1和n2(其中n1>n2时)的介质之间的边界上时，实现了TIRF。发明人推论，将环形掩模放置在傅立叶像平面处(光学共轭到物镜的后焦平面)会阻挡所有亚临界光线，从而强制执行TIRF，而不会干扰原始即时SIM系统的速度和功能。环形照明已被用于产生衍射受限和受激发射损耗显微术中的单个TIRF光点(spot)，但对于并行化的即时SIM，仍需要光点的阵列。
发明人通过将环放置在远离由我们的激发微透镜阵列产生的焦点的一个焦距的位置，来创建这样的图案，从而同时滤除每个激发焦点中的低角度光线。所得到的光束通过先前的即时SIM光学组件而被中继到样本，所述先前的即时SIM光学组件包括与物镜的后焦平面共轭的双面检流计镜(1.7数值孔径(NA)透镜，以用于大范围可接近的θ≥θc，以有助于TIRF)。发射光学器件与原始即时SIM装备(方法)几乎相同，并且包括具有如图6所示的适当中继光学器件的针孔微透镜阵列和发射微透镜阵列。
由于环形激发产生具有明显旁瓣(由于激发的类贝塞尔特征)的聚焦光点，发明人担心的是，相邻焦点之间的干涉以及从中心强度最大值到旁瓣的能量转移会显著减少焦平面中的照明对比。实际上，当以TIRF模式荧光对染料成像时，在激发焦点之间观察到大量的背景荧光(尽管仍然要小于在常规成像时观察到的，因为TIRF下的失焦荧光的显著减少)。然而，如图10A-10I所示，单个焦点被锐利地限定，并且外部背景可以用该装备固有的针孔阵列容易地移除。如图11A-11C所示，通过用折射率匹配的二氧化硅珠测量消逝场的深度，测试证实了TIRF在成像过程期间被维持，发现该值为123nm(117nm,129nm，95％置信区间)。固定微管样本的定性对比还表明，图12A-12D的图像中示出了相对于常规的即时SIM而言、TIRF下改进的切片。
测试系统测量了图13A-13F中所示的100nm荧光珠的系统分辨率。仅用扫描的TIRF激发，将荧光珠分辨为249+/-11nm(N＝20个珠)。执行操作(诸如富集扫描、针孔、局部收缩和重扫描)，将表观荧光珠直径减小到194+/-20nm，并在反卷积(10次迭代，Richardson-Lucy反卷积)之后，可以进一步将分辨率提高到115+/-13nm。这些结果类似于使用带有相同物镜的常规照明获得的结果，即，常规的即时SIM暗示了空间分辨率在TIRF中不退化。固定细胞的图像进一步证实了这种渐进的分辨率改善，如图7A-7E所示，因为单独微管具有约128nm的表观宽度(图7D)，并且发明人能够区分间隔为134nm的微管(图7E)。活细胞中的定性测试证实了这种分辨能力(图14A和14B)，由于先前已经用TIRF/SIM分辨出的单独GFP标记的肌球蛋白IIA头部和GFP-FCH02斑点内的空隙(void)区域的细分结构特征被辨别了出来。
该测试使用即时TIRF/SIM系统100来检查活细胞中蛋白质分布的动态性(图8A-8H)。首先，该测试在Jurkat T细胞安置在抗CD3抗体涂覆的盖玻片(图8A)上后，通过对Jurkat T细胞中的3X-EGFP-EMTB成像，在500个时间点记录微管动态性。20Hz的成像速率足以在消逝的TIRF场内容易地跟随细胞基部处的微管束的屈曲、缩短和滑动(图8A)。作为第二个例子，该测试记录了小GTP酶HRas(GTPase HRas)的动态性，该GTP酶HRas被脂化然后被靶向质膜15。在U2OS细胞中，在100个时间点上每0.75秒获取图像(图8C)。有趣的是，GFP-HRas位于质膜处的高度活性微域中(图8C和8D)。该技术的高时空分辨率揭示了这种网状图案的丰富动态性，如测试所观察到的在第二时间尺度上对域的重新组织，包括微域之间的空隙区域的瞬时“填充”(图8D)、以及微域之间的协调的“波状”运动。Ras的分布和动态性都没有先前在活细胞中以这种长度尺度报道过，可能是由于缺乏空间分辨率或光学切片(例如，较低NA的常规即时SIM中，微域是被较差地解决(图15A和15B)。
该测试还对Halotag-HRAS(用Janelia Fluor 54916标记)与GFP-VSVG组合成像(图8E)，突出了即时TIRF SIM在质膜处进行活体双色成像的能力。VSVG示出细胞内部的Ras微域周围的一些定位(图8G)，但发明人还观察到VSVG在细胞边界处的优先富集(preferential enrichment)，特别是在细胞丝状伪足和丝状结构处。在第二个双色实例中，用dsRED-ER对GFP-HRAS成像(图8H)，以标记内质网(ER)。鉴于该技术的光学切片，ER主要表现为一组点状光点和偶尔出现的管，这可能代表邻近于质膜的ER。尽管点状ER结构偶尔与Ras共定位，但蛋白质分布大多不同并且表现出与它们在细胞内的差异定位和功能一致的不同动态性。该技术的空间分辨率证明有助于解决与更稳定的ER触体相邻的Ras微团簇的裂变，这种现象否则会被衍射所遮蔽(图8I)。
该测试允许活细胞中细胞内(intracelluar)钙通量、肌动蛋白和肌球蛋白IIB动态性的可视化。这些例子都强调了即时TIRF SIM能够实现与感兴趣的动态性良好地匹配的超分辨率成像的能力，或者是匹配或者是超越更经典的TIRF SIM系统所提供的图像采集率。
然而，即时SIM中的关键优势是以更快的帧速率成像的能力，因为超分辨率图像是在单个相机曝光中形成的。为了说明这种能力，该测试在37℃下、以100Hz对U2OS细胞中的GFP-Rab11成像。该成像速率足以对980 Rab11装饰粒子的快速运动进行可视化和跟踪(图9A)。对跟踪运动的分析揭示了，在我们的6秒成像时段内，大多数粒子经历了小于1μm的位移；然而，观察到数十个粒子示出了更大的位移(图16A-16D)。观察到，行进更远的粒子也行进得更快，其中平均速度大于1μm/s(图16A-16D)，并且在一些情况下瞬时速度超过10μm/s(图9D和9F)。在图9B和9C中所示的单个粒子级的更细分析也揭示了粒子运动的定性差异，其中一些粒子经历扩散运动，如通过线性均方位移(MSD)vs.时间所揭示的，并且其他粒子示出了超线性MSD vs.时间(图9E)，其中图9D示出了的定向运动的来回(bout)。注意到，以较慢的帧速率成像会人为地缩短跟踪长度，从而提供基础(underlying)运动的不太准确的表示(图17A和17B)。
即时TIRF-SIM系统100提供比经典TIRF-SIM系统根本上更快的操作，因为仅需要获取一个图像，而不是获取标准的九个。与其他方法相比，该实现的其他优点包括：较少的读取噪声(因为获取的图像较少)和较少的计算处理(该方法仅需要原始图像的简单反卷积，而不是傅立叶空间中的大量图像处理)。
虽然我们报告的空间分辨率(约115nm)比先前现有技术的线性TIRF-SIM所声称的要低约40％，但是即时TIRF-SIM已有实现方案要更快约50倍，如图9通过以高达100Hz的帧速率成像来证明所示的。
方法-即时TIRF-SIM
即时TIRF SIM 100使用1.7N物镜(Olympus，APON100XHOTIRF)以用于激发和检测。当成像到折射率为1.33的水性样本中时，1-(1.33/1.7)＝0.22的物镜后焦平面直径(dBFp)对于TIRF来说是可用的，这意味着在直径0.78*dBFP＝0.78*2*NAOBJ*fOBJ＝0.78*2*1.7*1.8mm＝4.77mm内的亚临界照明光线必须被阻挡。其次，中继系统被插入至即时SIM的激发臂中以阻挡这些光线。来自488nm和561nm激光器的激发被组合，并如前所述被光束扩展，并定向至微透镜阵列(Amus，f＝6mm，微透镜之间的间隔为222mm，1mm厚，25mm直径，抗反射涂层超过400-650nm，APO-Q-P222-F6(633)+CHR)，以产生激发焦点的阵列。该测试使用以4f配置被放置的一对匹配的扫描透镜(扫描透镜1和2，f＝190mm，Special optics，55-S190-60-VIS)，以将这些激发焦点中继到光学系统的其余部分，在扫描透镜之间的焦点(以及由微透镜阵列产生的激发焦点的傅里叶平面)处插入不透明的圆形掩模(Photosciences，2.68毫米直径铬圆，其中在4”×4”×0.090”石英晶圆上光学密度为5)以过滤亚临界光线。给定了掩模与物镜的后焦平面之间350mm/190mm＝1.84倍放大的情况下，掩模被设计成阻挡中心2.68mm*1.84＝4.93mm的照明直径。恰好在掩模之后放置的光圈确保光束的外径为约3.33mm，其是被放大到3.33*1.84＝6.13mm、或约为dBFP的直径，从而减少否则会落在物镜后焦平面的杂散光。通过将不透明掩模置于3轴平移台上(Thorlabs，LT3，用于在后焦平面上正确地定位掩模图像)，以及将微透镜阵列置于单轴平移台上(Thorlabs，LNR50M，用于将激发焦点精确定位在物镜的焦平面处)，非常有助于不透明掩模和微透镜阵列的对准。被拧(screw)入物镜转台的对准标线(Leica)被用来进一步检查，环形照明图案是否被合适地定位(与物镜的光轴同心)并且被聚焦在我们物镜的后焦平面上。
在发射路径中，光学器件与先前的即时SIM设计相同，除了使用了具有较大针孔的针孔阵列(Photosciences，0.090”厚的石英上的铬，222μm的针孔间隔，50μm的针孔直径)以及具有较长焦距的(f＝1.86mm，Amus，APO-Q-P222-F1.86(633))发射侧微透镜阵列。样本与我们的科学级互补金属氧化物半导体相机(PCO-TECH，pco.edge 4.2)检测器之间的总放大倍数为350mm/1.8mm＝194.4，得出图像像素尺寸为33.4nm。这些元件如图6所示。
在紧邻物镜之前，测量激发激光功率。取决于样本，平均功率范围为0.2-2mW，这意味着强度范围为约7-70W/cm2(给定58μm×52μm的视场)。
将样本沉积在20mm直径的高折射率盖玻片(Olympus，9-U992)上，该盖玻片被设计用于与1.7NA透镜一起使用。将盖玻片安装在附接于显微镜载物台的磁性室(Live CellInstrument，CM-B20-1)中。为了将温度保持在37℃，将磁性室装在孵育室(Okolab，H301-MINI)内。
估计消逝场深度
发明人使用两种方法，来估计消逝场深度。第一种，使用分析方法。对于在具有折射率n1和n2(n1>n2)的界面上以角度θ1照射的波长λ的激发，消逝场的强度I沿着光轴以衰减常数d衰减，根据I(z)＝I0exp(-z/d)，其中d＝λ/(4π)(n1 2sin2(θ1)-n2 2)-0.5。术语n1 2sin2(θ1)等于'有效'NA的平方，在我们的示例中为小于等于1.7。如果考虑环形激发中的最小角度(对应于掩模中使用的内半径，并产生具有最长衰减长度的消逝波)，此有效NA为4.93/6.12*NAOBJ＝1.37。假设n2＝1.33且λ＝488nm，得到d＝118nm。如果考虑最大角度(对应于外环半径，产生具有最短衰减长度的消逝波)，该有效NA为NAOBJ＝1.7，得出d＝37nm。通过这些简单的计算，“平均”衰减因此介于37nm至118nm之间，并由环形激发中的强度分布进行加权。
由于难以精确地测量这种强度分布，发明人代替地选择使用置于荧光素染料(Fluka，Cat#32615)溶液中的二氧化硅珠(直径7.27μm，折射率1.42，，BangsLaboratories)来更直接地测量平均消逝衰减长度(图11A)。在该方法中，珠的已知直径被用于将用TIRF观察到的表观半径转换成轴向深度z(图11B)。在先前的工作之后，发明人将从盖玻片表面到某个深度z，对强度I(z)进行积分，因为其对应于每个深度处的观察信号F(z)。首先，发明人假设通过两个指数之和良好地对荧光建模。第一项对应于从“纯”TIRF推导的信号(具有衰减d)，并且第二项对被已知为污染物镜型TIRF的散射进行建模(具有衰减D)：
I(z)＝Aexp(-z/d)+Bexp(-z/D),
其中A和B是考虑入射光束强度、浓度和散射项的相对加权的常数。整合此表达式得出：
F(z)＝Ad(1-exp(-z/d)+BD(1-exp(-z/D).
用Matlab曲线拟合工具箱，将在每个深度(在每个珠半径处得到)处测量的荧光强度拟合到该表达式(图11C)，得到d＝123nm，具有95％置信区间(117nm，129nm)。散射幅度B代表信号的约24％。
数据处理
反卷积
除非另有说明，否则对该测试中呈现的数据进行反卷积，以进一步增强空间分辨率。在反卷积之前，从原始图像中减去背景。通过将在没有照明的情况下获得的100个“暗”图像进行平均，来估计背景。对于反卷积，发明人使用Richardson-Lucy算法，使用2D PSF来模糊(blur)：
对于l＝1，2，…N
通过记录并然后对20个100nm黄绿色珠的图像取平均，来实验性地推导PSF。反卷积在MATLAB 2017a中实现，迭代次数N设置为10。
跟踪
为了跟踪Rab11数据集中的粒子(图9A-9F)，发明人使用TrackMate Image JPlugin(https://imagei.net/TrackMate)，进行半自动跟踪。对于粒子检测，使用高斯差分(DoG)检测器，其中估计的斑点(blob)直径为0.3μm，并且初始质量阈值为120。粒子被进一步过滤，并与简单线性分配问题(LAP)链接器链接。将链接最大距离和间隙闭合最大距离设置为0.3μm，并且将最大帧间隙设置为5。为了在整个图像上进行跟踪(图9A-9F)，手动调整链接滤波器，以滤除明显的虚假跟踪。然后在插件界面中执行手动编辑，以改进跟踪结果。对于用于下采样分析的裁剪区域(图17A和17B)，在时域中对图像进行5次和10次的下采样。然后，对裁剪后的图像(100Hz)和下采样图像(20Hz和10Hz)独立执行自动跟踪，无需手动调整链接滤波器或链接。
根据粒子轨迹(即，表示每个跟踪粒子在每个时间点的位置的坐标的序列)，发明人计算了若干定量度量，包括：位移、距离、瞬时速度、平均速度以及均方位移(MSD)。
给定由N个时间点以及在第i个时间点的粒子坐标pi–(xi，yi)所组成的轨迹，任意两个点pi和pj之间的距离被定义为欧几里德范数：
d(pi,pj)＝||pi-pj||
从起始点(第一个时间点)，计算出在第j个时间点所行进的总距离，并该总距离被定义为：
并且，位移(幅度)、也称为净距离为
Fj＝d(pi,pj)
然后，整个轨迹的总距离是DN，并且整个轨迹的总位移是FN。
瞬时速度被定义为：
其中△t是两个连续时间点之间的时间间隔。瞬时速度也是行进距离Dj的导数。
然后将平均速度计算为瞬时速度的平均值：
均方位移被计算为
漂白剂校正
对于若干延时(time-lapse)数据集(图8A-8H和图9A-9F)，发明人使用ImageJ插件(漂白校正(Bleach Correction)，https://imaqei.net/Bleach Correction)，利用“简单比率”法，来执行标准漂白校正。
平场处理
由于激发激光束的空间上不均匀的轮廓，在激发被扫描时，常规TIRF-SIM和即时TIRF-SIM 100二者中的激发强度都是不均匀地平坦而分布的。所扫描的激发分布在视场中心具有最高强度，并且在垂直于扫描方向的距离增加时减小。在一些数据集中(图8A-8H、图9A-9F、图14A-14B、图16A-16D和图17A-17B)，试图对激发强度中的这种变化进行归一化(“平场处理(flat fielding)”)，该测试对100个薄荧光素层的图像取平均，对垂直于扫描方向的平均值平滑，并在反卷积之前将原始数据除以该平滑后的平均值。
样本制备
固定样本
为了对固定样本内的微管成像(图7A-7E)，首先将高折射率盖玻片浸入70％乙醇中约1分钟，并使其在无菌细胞培养罩中风干。U2OS细胞在未被涂覆的高折射率盖玻片上生长，直至约50％的融合(confluency)。将整个盖玻片在预冷至-20℃的甲醇中浸没3分钟以固定细胞。然后将盖玻片在室温PBS中充分洗涤，然后在室温下在抗体稀释缓冲液(Abdil；PBS溶液中，1％BSA，0.3％Triton-X 100)中封闭1小时。在Abdil中使用1/500mg/ml的小鼠抗α-微管蛋白(Thermo Scientific#62204)，在4℃下进行第一(primary)抗体染色过夜。在Abdil中使用1/200mg/ml的山羊抗小鼠Alexa 488(Invitrogen A1 1001)，在室温下进行第二(secondary)抗体染色1-2小时。
活Jurkat T细胞
将高折射率盖玻片用70％乙醇冲洗，并用过滤空气干燥。然后将载玻片在Poiy-L-Lysine(PLL)中以0.01％W/V(Sigma Aidrich，St.Louis，MO)进行温育10分钟。抽出(aspirate)PLL溶液，使盖玻片在37℃下干燥1小时。接下来，将盖玻片与2μg/ml的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen)在37℃温育1小时，并用PBS洗涤过量的链霉抗生物素蛋白。通过将载玻片在10μg/ml的生物素标记的抗CD3抗体(OKt3，eBiosciences，San Diego，CA)溶液中在37℃下温育2小时，来进行T细胞活化抗体涂覆。在紧邻实验之前，通过用L-15成像培养基洗涤，来除去过量的抗体。在实验两天之前，使用Neon(Thermofisher Scientific)电穿孔系统，用EMTB-3XGFP(图8A和8B)或F-tractin EGFP质粒，来瞬时地转染E6-1Jurkat T细胞。EMTB-3XGFP是来自William Bement的附赠物(Addgene质粒#26741)，而pEGFP-C1Ftractin-EGFP是来自Dyche Mullins的附赠物(Addgene质粒#58473)。
活U2OS细胞
Ras、Rab、VSVG、ER成像
在DMEM(Life technologies)加10％FBS(Hyclone)中，在37℃、5％CO2下，将人类骨肉瘤U2OS细胞按例程地传代(passage)。为了在活细胞成像之前进行清洁，将高折射率盖玻片用蒸馏水煮沸5分钟，用蒸馏水彻底冲洗，并在90％乙醇中储存至少2小时。为了促进细胞粘附，将盖玻片用FBS在37℃下涂覆2小时。在转染前一天，将细胞以约60％的密度接种在清洁的盖玻片上。使用Turbofect(Life Technologies)以3：1的比例(脂质体：DNA)，用合适的质粒转染细胞。第二天，用不含酚红的新鲜DMEM加10％FBS替换培养基，其也被用作成像培养基。为了监测野生型Ras动态性，本发明人使用EGFP-H-Ras(图8C和8D；图15A和15B)，或者如果用VSVG-GFP成像的话(Addgene#1 1912)(图8E-8G；图15A和15B)，该测试使用H-Ras的HaloTag嵌合体(Dominic Esposito，NCI的附赠物)。使用Janelia Fluor549(LukeLavis，Janelia Research Campus的附赠物)，以100nM的最终浓度标记Halotag蛋白15分钟。标记之后，用普通DMEM冲洗细胞两次，用新鲜培养基加10％FBS培养20分钟，最后用新鲜的无酚红DMEM加10％FBS来替换培养基。对于GFP标记的Rab11Addgene#12674，跟随了RabGTP酶的动态性(图9A-9F；图15A-15B；和图16A-16D)。对于Ras和内质网的双重标记，本发明人共转染(co-transfect)GFP-H-Ras构建体与pDsRed2-ER(Clontech，分类号632409)(图8H和8I)，其携带KDEL ER保留信号。
肌球蛋白成像
对于肌球蛋白IIA的成像(图14A)，将高折射率盖玻片用等血浆清洁(PDC-001，Harrick Plasma)5分钟，然后在PBS(ThermoFisher)中用10μg/ml人血浆纤连蛋白(Millipore，cat。#FC010)涂覆。将U2OS细胞在补充有10％胎牛血清(ThermoFisher)的McCoys培养基(Invitrogen)中，在37℃、5％CO2下培养。如前所述，用GFP-肌球蛋白IIA表达和mApple-F-tractin质粒来转染细胞，并在接种于纤连蛋白涂覆的盖玻片之前培养12小时。
肌动蛋白成像
对于肌动蛋白的成像，将U2OS细胞在含有10％胎牛血清、1％Pen/Strep和GlutaMAXTM(ThermoFisher)的高葡萄糖DMEM培养基(ThermoFisher)中，在5％CO2存在下，于37℃下进行培养。将细胞接种在高折射率盖玻片上，并用Lifeact转染。
从前述内容应当理解，虽然已经说明和描述了特定实施例，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行各种修改，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些变化和修改在所附权利要求中限定的本发明的范围和教导内。

Claims (38)

1.一种用于结构化照明显微术的系统，包括：
光源，其用于生成激发光束；
第一微透镜阵列，其用于将激发光束分成激发焦点的阵列；
第一透镜，其沿第一轴对准并且位于远离所述第一微透镜阵列的焦点一个焦距处，所述第一透镜对所述激发焦点的阵列聚焦；
径向孔径挡块，其沿第一轴对准，位于所述第一透镜的前焦平面处，所述径向孔径挡块被配置为阻挡所述激发焦点的阵列的多个低角度中心光线，同时允许所述激发焦点的阵列的多个高角度边缘光线通过所述径向孔径挡块，其中高角度边缘光线由所述第一透镜沿高角度聚焦，并且低角度中心光线由所述第一透镜沿低角度聚焦；
检流计镜，其被对准并定位以用于重定向并扫描高角度边缘光线通过物镜，所述物镜用以沿样本聚焦被重定向的高角度边缘光线，从而由所述样本生成激发，然后来自所述样本的激发被重扫描以在第二微透镜阵列上生成图案化荧光发射，所述第二微透镜阵列用以将所述图案化荧光发射局部收缩成荧光发射的收缩图案；以及
镜布置，其用于将收缩的图案化荧光发射重定向到检测器上，所述检测器用以检测由所述样本发出的图案化荧光发射。
2.根据权利要求1所述的系统，还包括：
第二透镜和第三透镜，所述第二透镜和第三透镜位于所述径向孔径挡块与二向色镜之间，其中所述第二透镜和第三透镜共同将所述高角度边缘光线成像到所述检流计镜上。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述高角度边缘光线消逝地激发所述样本。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述径向孔径挡块位于与所述物镜的后焦平面共轭的平面处。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述图案化荧光发射被所述检流计镜富集扫描。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述第二微透镜阵列具有与所述第一微透镜阵列相同的俯仰角/图案和透镜间隔。
7.根据权利要求1所述的系统，还包括：
二向色镜，其与所述第一微透镜阵列、所述检流计镜和所述第二微透镜阵列连通，以允许所述高角度边缘光线直接通过所述二向色镜，或者允许所述图案化荧光发射从所述检流计镜重定向到所述第二微透镜阵列。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述镜布置包括一对镜，该对镜用于将收缩的图案化荧光发射从所述第二微透镜阵列重定向到所述检流计镜，以扫描到所述检测器上。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述镜布置还包括位于该对镜之间的第四透镜，所述第四透镜用于执行对收缩的图案化荧光发射的傅里叶变换。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述第四透镜位于距所述检流计镜一个焦距处。
11.根据权利要求8所述的系统，其中发射滤波器位于该对镜与所述检流计镜之间，以用于在由所述检测器检测之前从收缩的图案化荧光发射中去除任何残余激发。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述图案化荧光发射的局部收缩基于收缩因子，所述收缩因子由所述激发光束和所述图案化荧光发射的相应波长以及所述径向孔径挡块的物理特性进行设置。
13.根据权利要求11所述的系统，其中所述收缩因子被设置为近似2的值。
14.根据权利要求7所述的系统，其中所述二向色镜将所述图案化荧光发射从由所述样本生成的激发中分离。
15.根据权利要求1所述的系统，其中所述检流计镜是双面检流计镜。
16.一种用于结构照明显微术的系统，包括：
光源，其用于生成激发光束；
第一微透镜阵列，其用于将激发光束分成激发焦点的阵列；
第一透镜，其沿第一轴对准并且位于远离所述第一微透镜阵列的焦点一个焦距处，所述第一透镜对所述激发焦点的阵列聚焦；
数字微镜器件，其位于所述第一透镜的前焦平面处，所述数字微镜器件可操作为相对于由所述数字微镜器件限定的轴，将所述激发焦点的阵列的多个低角度中心光线反射出轴，使得只有由所述第一透镜沿高角度聚焦的高角度边缘光线不被所述数字微镜器件反射；
检流计镜，其被定位以用于重定向并扫描高角度边缘光线通过物镜，以沿样本聚焦被重定向的高角度边缘光线，从而由所述样本生成激发，然后来自所述样本的激发被所述检流计镜重扫描，以在第二微透镜阵列上生成图案化荧光发射，所述第二微透镜阵列用以将所述图案化荧光发射局部收缩成收缩的图案化荧光发射；以及
镜布置，其用于将收缩的图案化荧光发射重定向到检测器上，所述检测器用于检测由所述样本发出的图案化荧光发射。
17.根据权利要求1所述的系统，其中所述数字微镜器件包括多个像素，并且其中所述数字微镜器件可操作使得所述多个像素的数量被设定，以建立将所述低角度中心光线反射出轴的反射区。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述反射区中的多个像素的数量和位置被改变，使得所述样本处的消逝场的厚度也被改变。
19.根据权利要求16所述的系统，其中所述检流计镜将所述高角度边缘光线扫描到物镜的后焦平面上，所述物镜产生消逝地激发所述样本的结构化照明。
20.根据权利要求19所述的系统，其中所述物镜具有大于1.4(或所述样本的折射率)的数值孔径。
21.一种用于结构化照明显微术的系统，包括：
光源，其用于生成激发光束；
空间光调制器，其用于控制所述激发光束的相位，以生成激发焦点的阵列，其中每个激发焦点之间的干扰最小；
第一透镜，其位于远离所述空间光调制器的焦点一个焦距处，所述第一透镜对所述激发焦点的阵列聚焦；
径向孔径挡块，其沿第一轴对准，位于所述第一透镜的前焦平面处，所述径向孔径挡块被配置为阻挡所述激发焦点的阵列的多个低角度中心光线，同时允许所述激发焦点的阵列的多个高角度边缘光线通过所述径向孔径挡块，其中高角度边缘光线由所述第一透镜沿高角度聚焦，并且低角度中心光线由所述第一透镜沿低角度聚焦；
检流计镜，其被对准并定位以用于重定向并扫描高角度边缘光线通过物镜，所述物镜用以沿样本聚焦被重定向的高角度边缘光线，从而由所述样本生成激发，然后来自所述样本的激发被重扫描以在微透镜阵列上生成图案化荧光发射，所述微透镜阵列用以将所述图案化荧光发射局部收缩成收缩的图案化荧光发射；以及
镜布置，其用于将收缩的图案化荧光发射重定向到检测器上，所述检测器用于检测由所述样本发出的图案化荧光发射。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述径向孔径挡块位于与所述物镜的后焦平面共轭的平面处。
23.根据权利要求21所述的系统，其中所述空间光调制器可操作为将所述激发光束分成激发焦点的阵列。
24.根据权利要求21所述的系统，还包括：
望远镜布置，其包括与第三透镜对齐的第二透镜，以共同将通过所述径向孔径挡块的高角度边缘光线成像到所述检流计镜上。
25.根据权利要求21所述的系统，其中高角度边缘光线以超过临界角的角度照射在所述样本上，所述高角度边缘光线不传播到所述样本中，使得仅产生在所述样本内指数地衰减的消逝波。
26.一种用于结构化照明显微术的系统，包括：
光源，其用于生成激发光束；
第一旋转盘，其具有多个具有第一俯仰角和间隔的会聚微透镜，所述第一旋转盘与所述光源连通，以将所述激发光束转换成多个激发焦点，其中所述多个激发焦点覆盖样本的整个成像场；
第一透镜，其与第二透镜处于望远镜布置，所述第二透镜将所述多个激发焦点中继到中间像平面；
径向孔径挡块，其位于所述第一透镜与所述第二透镜之间的焦点处，所述径向孔径挡块可操作为阻挡所述多个激发焦点的低角度中心光线，同时允许所述多个激发焦点的高角度边缘光线通过所述径向孔径挡块，其中高角度边缘光线由所述第一透镜沿高角度聚焦，并且低角度中心光线由所述第一透镜沿低角度聚焦；
二向色镜，其位于所述第一透镜与所述第二透镜之间，以重定向所述多个高角度边缘光线通过物镜，所述物镜用以沿着所述样本聚焦被重定向的高角度边缘光线，从而由所述样本生成荧光发射；
旋转针孔盘，其与所述二向色镜连通，所述旋转针孔盘包括具有所述第一旋转盘的俯仰角和间隔的多个针孔，所述旋转针孔盘可操作用于接收由所述样本发出的荧光发射，并阻挡失焦发射或散射光；以及
第二旋转盘，其具有位于所述旋转针孔盘与所述样本之间的多个会聚微透镜，以用于接收透射通过所述旋转针孔盘的荧光发射，具有会聚微透镜的第二旋转盘可操作为将荧光发射局部收缩成收缩的非倒置荧光发射。
27.根据权利要求26所述的系统，其中所述物镜具有比所述样本的折射率高的数值孔径。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述物镜具有大于1.33的数值孔径。
29.根据权利要求26所述的系统，还包括：
插入在所述中间像平面与所述物镜之间的管透镜。
30.根据权利要求29所述的系统，其中所述管透镜和所述物镜共同形成望远镜布置。
31.根据权利要求26所述的系统，还包括：
第四透镜，其与第五透镜处于望远镜布置，所述第四透镜和第五透镜位于所述样本与具有会聚微透镜的第二旋转盘之间。
32.根据权利要求26所述的系统，还包括：
发射滤光器，其位于具有会聚微透镜的第二旋转盘和相机之间，所述发射滤光器可操作为抑制激发光。
33.根据权利要求26所述的系统，其中具有会聚微透镜的第一旋转盘和第二旋转盘以及所述旋转针孔盘共同地串联旋转。
34.根据权利要求33所述的系统，其中在所述检测器的单个相机曝光期间，具有会聚微透镜的第一旋转盘和第二旋转盘以及所述旋转针孔盘的串联旋转产生超分辨率图像。
35.根据权利要求26所述的系统，还包括：
与所述第二旋转盘连通的检测器，所述检测器用于检测收缩的非倒置荧光发射。
36.根据权利要求35所述的系统，其中所述收缩的非倒置荧光发射在落射模式下被检测。
37.根据权利要求26所述的系统，其中以近似为2的收缩因子将所述荧光发射局部收缩为收缩的非倒置荧光发射。
38.根据权利要求26所述的系统，其中具有会聚微透镜的第二旋转盘具有与具有会聚微透镜的第一旋转盘相同的俯仰角和间隔。
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