KR20140068264A - 다초점 간섭 이미지 획득 - Google Patents

Abstract

샘플 전체에 걸쳐 상이한 심도들과 연관된 3차원 (3D) 샘플의 여러 물체 평면들의 동시적인 이미징을 위한 현미경 기반 시스템 및 방법. 본 시스템은, 각각 대응하는 물체 평면의 이미지와 연관된 복수의 광학 채널들을 생성하도록 구성된 다초점 광학 부분, 및 대응하는 공간 분포로 광의 이미지 형성 빔의 스펙트럼 분포를 변환하도록 구성된 스텍트럼 선택적 부분을 포함한다. 검출기에 의해 기록된 이미지는 물체 평면의 이미지 및 공간적으로 코딩된 스펙트럼 분포의 이미지를 포함한다. 본 방법은 여러 물체 평면들의 동시적인 멀티스펙트럼 이미징을 달성한다. 요구되는 데이터 획득 시간은, 종래 멀티스펙트럼 현미경 기반 이미징 시스템에 의해 소요되는 것보다 여러배 더 짧다.

Description

다초점 간섭 이미지 획득{POLYFOCAL INTERFEROMETRIC IMAGE ACQUISITION}

본 발명은 이미지 획득에 관한 것이고, 보다 상세하게는, 3차원 공간 해상도에 의해 특성화되는, 생물학적 샘플의 이미지들을 제공하는 다초점 하이퍼스펙트럼 이미징 시스템 및 방법에 관한 것이다.

예를 들면, 생물학적 조직의 병리 검사에 사용되는 현미경과 같은 종래 광학 이미징 시스템에 의한 이미지 획득은 제한된 피사계 심도 (depth of field) 를 갖는다. 3차원 조직편을 나타내는 이미징 데이터를 획득하기 위하여, 종래 이미지 획득 시스템은, 샘플의 상이한 심도 (depth) 에서 광학 이미징 시스템을 (z-축과 같은 광학 축을 따라) 리포커싱하거나, 또는, 광학 시스템의 초점 길이가 고정되어 있는 경우에, 조직 샘플에 대한 광학 시스템을 재배치하여 조직 샘플의 상이한 심도들의 연속적인 이미징을 허용하도록 구성되어 상이한 심도들에 위치된 샘플의 층들이 이미징되고 있도록 보장하여야 한다. 후자의 경우에, 광학 이미징 시스템은, 예를 들면, 국부 광학 축을 따라 옵틱스 (optics) 의 전기기계 조절기 등의 자동화된 재배치 유닛을 포함하는 정교한 자동화된 현미경을 필요로 할 수도 있다.

상황은, 형광 스펙트럼 이미징과 같이, 스펙트럼적으로 해상된 이미징이 문제가 될 때 더욱 더 복잡해지는데, 왜냐하면 하이퍼스펙트럼 이미지 (hyperspectral image) 들의 세트를 구축하기 위하여 상이한 파장들에서 조직 샘플의 주어진 층의 다중 연속 노출들을 취할 필요가 있어지기 때문이다. 이 후자는 불가피하게 적어도, 증가된 획득 시간, 조직 샘플에서 리포터 (reporter) 분자들의 과노출에 (조명에) 기인하여 감소된 형광, 및 그러한 감소를 보상하기 위해 노출을 증가시킬 필요성, 그리고 증가된 컴퓨터 프로세싱 시간 및 큰 컴퓨터 저장 용량의 필요성의 면에서, 이미지 획득의 비용들을 증가시킨다. 그러므로, 품질이 전술된 문제들에 의해 떨어지지 않는 하이퍼스펙트럼 이미지 획득의 방법 및 시스템이 요망된다.

본 발명의 실시형태들은, 현미경 기반 이미징 장치로 생물학적 조직의 멀티스펙트럼 이미징에서 사용을 위한 시스템, 방법 및 컴퓨터 프로그램 제품을 제공하는 것이다.

그러한 생물학적 조직을 이미징하는 방법의 일 실시형태는, 현미경으로부터, 조직과 연관된 광을 수신하는 단계 및 이 광을, 상이한 대응하는 유효 광학 파워 (effective optical power) 들을 갖는 상이한 광학 채널들을 따라, 공간적으로 재지향 (redirecting) 시키는 단계를 포함한다. 그 실시형태는, 이들 광학 채널들에 의해 형성된 조직의 이미지들로 광검출기의 조리개 (aperture) 를 충전하도록 하는 그러한 방식으로 광검출기로 광학 채널들의 각각을 통해 투과된 광을 검출하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 상이한 광학 채널들을 통과하는 광에 의해 형성된 이미지들은, 상이한 이미지 평면들에서 형성되고, 전체적으로, 조직의 이미징된 체적 (imaged volume) 을 정의하는 조직의 상이한 평면들을 나타낸다. 상이한 광학 채널들을 따라 현미경으로부터 수신된 광을 공간적으로 재지향시키는 단계는, 국부 광학 축에 대해 나선 및 계단형 관계로 배치된 반사기들로 이 광을 분할하는 단계를 포함할 수도 있다. 그 실시형태는, 스펙트럼적으로 필터링된 광을 형성하도록 광학 필터 시스템으로 현미경으로부터 수신된 광을 필터링하는 단계를 더 포함할 수도 있고, 그의 스펙트럼적으로 상이한 성분들은, 옵션적으로, 공간적으로 분산될 수도 있고, 시간적 시퀀스에서 또는 단일 시점에서 (병렬적으로) 광검출기에 의해 검출된다. 특정 실시형태에서, 스펙트럼 필터링이, 선택된 등거리 파장들에서 스펙트럼적으로 필터링된 광의 세기는 동일한 등거리 파장들에서 현미경의 입력에서 수신된 광의 세기보다 더 크도록, 수행된다. 특정 실시형태에서, 등거리 파장들은, 그들 사이의 거리가, 옵션적으로, 스펙트럼적으로 조정가능한 (spectrally-tunable) 광학 필터 시스템의 광학 특성에 의해 정의되도록 선택된다.

다른 실시형태는, 병리 샘플의 체적 이미징 (volumetric imaging) 방법을 제공하고 그 방법은, (i) 병리 샘플의 체적 (volume) 을 정의하는 물체 평면 (object plane) 들로부터 나오는 광을 수신하는 단계 및 (i) 이 광이 공간적으로 상이한 광학 채널들을 통해 투과된 후에 광검출기로 수신된 광을 검출하여, 그 광검출기의 인접하는 부분들 상에 형성된 물체 평면들의 이미지들을 포함하는 체적 이미지 (volumetric image) 를 형성하도록 하는 단계를 포함한다. 체적 이미지는 옵션적으로, 물체 평면들로부터 나오는 광의 스펙트럼 콘텐트 (spectral content) 을 나타내는 간섭 무늬 (interferometric fringe) 를 포함할 수도 있다. 상이한 광학 채널들은 상이한 유효 초점 길이들을 가진다. 특정 실시형태에서, 물체 평면들로부터 수신된 광은 광학 필터를 통해 필터링될 수도 있고, 이는 옵션적으로 조정가능하고 그의 스펙트럼 투과 특성은 로렌치안 (Lorentzian) 함수들의 시리즈에 의해 나타내어진다. 그 실시형태는, 수신된 광의 스펙트럼 콘텐트를 결정하기 위하여 체적 이미지의 지오메트릭 파라미터들의 분석을 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 실시형태들은 또한 광학 이미징 장치를 제공한다. 일 실시형태에서, 예를 들면, 그러한 광학 이미징 장치는, 물체로부터 광을 수신하고, 스펙트럼 선택적 광학 시스템과 광학적으로 통신하는 입력부를 포함하고, 그 스펙트럼 선택적 광학 시스템은, 투과된 광을 수신하는 광검출기 상에 공간적으로 상이한 광학 채널들을 통해 스펙트럼적으로 등거리 파장들에서 수신된 광을 투과시키도록 구성된다. 광검출기에 의해 검출된 광은, 물체의 상이한 심도들에 위치되고 이미징되는 물체의 체적을 정의하는 물체 평면들의 이미지들로 광검출기의 조리개를 충전한다. 스펙트럼 선택적 광학 시스템은, 입력부에서 수신된 광의 공간적으로 코딩된 스펙트럼을 포함하는 광학 출력을 생성하도록 구성된 디바이스를 포함할 수도 있다. 하나의 실시형태에서, 광학 이미징 장치는, 스테이지와 현미경 대물렌즈 사이의 거리를 변화시키도록 구성된 배치기 및 이미징되는 물체를 지지하도록 구성된 스테이지가 구비된 현미경을 포함한다. 광학 채널들은 조향가능한 반사기들을 포함할 수도 있다.

다른 실시형태에서, 광학 이미징 장치는 다수의 이미지 평면들에 의해 특성화되고, 물체를 중간 이미지 평면으로 이미징하도록 구성된 현미경, 및 중간 이미지 평면에 형성되는 이미지를 수신하고, 이 이미지의 공간적으로 코딩된 스펙트럼 콘텐트를 포함하는, 이 이미지의 푸리에 변환에 대응하는 광 분포를 생성하도록 구성되는 푸리에 변환 (FT) 디바이스를 포함한다. 특정 실시형태에서, 현미경은, 물체를 지지하도록 구성된 스테이지 및 현미경 스테이지로부터 현미경 대물렌즈를 이격시키는 거리를 변경할 수 있는 배치기를 포함하고, FT 디바이스는, 예를 들면, 샤냑 (Sagnac) 간섭계 등의 간섭계를 포함한다. 그 실시형태는, FT 디바이스와 광학 통신하는 빔 스플리터 (BS) 디바이스를 더 포함한다. BS 디바이스는, 다수의 이미지 평면들에 각각 대응하는 복수의 광학 채널들을 포함한다. 이들 광학 채널들의 각각은, 이미징된 물체의 대응하는 심도내 (in-depth) 층을 나타내는 대응하는 이미지를 형성하도록 대응하는 이미지 평면 상에 FT 디바이스에 의해 생성된 광 분포를 리이미징하도록 구성된다. BS 디바이스는, 국부 광학 축 둘레에 나선 및 계단형 방식으로 배치된 조절가능한 미러들을 포함할 수도 있다. 본 발명의 실시형태는, 물체내에 상이한 심도들에 위치된 물체 층들을 나타내는 이미지들을 검출하도록 구성된 광검출기를 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 배치기는, 검출된 이미지의 적어도 하나가 광검출기의 평면과 일치하게 하도록 모터화 및 구동될 수도 있다.

또 다른 실시형태에서, 멀티스펙트럼 이미징 장치는, (i) 생물학적 샘플을 받도록 구성된 스테이지 및 대물렌즈를 갖는 현미경; 및 (ii) 상기 현미경과 광학적으로 통신하고 공간적으로 상이한 광학 채널들을 따라 생물학적 샘플의 이미지들을 형성하도록 구성되고, 그 공간적으로 상이한 광학 채널들에 이들 형성된 이미지들이 각각 대응하는, 다초점 이미지 획득 장치 (polyfocal image acquisition apparatus) 를 포함한다. 다초점 이미징 획득 장치는, 상이한 이미지 평면들에서 샘플의 이미지들을 형성하도록 구성된다. 다초점 이미징 장치는, 광검출기를 포함하고, 그 형성된 이미지들은, 생물학적 샘플과 연관된 광의 스펙트럼을 나타내는 기하학적 분포들을 포함한다. 특정 실시형태에서, 다초점 이미지 획득 장치는, 이들 기하학적 분포들을 변경하도록 구성될수도 있다. 그 실시형태는, 현미경 및 다초점 이미징 장치와 동작가능하게 통신하는 프로세서를 더 포함한다. 프로세서는, 적어도 하나의 형성된 이미지에 대응하는 이미징 데이터를 수신하고, 광검출기의 평면에서 미리결정된 이미지를 배치시키도록 요구되는, 현미경 대물렌즈와 현미경 스테이지 상에 배치된 생물학적 샘플을 이격시키는, 거리의 변화를 결정하도록 프로그램된다. 프로세서는 또한, 생물학적 샘플의 형성된 이미지들 하나를 다른 것에서 감산하고, 그 감산의 결과에, 얻어지는 감산된 이미지들의 세기 특성을 기술하는 대응 성능 지수 (figure of merit) 를 지정하고, 최고 성능 지수를 결정함으로써 이격 거리의 변화를 결정하도록 프로그램될 수도 있다. 현미경은, 컴퓨터 제어될 수도 있는 모터화된 배치기를 포함할 수도 있다. 프로세서는, 최고 성능 지수를 결정한 것에 대응하여, 광검출기의 평면에서 상기 최고 성능 지수에 대응하는 이미지를 배치하도록 이격 거리의 변화를 야기하기 위해 더 프로그램될 수도 있다.

본 발명의 다른 실시형태는, 생물학적 샘플을 이미징하도록 구성되고 복수의 공간적으로 상이한 광학 채널들을 포함하는 컴퓨터 제어된 현미경 기반 이미징 시스템에서 사용을 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 컴퓨터 프로그램 제품은 유형의 디지털 저장 매체를 포함하고 그 유형의 디지털 저장 매체는, 이미징 시스템과 동작가능하게 통신하는 컴퓨터에 로딩될 때, 컴퓨터에서 구현되고 (i) 생물학적 샘플의 이미지들을 나타내는 이미지 데이터 세트들을 수신하도록 구성된 입력부로서, 이미지들의 각각은, 복수의 광학 채널들로부터 각각의 대응하는 광학 채널들을 통해 획득되고 상이한 이미지들이 상이한 이미지 평면들에서 형성되는, 상기 입력부; 및 (ii) 생물학적 샘플의 이미지들의 적어도 하나를 디스플레이하도록 구성된 그래픽 출력부로서, 이들 이미지들의 각각은 생물학적 샘플의 스펙트럼 특성을 나타내는 기하학적 구성 (geometrical configuration) 을 포함하는, 상기 그래픽 출력부를 포함하는 장치를 확립한다. 컴퓨터 프로그램 제품은, 디스플레이된 기하학적 구성을 분석함으로써 생물학적 샘플의 스펙트럼 특성을 결정하도록 구성된 이미지 데이터 프로세서를 더 포함할 수도 있고, 특정 실시형태에서, 이미지들을 각각 나타내는 성능 지수를 결정하고 결정된 성능 지수의 비교에 적어도 기초하여 생물학적 샘플 및 현미경 대물렌즈의 상호 재배치를 일으키도록 추가적으로 구성될 수도 있다.

본 발명은, 다음의 특정 실시형태들의 상세한 설명과 도면들을 함께 참조하여 보다 완전히 이해될 것이고, 여기서:
도 1a 및 도 1b는 본 발명에서 사용을 위한 멀티스펙트럼 이미징 (MSI) 시스템들의 개략적인 예시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시형태에 따른 현미경 기반 이미징 시스템을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 이미징 시스템의 현미경 부분의 일 실시형태의 개략도이다.
도 4는 본 발명의 시스템의 다초점 광학 부분의 일 실시형태의 개략도이다.
도 5a, 도 5b, 및 도 5c는 도 2의 시스템의 특정 부분들을 포함하는 실시형태들을 나타내는 개략도이다.
도 6은, 도 2의 실시형태의 피사계 심도 특성을, 그러한 실기형태로 이미징된 물체 평면들에 관하여 예시한 것이다.
도 7은, 도 4의 다초점 광학 부분의 광학 채널들을 통하여 투과된 이미지 형성 광에 의해, 검출기에서, 형성된 서브 이미지들의 상호 배치를 나타내는 개략도이다.
도 8a 및 도 8b는, 각각, 종래 이미징 시스템의 FOV 와 다초점 이미징 시스템의 일 실시형태의 그것을 정의하는 경계들과 오버랩된 불규칙 형상의 관심 영역 (ROI) 의 이미지들이다.
도 9 및 도 10은, 축 스텝핑 (axial-stepping) 수단이 구비된 본 발명의 일 실시형태로 이미징될 수 있는 생물학적 샘플의 두께를 예시하는 개략도이다.
도 11a는 도 2의 시스템의 스펙트럼 선택적 부분의 일 실시형태의 개략도이다.
도 11b는 사냑 간섭계로서 구성된 도 2의 시스템의 스펙트럼 선택적 부분의 특정 실시형태의 개략도이다.
도 12a는 종래 현미경 기반 이미징 시스템에 의해 요구되는 데이터 획득 시간과 비교하여 본 발명의 일 실시형태로 수행된 데이터 획득의 시간의 감소를 예시하는 그래프이다.
도 12b, 도 12c, 도 12d, 및 도 12e는, 생물학적 조직의 이미지들 및 이들 이미지들의 획득에 사용되는 시스템의 대응하는 개략도들로서, 본 발명의 일 실시형태의 사용으로 달성가능하고 종래 현미경 기반 이미징 시스템의 사용으로부터 얻어지는 것과 비교하여 감소된 샘플 광표백 (sample-photobleaching) 효과의 정도를 예시한다.
도 13a는 도 5c의 일 실시형태로 획득된 그리드 레퍼런스의 4개의 다초점 이미지들을 나타낸다.
도 13b는 검출기 상의 도 13a의 이미지들의 인접 배치 및 획득의 순서 (order) 의 예시도이다.
도 14는 도 2의 일 실시형태로 획득된 4개 멀티스펙트럼 다초점 이미지들을 나타낸다.
도 15는 도 2의 실시형태의 사용으로 획득된 양자점 마크된 전립선 조직의 4개의 하이퍼스펙트럼 이미지들을 나타낸다.
도 16은 도 2의 실시형태의 사용으로 획득된 양자점 마크된 전립선 조직의 4개의 추가 하이퍼스펙트럼 이미지들을 나타낸다.
도 17은, 도 16에서 이미징된 바처럼 샘플에 위치된 양자점 마커들에 대응하는 스펙트럼 트레이스 (spectral trace) 를 나타내는 그래프이다.
도 18은, 도 16의 양자점 레이블된 샘플의 3개의 상이한 평면들의 3개 오버랩된 스펙트럼적으로 비혼합 이미지들을 나타내는 복합 이미지 (composite image) 이다.
도 19는 본 발명의 실시형태들에 의해 구현이 가능한 광학 시스템 오토포커싱의 개념을 예시하는 그래프이다.
도 20, 도 21A 및 도 21B는, 굴절률 미스매칭 상태하에서 샘플의 스펙트럼 이미징을 위한 종래 현미경 기반 시스템의 사용으로부터 얻어지는 광학 수차 (optical aberration), 및 동일한 상태하에서 본 발명의 다초점 이미징 실시형태의 사용에 의해 제공되는 이점들을 예시하는 이미지들을 나타낸다.
도 22a 및 도 22b는, 굴절률 미스매칭 상태하에서 샘플의 스펙트럼 이미징을 위한 종래 현미경 기반 시스템의 사용으로부터 얻어지는 광학 수차, 및 동일한 상태하에서 본 발명의 다초점 이미징 실시형태의 사용에 의해 제공되는 이점들을 예시하는 개략도이다.
도 23은 본 발명의 일 실시형태들에 사용을 위한 대안의 다초점 광학 부분의 개략도이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 "하나의 실시형태", "일 실시형태", "관련 실시형태", 또는 유사한 언어에 대한 지칭은, 지칭된 "실시형태" 와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 어구 "하나의 실시형태에서", "일 실시형태에서", 그리고 유사한 언어의 출현은, 모두 동일한 실시형태를 지칭할 수도 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 자신 및/또는 도면을 참조하여 취해지는, 개시의 일부는, 본 발명의 모든 특징들의 완전한 설명을 제공하도록 의도된 것은 아니라는 것이 이해되야 한다.

또한, 참조하여 다음의 개시가 본 발명의 특징들을 설명할 수도 있는 도면들에서, 같은 부호는 가능하다면, 동일하거나 유사한 엘리먼트들을 나타낸다. 도면들에서, 도시된 구조적 엘리먼트들은 일반적으로 스케일대로인 것은 아니고, 강조 및 이해를 위해 특정 컴포넌트들이 다른 컴포넌트들에 비해 확대되어 있다. 단일 도면은, 본 발명의 모든 특징들의 완전한 설명을 뒷받침하도록 의도된 것은 아니라는 것이 이해되야 한다. 즉, 주어진 도면은 일반적으로, 본 발명의 일부만을 설명할 뿐, 일반적으로 모든 특징들을 설명하는 것은 아니다. 주어진 도면은 및 그러한 도면을 참조하는 설명을 포함하는 개시의 연관된 부분은, 주어진 도면 및 논의를 간단하게 하기 위하여, 그리고 이 도면에 특징이 그려진 특정 엘리먼트들에 대해 논의를 향하게 하기 위하여, 특정 뷰의 모든 엘리먼트들 또는 이 뷰에서 나타내어질 수 있는 모든 특징들을 일반적으로 포함하는 것은 아니다.

당업자는, 본 발명이 가능하게는 특정 특징들, 엘리먼트들, 컴포넌트들, 구조들, 상세들, 또는 특성들 중 하나 이상 없이, 또는 다른 방법들, 컴포넌트들, 재료들 및 기타 등등을 사용하여, 실시될 수도 있다는 것을 인식할 것이다. 그러므로, 본 발명의 일 실시형태의 특정 상세는 그러한 실시형태를 설명하는 각각 그리고 모든 도면에서 반드시 나타내어질 필요는 없을 수도 있지만, 도면에서 이 상세의 존재는, 설명의 문맥이 다른 것을 요구하지 않는다면, 내포될 수도 있다. 다른 경우들에서, 잘 알려진 구조들, 상세들, 재료들, 또는 동작들은, 논의되고 있는 본 발명의 일 실시형태의 양태들을 모호하게 만드는 것을 피하기 위하여, 주어진 도면에서 보여지지 않을 수도 있거나 상세하게 설명되지 않을 수도 있다. 더욱이, 본 발명의 설명된 특징들, 구조들 또는 특성들은 하나 이상의 실시형태들에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수도 있다.

또한, 개략적인 플로우 차트 도면이 포함되는 경우, 그것은 일반적으로 논리적인 플로우 차트 도면으로서 제시된다. 그래서, 논리적 흐름의 도시된 순서 및 레이블된 스텝들은 본 발명의 하나의 실시형태를 나타낸다. 예시된 방법들의 하나 이상의 스텝들, 또는 그의 부분들에 대한 기능, 논리 (logic) 또는 효과에 있어서 동등한 다른 스텝들 및 방법들이 생각될 수도 있다. 또한, 채용된 포맷 및 심볼들은, 본 방법의 논리적 스텝들을 설명하기 위해 제공되고 본 방법의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해된다. 다양한 화살표 타입들 및 라인 타입들이 플로우 차트 도면들에서 채용될 수도 있지만, 그것들은 대응하는 방법의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해된다. 실제로, 일부 화살표들 또는 다른 커넥터들이, 본 발명의 논리적 흐름만을 나타내는데 사용될 수도 있다. 가령, 화살표는, 도시된 방법의 열거된 스텝들 사이의 미지정 지속시간의 기간을 대기 또는 모니터링하는 것을 나타낼 수도 있다. 일반성의 손실 없이, 프로세싱 스텝들 또는 특정 방법들이 일어나는 순서는, 보여진 대응하는 스텝들의 순서를 그대로 따를 수도 있고 그러지 않을 수도 있다.

본 개시에 첨부된 청구항들에 기재된 본 발명은, 전체로서 본 개시에 비추어 평가되도록 의도된다.

여기서 논의되는 멀티스펙트럼 다초점 이미지 획득의 방법 및 시스템은, 3차원 샘플의 멀티스펙트럼 이미징이, 이미징 옵틱스 및 샘플의 상호 재배치를 요구하지 않는 방식으로 다수의 초점 평면들에서 동시에 수행될 수 있다는 깨닮음으로부터 기인하였다. 특히, 제안된 방법 및 시스템은, 단일 획득 스텝에서 그리고 비침지 상태들하에서, 100x-현미경으로 오일 침지된 조직 이미지의 종래 단일 초점 평면, 전체 영역 스펙트럼 데이터 획득과 비교하여 시야 (FOV) 에서 여러배 증가를 갖고 피사계 심도 (DOF) 의 약 16 배 증가를 갖는 샘플 내의 상이한 심도들에 위치된 샘플 층들에 대응하는 하이퍼스펙트럼 이미징 데이터를 포함하는 샘플의 이미지를 제공하도록 구성된다. 결과적으로, 종래 하이퍼스펙트럼 이미징 시스템들과 연관된 많은 단점들이 완화되거나 또는 제거된다. 특히, 개시된 발명의 실시형태들은, 이미징 옵틱스 및 이미지들 샘플의 상호 재배치와 연관된 반복적인 기계적 이동을 바이패스하고, 보다 짧은 이미징 사이클들을 보장하고, 많은 초점 평면들에서 미리결정된 멀티스펙트럼 이미징 데이터를 수집하는데 요구되는 광노출의 감소에 기인하여 샘플-광표백 효과들을 실질적으로 감소시킴으로써 이미징된 샘플과 연관될 수도 있는 광불안정 카운터스테인 (photolabile counterstain) 들 또는 다른 화학적 모이어티 (moiety) 들을 보존하는 것을 허용한다. 또한, 본 발명의 실시형태들은, 샘플 내에서 심도 결정의 정확성을 증가시키는 것을 허용하고, 이는 건조 대물렌즈들로 이미징이 수행될 때 현저하다.

종래 멀티-스펙트럼 이미징 시스템들 및 본 발명의 실시형태들

본 발명의 실시형태들은, 멀티스펙터럼 이미징 (MSI) 시스템 또는 형광 현미경 시스템 등의 이미징 시스템으로 채용될 수도 있다. MSI는, 일반적으로, 픽셀 레벨에서 이미지의 스펙트럼 분포에의 액세스를 제공함으로써, 컴퓨터화된 현미경 기반 이미징 시스템들을 병리 시료들의 분석에 설비한다. 다양한 멀티스펙트럼 이미징 시스템들이 존재하지만, 모든 MSI 시스템들에 공통되는 동작 양태는 멀티스펙트럼 이미지를 형성하는 능력이다. 멀티스펙트럼 이미지는, 전자기 스펙트럼에 걸쳐 특정 스펙트럼 대역폭들에서 또는 특정 파장들에서 캡쳐된 이미지 데이터를 포함하는 것이다. 이들 파장들은, 광학 필터들에 의해 또는 예를 들면, 적외 (IR) 등의 가시광 범위의 범위를 넘는 파장들에서 전자기 방사를 포함하는 미리결정된 스펙트럼 컴포넌트를 선택할 수 있는 다른 기구들의 사용에 의해 발탁될 수도 있다.

시료의 이미지들의 획득을 가능하게 하는 MSI 시스템의 2개의 일반적인 타입들은 도 1a 및 도 1b에 개략적으로 예시되어 있다. 도 1a는, 일부 (108) 가 미리결정된 수 N의 이산 광학 대역들을 정의하도록 조정가능한 스펙트럼 선택적 시스템을 포함하는 광학 이미징 시스템 (104) 을 포함하는 장치 (100) 를 나타낸다. 광학 시스템 (104) 은 광학 검출기 (116) 상에 광대역 광 소스 (112) 로 투과 조명되는 조직 샘플 (110) 을 이미징하도록 구성된다. 도시된 바처럼, 하나의 실시형태에서, 예를 들면, 현미경과 같은 확대 시스템을 포함할 수도 있는, 광학 이미징 시스템 (104) 은, 광학 시스템 (104) 의 단일 광학 출력부 (122) 와 일반적으로 공간적으로 정렬된 단일 광학 축 (120) 을 가진다. 시스템 (104) 은, 이미지들이 상이한 이산 스펙트럼 대역들에서 획득되게 보장하도록 스펙트럼 선택적 시스템 (108) 이 (예를 들면, 컴퓨터 프로세서 (126) 로) 조절 또는 조정됨에 따라 조직 (110) 의 이미지들의 시퀀스를 형성한다. 장치 (100) 는, 획득된 이미지들의 시퀀스로부터 조직의 적어도 하나의 시각적으로 인지가능한 이미지가 나타나는 디스플레이 (122) 를 더 포함할 수도 있다. 스펙트럼 선택적 시스템 (108) 은, 광학적 분산 엘리먼트, 이를테면 회절 격자 (diffractive grating), 박막 간섭 필터들과 같은 광학 필터들의 집합, 또는, 사용자 입력 또는 미리프로그램된 프로세서 (126) 의 커맨드 중 어느 하나에 응답하여, 검출기 (116) 를 향하여 샘플 (110) 을 통해 광 소스 (112) 로부터 투과된 광의 스펙트럼으로부터 특정 통과 대역을 선택하도록 구성된 임의의 다른 시스템을 포함할 수도 있다.

여러 스펙트럼 대역들에서 다수의 스펙트럼적으로 이산된 광학 이미지들을 동시에 취하도록 구성된 장치의 대안의 구현 (150) 이 도 1b에 나타나 있다. 여기에서, 스펙트럼 선택적 시스템 (154) 은, N 이산 스펙트럼 대역들에 대응하는 여러 광학 출력들을 정의한다. 시스템 (154) 은, 광학 시스템 (158) 으로부터 투과된 광학 출력 (156) 을 수용하고 N개의 공간적으로 상이한 광학 경로들 (162-1 내지 162-N) 을 따라 이 광학 출력의 적어도 일부를 공간적으로 재지향시켜, 식별된 스펙트럼 대역에서 샘플 (110) 을, 이 식별된 스펙트럼 대역에 대응하는 광학 경로를 따라 검출기 시스템 (166) 상으로 이미징하도록 한다. 다른 대안의 실시형태 (미도시) 는 실시형태들 (100 및 150) 의 특징들을 조합할 수도 있다는 것이 인식된다.

하지만, 특정 실시형태에서, 3D 조직 샘플에 관한 이미징 정보의 멀티스펙트럼 콘텐트는, DOF 에 의해 특성화되는 현미경의 사용으로 단일 획득 스텝에서 획득되는, 이미징 데이터를 공간 주파수 도메인으로 변환하여 스펙트럼적으로 해상된 이미징 데이터를 형성함으로써 결정된다. 또한, 획득된 데이터의 3D 콘텐트 (다초점 콘텐트) 는, 상이한 초점 길이들을 갖는 멀티채널 이미징 옵틱스 및 옵션적으로 광 조향 엘리먼트들을 다초점 이미징 데이터를 형성하는데 사용하여, 현미경 대물렌즈의 DOF 내에서 샘플의 상이한 심도들에 대응하는, 이미징 신호의 부분들을 분리 또는 디커플링하는 것을 통해 공간적으로 이미징 데이터를 변환함으로써 결정된다.

아래에서 논의되는 바처럼, 하나의 서브시스템 (이하 "스펙트럼 디바이스" 라 하고 이미징 데이터를 스펙트럼적으로 해상하는 프로세스를 가능하게 한다) 및 다른 서브시스템 ("다초점 옵틱스" 또는 "다초점 광학 부분" 이라 하고 이미징 데이터를 공간적으로 해상하는 프로세스를 가능하게 한다) 이 일반적으로, 서로 독립적이고 하나의 사용은 다른 것의 사용을 반드시 제한하는 것은 아니다. 또한, 양자 모두의 서브시스템들은 동시에 관여 (engage) 될 수 있다.

양자 모두의 서브시스템들을 포함하는 일 실시형태로 생물학적 샘플을 이미징함으로써 얻어지는, 다초점 (공간 해상) 및 스펙트럼 해상 이미징 데이터는, 3D 샘플의 멀티스펙트럼 이미지를 나타내는 4차원 데이터 세트를 형성한다. 이미징 신호의 스펙트럼 해상 및 다초점 부분들은 또한 CCD와 같은 단일 광학 검출기에 동시에 기록 (register) 된다. 결과적으로, 검출기의 평면에서 공간 변환 이미징 데이터를 포함하는 이미지 부분 (이는 이미징된 샘플의 특정 심도내 층의 공간적 기술을 제공한다) 과 스펙트럼 해상 데이터를 포함하는 이미지 부분 (그리고 이는 그 특정 샘플 층의 스펙트럼 콘텐트를 제공한다) 의 중첩 (superposition) 이 형성된다. 다음으로, 샘플의 표현된 심도들의 각각을 기술하는 스펙트럼 및 공간 파라미터들은, 대응하는 다초점 및 스펙트럼 해상 이미지 부분들로부터 결정되고, 옵션적으로 추가 프로세싱을 위해 유형의 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에 저장되고, 필요한 경우, 사용자에게 디스플레이된다.

다르게는, 서브시스템들 중 어느 것도, 필요한 경우, 구조적으로 그리고 광학적으로 관여해제 (disengage) 될 수 있다. 다초점 옵틱스를 포함하지만 그로부터 스펙트럼 디바이스가 관여해제되는 일 실시형태로 광학 이미징 데이터를 획득한 결과로서, 광학 검출기는, 선택의 동작 파장에서 다수의 공간적으로 상이한 물체 평면들의 이미지를 기록한다. 다른 한편, 스펙트럼 디바이스를 포함하지만 그로부터 다초점 광학 부분이 제거되는 일 실시형태로 광학 이미징 데이터를 획득한 결과로서, 검출기는, 스펙트럼 디바이스에 의해 정의되는 많은 스펙트럼 대역폭들에서 단일 물체 평면의 이미지를 기록한다.

일반적으로, 현미경, 스펙트럼 디바이스 및 다초점 옵틱스는 상호 함께 동작하여, 이미징 데이터를 형성하는 광을 이미징되고 있는 샘플로부터 광학 검출기로 릴레이하는 연속적으로 위치된 광학 서브시스템들의 광학 트레인 (train) 을 형성한다. 하나의 실시형태에서, 그러한 광학 릴레이는, 대응하는 중간 이미지 평면에서 샘플의 적어도 하나의 중간 이미지를 형성하는 것을 포함한다. 도 2는 본 발명의 다초점 하이퍼스펙트럼 이미징 시스템의 개념에 대한 개략적인 예시를 제공하고, 제 1 중간 이미지 평면 (208) 상에 물체를 이미징하는 현미경 시스템 (204); 제 1 평면 (208) 으로부터 제 2 중간 평면 (216) 으로 중간 이미지를 릴레이하는 스펙트럼 디바이스 (212); 및 광학 검출기 (224) 상으로 제 2 중간 이미지 평면 (216) 에서 형성된 중간 이미지를 리이미징하는 다초점 옵틱스 (220) 를 보여주고, 모두 옵션적으로, 프로그램 코드 및 대응하는 저장 매체가 갖추어진 컴퓨터 시스템 (230) 으로 제어 및 조율 (coordinate) 된다.

이미징 시스템

도 3은 제 1 이미지 평면 (306) 상에 샘플/물체 (302) 를 이미징하는데 사용되는, 도 2의 현미경 서브시스템 (204) 의 일 실시형태 (300) 를 예시한다. 그 실시형태 (300) 는, 중간 이미지 평면 (306) 상에 광학 트레인 (316) 를 통해 광 (314) 을 투과시키는 조명 소스 (310) 를 포함한다. 도시된 바처럼, 제 1 광학 트레인 (316) 은 필드 렌즈 (318), 필드 조리개 (322), 제 1 콘덴서 (326) (제 1 콘덴서 렌즈 (326A) 및 제 1 콘덴서 조리개 (326B) 를 포함하는 것으로 도시됨), 대물 렌즈 (330) 및 튜브 렌즈 (tube lens; 334) 를 갖는다. 그 실시형태 (300) 는 또한, 제 2 조명 소스 (344) 로부터의 여기 광 (340) 으로, 샘플 (302) 을, 대물 렌즈 (330) 를 통해, 조명하도록 구성된 조명기 (336) 를 포함한다. 조명기 (336) 는, 여기 광 (340) 으로 샘플 (302) 을 조명하는 것이 샘플 (302) 로 하여금 형광하도록 보장하게 구성된다. 샘플 (302) 로부터의 이 형광 방출은 대물 렌즈 (330) 로 수집되고 또한 튜브 렌즈 (334) 쪽으로 재지향된다. 조명기 (336) 는 제 2 조명 소스 (344), 제 2 콘덴서 (348), 제 2 필드 조리개 (352), 및 여기 광 (340) 의 (하나의 구현에서-조정가능하게) 스펙트럼 콘텐트를 선택하도록 구성된 여기 필터 (356) 를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제 2 필드 조리개 (352) 는 직사각형이다.

빔 스플리터 (360) 는 광학 트레인 (316) 및 조명기 (336) 를 통해 전파되는 광학 빔들의 교점에 적절히 배치되어, 이들 광학 빔들 사이의 적어도 부분적인 공간적 오버랩을 보장하도록 한다. 빔 스플리터 (360) 와 튜브 렌즈 (334) 사이의 이미지 형성 빔 (372) 을 가로질러 제거가능하게 배치되는 방출 필터 (364) 는, 광학적으로 여기된 샘플 (302) 로부터 튜브 렌즈 (334) 쪽으로 형광 광학 신호를 투과시키고 조명 광 빔 (340) 을 차단하도록 구성된다. 그 실시형태 (300) 의 광학 시스템은, 제 2 필드 조리개 (352) 의 이미지가 중간 이미지 평면 (306) 으로 릴레이되도록 보장하게 적절히 조절된다. 하나의 실시형태에서, 현미경은 콜러 (Kohler) 조명 시스템을 포함할 수도 있다. 하지만, 일반적으로, 관련 업계에 알려져 있는 다른 조명 시스템들이 적절히 사용될 수도 있다.

본 발명의 시스템의 광학 트레인을 따라 이동하며 또한 도 2 및 도 3을 참조하여, 스펙트럼 디바이스 (212) 의 일 실시형태는, 중간 이미지 평면 (이를테면, 이미지 평면 (208) 또는 평면 (306)) 에 형성된 물체 (이를테면, 도 3의 물체 (302)) 의 중간 이미지를, 다초점 옵틱스 (220) 의 전방에 위치된 다른 중간 이미지 평면 (이를테면, 평면 (216)) 상으로 릴레이하도록 구성된다. 스펙트럼 디바이스 (212) 의 실시형태들은 본원의 다른 곳에서 논의될 것이다.

다초점 광학 부분

아래에서 논의되는 바처럼, 본 발명의 시스템의 다초점 광학 부분의 실시형태들은, (예를 들면, 병리 조직편과 같은) 3D 물체의 이미지의 획득을 위해 필요한 시간의 감소를 가능하게 하고 다초점 광학 부분의 상이한 광학 채널들에 대응하는 다수의 이미지 평면들에서, 일반적으로, 이미징되는 다수의 물체 평면들을 나타내는 이미징 데이터의 동시 획득을 허용한다.

1) 순수 다초점

평면 (216) 으로부터 중간 이미지를 광학 검출기 (224) 전방에 있는 타겟 이미지 평면들 상으로 리이미징하는, 도 2의 시스템의 다초점 광학 부분 (220) 의 실시형태 (400) 가 이제 도 4를 참조하여 설명된다.

다초점 옵틱스 부분 (400) 의 입력부는, 제 2 중간 이미지 평면 (216) 으로부터 바람직하게는 직사각형 조리개 (406) 를 통하여 광을 수신하고, 수신된 광을 콜리메이트된 빔 (408) 으로서 조향 미러 (steering mirror) 엘리먼트들의 그룹을 향해 투과시키는 콜리메이팅 렌즈 (404) 가 구비된다. 412A, 412B, 412C, 412D, 412E, 412F, 412G, 및 412H 로 표기된 조향 미러 엘리먼트들은 적절히 배치되어 일반적으로 복수의 (도시된 바처럼, 4개의) 광학 채널들을 정의하고 인입 콜리메이트된 빔 (408) 을 대응하는 수의 이미지 형성 빔들 (도시된 바처럼, 4개의 빔들 (421, 422, 423, 및 424)) 로 스플리팅하고 그들의 각각은 대응하는 광학 채널을 따라 지향된다. 이미지 형성 빔들 (도시된 바처럼, 빔들 (422, 423, 및 424)) 의 적어도 일부는 또한 대응하는 조절 렌즈 (428, 432, 436) 쪽으로 투과된다. 이미지 형성 빔들 (421, 422, 423, 및 424) 로부터의 광은 또한, 최종 이미징 렌즈 (440) 에 의해 수신되고 이는, 광학 검출기 (224) 의 평면에서, 이미지 형성 빔들 (421, 422, 423, 및 424) 에 각각 대응하는 서브이미지들 (미도시) 를 형성한다.

본 발명에 따른 다초점 이미징의 사상의 구현은, 다수의 물체 평면들의 이미징을 허용하는 한편, 현미경 기반 이미징 시스템의 검출기, 그 시스템의 옵틱스, 및 테스트 중인 샘플 중에서 공간적으로 고정된 협동을 보존한다. 일반적으로, 검출기가 샘플 및 현미경의 옵틱스에 대해 공간적으로 고정되면, 검출기는, 현미경 대물렌즈의 초점 길이에 의해, 부분적으로, 정의되는 특정 물체 평면의 2D 광학 이미지를 기록한다. 예를 들면, 도 5a의 실시형태 (500) (이는, 도 2의 실시형태 (200) 와 비교하여, 다초점 광학 부분 (220) 을 갖지 않는다) 는, 이미지 데이터 획득 시에 "초점이 맞은 (in focus)" 물체의 특정 부분의 이미지를 생성하도록 구조화된다. 유사하게 도 5b의 실시형태 (550) 에 의해 이미지가 형성된다 (이는, 도 2의 실시형태 (200) 와 비교하여, 스펙트럼 디바이스 (212) 도 다초점 광학 부분 (220) 도 갖지 않는다). 본 발명의 실시형태들은 또한 일반적으로, 검출기의 평면의 위치가 현미경의 옵틱스에 대하여 고정되도록 구조화된다. 그러므로, 다초점 이미징 능력으로 일 실시형태를 향상시키기 위하여, 그리고 또한 도 2, 도 3 및 도 4a를 참조하여, 조절 렌즈들 (428, 432, 436) 의 광학 특성들이 서로 다르게 적절히 선택된다. 결과적으로, 시스템의 개개의 이미징 채널들 (도시된 바처럼, 그 채널들은 이미지 형성 빔들 (421, 422, 423, 및 424) 에 대응하고 그들을 따라 광은 검출기 (224) 쪽으로 샘플 (302) 로부터 렌즈들 (330, 334) 및 조절 렌즈들을 통하여 투과된다) 은 샘플 (302) 의 상이한 층들을 깊이 방향 (depth-wise) 으로 이미징한다. 특정 실시형태에서, 조절 렌즈들 (428, 432, 436) 의 초점 길이들은, 이미징 빔들 (421, 422, 423, 424) 에 각각 대응하는 광학 트레인들의 유효 초점 길이들이 상이하도록 그리고 상이한 물체 층들이 대응하는 상이한 이미지 평면들 상에 이미징되도록 보장하게 선택된다.

본 발명의 다초점 이미징의 사상은 또한, 도 5c 및 도 6의 도면을 참조하여 그리고 또한 도 2, 도 3 및 도 4a를 참조하여 예시되어 있다. 도 6의 도면은, 도 3의 현미경 (300) 및 도 4의 다초점 옵틱스 (400) 가 갖추어진 도 2의 실시형태 (200) 의 사용과 동시에 이미징될 수 있는 복수의 연속 물체 평면들 (이미징된 샘플의 복수의 층들에 각각 대응한다) 을 도시하다. 그 실시형태 (400) 의 조절 렌즈들의 유효 초점 길이들이 예를 들어, t 만큼 서로 다른 경우, 그리고 대물 렌즈 (330) 가 피사계 심도 (DOF) 를 갖는 경우, 그러한 조절 렌즈들이 결여된 종래 이미징 시스템들과 비교하여, 샘플이 이미징될 수 있는 유효 피사계 심도는 DOF로부터 D로 향상된다. 전체적으로, 그러므로, 4개의 이미징 채널들이, 샘플의 심도내, t 만큼, 등거리로 이격된 샘플 (302) 의 4개의 상이한 층들 (604, 608, 612, 및 616) 을 이미징하도록 구성된다. 예를 들면, t = 2 미크론 그리고 DOF = 2 에 대해, 본 발명의 다초점 실시형태의 유효 피사계 심도는 D = 8 미크론이다.

또한 도 4를 참조하여, 다초점 광학 부분 (400) 은, 조향 미러들 (412A, 412B, 412C, 412D, 412E, 412F, 412G, 및 412H) 및 대응하는 조절 렌즈들 (428, 432, 436) 을 포함한다. 조향 미러들 및 조절 렌즈들은, 인입 빔 (408) 의 국부 광학 축 (444) 에 대해 나선 및 계단형 방식으로 (즉, 도 4의 z-축에 평행하게) 공간적으로 배열되어, 도 7에 도시되고 각각 광 빔들 (421, 422, 423, 424) 에 의해 형성된 서브 이미지들 (721A, 722A, 723A, 및 724A) 이 검출기 (224) 의 평면에 인접하게 된다.

옵션적으로, 조향 미러 엘리먼트들의 적어도 일부의 공간 배향은, 미러 (412B) 에 대해 화살표로 도시된 바처럼, 운동학적으로 조절된다. 일 실시형태에서, 조향 미러들 (412A, 412B, 412C, 412D, 412E, 412F, 412G, 및 412H) 의 일부는 (파선들로 나타낸 바처럼) 부분적으로 투명하여 원하는 비율에 따라 이미지 형성 빔들 중에서 인입 빔 (408) 의 세기의 분할을 달성한다.

재구성가능한 시야

단일 검출기 상으로의 N 물체 평면들의 다초점 이미징이 비중첩 이미지들을 생성하도록 보장하기 위하여, 직사각형 조리개가 광학 경로내에 위치된다. 그러한 조리개는 도 3의 대물 렌즈 (330) 의 전체 FOV의 1/N 부분에 대응하는 광을 투과시키도록 적절히 치수화된다. 예를 들면, 광 빔들 (421, 422, 423, 424) 을 투과시키는 광학 트레인들에 각각 대응하는 N=4 물체 평면들을 동시에 이미징하도록 구성된 도 4의 실시형태에서, 직사각형 조리개 (406) 는 렌즈 (330) 의 FOV의 약 25% 를 프레임 (frame) 화 하도록 치수화된다. 도 7에 도시되는 얻어진 서브이미지들 (721A, 722A, 723A, 및 724A) 은 단일 카메라 칩 (224) 의 각각의 사분면들을 차지하도록 치수화된다.

본 발명의 다초점 이미징 시스템의 일 실시형태에 의해 제공된 계 장점 (corollary advantage) 은 불규칙 형상 ROI의 이미지들을 효율적으로 획득할 수 있는 시스템의 능력이다. 특히, 직사각형 검출기 상에 불규칙 형상의 물체 피처 (특히, 사용된 이미징 시스템의 FOV보다 더 큰 것) 의 효율적인 이미징은 보통, (이미지의 일부가 검출기를 벗어날 때) 오버이미징) 또는 (검출기의 일부가 ROI의 이미지가 아니라 배경을 기록할 때) 언더이미징 중 어느 하나를 초래한다. 도 8a에 도시된 바처럼, 예를 들어, 본원에 기술된 다초점 이미징 능력을 갖지 않는 종래 현미경 기반 시스템에 의한 불규칙 경계 (816) 를 갖는 ROI (810) 의 이미징은, 일부 (820A) 가 ROI (810) 의 밖의 배경에 의해 점유되는 이미지 (820) 의 형성을 초래한다. 대비하여, 다초점 이미징 시스템의 일 실시형태에 의한 관심 샘플의 이미징은, 이미징 채널들의 수에 비례하여 감소되는 FOV에서 연속적인 이미지들 (830A, 830B) 등을 취하는 것을 허용한다. 도 8b에 도시된 바처럼, 형성된 이미지들은 전체적으로 ROI (810) 를 커버하는 한편, 불규칙 경계 (820A) 를 따르며 그에 크로스 (cross) 되지 않는다. 결과적으로, 본 발명의 실시형태들은, 무관한 이미징 데이터의 획득을 최소화하면서 불규칙 형상의 물체들을 나타내는 포괄적인 이미징 데이터를 획득하는 효율성을 가능하게 한다.

또한, 본 발명의 다초점 이미징 시스템의 일 실시형태의 FOV는 종래 시스템에 비해 감소되기 때문에, 형광 이미징의 맥락에서 병리 시료들의 광표백이 현저히 감소된다. 실제로, 형광 엘리먼트들의 효율적인 광활성화 또는 샘플의 의도적 광표백은, 상이한 노출들에 대응하는 오버랩되는 FOV들에 의해 정의되는 작은 제어 영역들 (이를테면, 파선으로 보여진, 도 8b의 영역 (840)) 에 제한된다. 이 사실은, 어셉터 광표백으로 에너지의 공진 전송의 효율을 측정하기 위해 다수의 획득들이 요구될 수도 있는, 다초점 스펙트럼 FRET에 유리하게 사용될 수도 있다.

본 발명의 일 실시형태에 의한 이미징은, 광학 배율을 변화시키기 위하여 시스템을 재구성함으로써 보다 큰 FOV로 수행될 수 있다는 것이 인식된다. 예를 들면, 100x 배율로 본 발명의 다초점 이미징 시스템을 이용하여 이미징된 물체 필드가 1,384 평방 미크론이면, 40x 배율에서 동일한 시스템은 8,652 평방 미크론의 영역을 이미징할 것이고, 10x 배율에서 캡쳐된 물체 영역은 138,445 미크론들로 증가한다. 다르게는, 보다 큰 센서 (예를 들어, CCD 또는 CMOS), 또는 보다 큰 센서와 보다 큰 대물렌즈 (이를테면 스테레오현미경/현미경 대물렌즈) 의 조합이 FOV의 크기를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.

추가적으로, 또한 도 2를 참조하여, 본 발명의 일 실시형태는 다초점 옵틱스 부분 (220) 의 관여해제 (또는 바이패싱) 를 허용하도록 구성되어, 평면 (216) 으로부터 중간 이미지를 직접 검출기 (224) 의 평면으로 리이미징한다. 다초점 옵틱스 부분 (220) 의 관여해제 또는 바이패싱을 초래하는 시스템의 재구성은 2개의 스텝들을 포함한다. 제 1 스텝에서, FOV 를 제한하는 조리개 (예를 들어, 도 4의 조리개 (406)) 가 이미지 형성 광학 빔 (408) 의 경로로부터 치워진다. FOV 제한 조리개의 제거 후에, 도 4의 빔 스플리팅 미러들 (412B, 412D, 및 412H) 을 유지하는 어셈블리는 조율되어 이들 빔 스플리팅 미러들을 제거함으로써 (도 4의 예에서, 광학 축 (444) 을 따라 전파되는 빔에 대응하는) 단일 광학 경로를 보유하도록 한다. 대안의 실시형태에서, 보조 불투명 반사기 (예를 들어, 미도시의 미러 또는 프리즘) 이 제 1 빔 스플리팅 미러 (412A) 전에 빔 (408) 의 광학 경로내에 삽입되어 빔 (408) 을 빔 스플리팅 옵틱스 주변 단일 광학 경로를 따라 재지향시킨다.

그러한 유리한 재구성의 결과로서, 일 실시형태는, 최대 FOV로 단일 물체 평면을 획득하기 위해 갖추어진 도 5a의 종래 이미징 시스템으로서 또는 최대 FOV의 1/N번째 부분에서 N 물체 평면들의 각각을 동시에 이미징하기 위해 갖추어진 다초점 이미징 시스템으로서 동작하도록 구성된다. (도 5a에 개략적으로 나타낸 구조를 초래하는) 일 실시형태의 다초점 옵틱스 부분 (220) 의 관여해제는, 요구되는 노출 시간이 스펙트럼 디바이스의 스펙트럼 조정의 스텝 (예를 들어, 간섭계의 스텝 레이트) 보다 현저히 더 길 때, 아래에서 논의되는 바처럼 스펙트럼 디바이스 (212) 를 이용하는 멀티스펙트럼 이미지 데이터 획득 동안 유리한 것으로 판명된다. 다른 예로, 큰 FOV의 이미징이 매우 높은 해상도로 요구될 때 또는 가까이 있는 샘플이 얇고 단일 물체 평면을 이미징함으로써 효율적으로 표현될 수 있을 때, 시스템의 다초점 옵텍스 부분 (220) 을 관여해제하는 것이 바람직할 수도 있다.

2) 하이브리드-다초점

다초점 이미지 획득을 위해 구성된 본 발명의 위에서 논의된 실시형태들은 다수의 물체 평면들을 동시에 이미징하도록 구조화되고, 결과적으로, 단일 스냅 샷에서 병리 샘플 (이를테면 생물학적 조직의 3D 샘플) 의 두께를 통해 분자 프로브 데이터를, 종래 시스템들에 의해 그 샘플의 두께 영역을 횡단하도록 요구되는 기계적인 이동 없이, 매우 효율적으로 모으도록 동작가능하다. (예를 들어, TMPRSS2:ERG 삽입 측정 (assay) 등의 멀티플렉싱된 양자점 (QD) FISH 측정들을 평가하기 위하여) 분자 병리에 적용되는 것들과 같은 다양한 스펙트럼 이미징 기술들은, 결과적인 이미징 사이클들의 단축으로부터 현저하게 혜택을 받는다. 설명된 다초점 이미징 기법은, 종래 명시야 ISH (in-situ hybridization) 및 또한 발색 측정 (chromogenic assay) 의 맥락에서 적절한데, 3D 공간에서 프로브 로컬리제이션 (probe localization) 을 구별하고 확장된 피사계 심도로 이미지들을 캡쳐할 필요성 때문이다. 설명된 다초점 이미징 기법은, 예를 들면, RGB 컬러 이미징 (이를테면, 예를 들어 Bayer 마스크 또는 3-CCD 카메라들) 을 위해 설계된 카메라를 사용하여, 또는 다르게는, 투과 광 경로 또는 검출 경로에서 적색, 녹색 및 청색 컬러 필터들을 사용하여 연속적인 노출을 채용함으로써, 또는 하이퍼스펙트럼 데이터로부터 적색, 녹색 및 청색 파장 대역들의 선택에 의해, 컬러 카메라 이미지 획득에 적응될 수 있다. 본 발명의 실시형태들은, 축 재배치 능력이 갖추어진 종래 자동화된 현미경 시스템보다 더 적은 수의 전기기계적 및/또는 자동화된 컴포넌트들을 구현한다. 그럼에도 불구하고, 전술된 다초점 획득 시스템과 종래 z-스텝핑 수단의 조합은, 주어진 시간량에서 이미징될 수 있는 물체 평면들의 수를 더욱 더 증가시키거나, 또는 다르게는 이미지 획득 시간을 감소시킬 가능성이 있다.

따라서, 본 발명의 관련 실시형태는, 종래 축 스텝핑 (z-스텝핑) 수단, 이를테면 물체/샘플에 대해 현미경의 대물 렌즈를 전진시키거나 또는 다르게는 고정된 렌즈에 대해 샘플을 이동시키도록 동작가능한 마이크로모터와 같은 종래 축 스텝핑 (z-스텝핑) 수단을 포함한다. 이 경우에, 이미지 획득 시간의 단위에서 이미징될 수 있는 심도내 물체 평면들의 수는 더욱 더 증가된다. 이 "하이브리드" 다초점 스텝핑 접근법은, 샘플의 전체 두께를 이미징하는 동안 보다 높은 축 해상도를 달성하기 위하여 물체 층들의 공간적으로 인터레이싱된 스택들을 획득하는데 사용될 수 있다. 다르게는, 이 하이브리드 접근법은, 주어진 수의 획득 이벤트들에서 이미징될 수 있는 샘플의 두께의 동적 범위 (dynamic range) 를 증가시키는 것을 용이하게 할 수 있다. 제 1 응용이 도 9에 개략적으로 예시되어 있는 한편, 제 2 응용은 도 10에 도시되어 있다.

도 9에 도시된 바처럼, 도 6을 참조하여 설명된 다초점 이미징 시스템 및 dz의 축 증분을 갖는 종래 스텝핑의 조합은, 대물 렌즈의 2개의 연속적인 z-위치들에서, 공간적으로 인터리빙된 물체 심도내 평면들의 세트들 A 및 B를 나타내는 다초점 이미징 데이터를 수집하는 것을 허용한다. 도 3의 대물 렌즈 (330) 의 제 1 위치에서 이미징된 세트 A의 물체 평면들은 실선으로 나타나 있고, 도 3의 대물렌즈 (330) 의 제 2 위치에서 이미징된 세트 B의 물체 평면들은 점선으로 나타나 있다. 축 스텝핑 수단이 갖추어진 종래 현미경 (300) 이 대물 렌즈의 2개의 dz 이격된 위치들에서 물체의 2개의 심도내 층들에 대응하는 스펙트럼 이미징 데이터를 획득할 필요가 있는 시간 윈도우 (time window) 에서, 8개의 상이한 물체 층들이 동일 현미경과 다초점 옵틱스 (400) 를 조합하는 특정 "하이브리드" 실시형태로 이미징된다. 하이브리드 다초점 실시형태에 의해 이 시간 윈도우 동안 이미징된 물체의 전체 두께는 실질적으로 D1 에 이른다. 일 예로서, t = 2 미크론 및 dz = 1 미크론인 특정 실시형태에서, D1 는 9 미크론과 같다. 하이브리드 다초점 스텝핑 이미지 획득 시스템은, 효율 및 축 해상도의 증가를 가능하게 하고, 이것으로 물체 층들의 스택들이 시료의 전체 두께를 통하여 이미징될 수 있다는 것이 인식된다.

다르게는, 동일한 디바이스 조합이, 스텝핑 모터의 축 증분이 dz 에서 Dz 로 증가될 때 물체의 전체 이미징된 심도를 D1 에서 D2 로 증가시킬 수 있다. 도 10을 참조하여, (실선으로 나타낸) 개개의 물체 평면들의 제 1 세트는 현미경 대물렌즈의 제 1 위치에서 이미징된다. (파선으로 나타낸) 개개의 물체 평면들의 제 2 세트는 Dz 만큼 제 1 위치와는 상이한 (물체에 대한) 대물 렌즈의 제 2 위치에서 이미징된다. 결과적으로, 물체에 대한 현미경의 대물 렌즈의 2개의 연속적인 위치들에서, 물체의 전체 심도 D2 가 이미징될 수 있다. 일 예로서, t = 2 미크론 및 Dz = 8 미크론인 특정 실시형태에서, D2 는 16 미크론과 같다. 그러므로, 본 발명의 이미징 시스템의 하이브리드 다초점 스텝핑 실시형태는, 수십 미크론 (비한정적인 예로서, 30-50 미크론) 정도의 두께를 갖는 샘플들을 통한 데이터 획득 시간의 단위에서 데이터 수집의 효율을 유리하게 개선하는데 사용될 수 있고, 그렇게 할 때, 감소된 노출 시간에 기인하여 샘플의 전체 광표백을 감소시킨다. 설명된 하이브리드 다초점 스텝핑 실시형태로 유리하게 이미징될 수 있는 샘플들의 두께의 실제적인 제한은, 이미징된 샘플의 광학 투명도 그리고 대물렌즈의 작동 거리 (working distance) 에 의해 부과될 수도 있다. 그러한 하이브리드 획득 시스템에 의해 제공되는 이점들은, 관심 3D 샘플 특징들의 위치들 및 그 샘플의 전체 3D 해부학적 구조를 효율적으로 식별하는 능력을 포함한다. 이 능력은, 예를 들면, 보다 큰 공간 정확도 및/또는 확장된 초점 범위로 3D 공간에서 염색체 상의 유전자 서열 (genetic sequence) 의 로컬리제이션, 염색질의 상대적인 분포, 또는 핵의 3D 형상의 불규칙성의 식별을 가능하게 함에 있어서 유리한 것으로 판명될 수도 있다.

스펙트럼 디바이스

스펙트럼 해상된 이미징 데이터를 획득하기 위하여, 본 발명의 실시형태들은 다양한 전략들을 채용할 수도 있다. 몇가지만 예로 들자면, 간섭 필터들, 컬러 흡수 필터들, 조정가능 복굴절 액정 (LC) 과 크로싱된 편광 엘리먼트들을 갖는 파장판의 조합, 음향 광학 필터들 (AOF), 전기광학 (EO) 조정가능 필터들, 분산성 옵틱스 이를테면 반사 또는 투과에서 동작하는 회절 격자, 프리즘, 이색성 또는 다색성 미러들을 포함하는 일반적인 스펙트럼 선택성 디바이스들이 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명되었다.

특정 실시형태들에서, 도 2의 스펙트럼 디바이스 (200) 는, (옵션적으로 조정가능) 광학적 에탈론 또는 간섭계, 이를테면 (옵션적으로 조정가능) Fabry-Perot, Michelson, Sagnac, Fizeau, 또는 Gires-Tournois 간섭계를 포함하도록 구성될 수 있고 이는 매우 높은 스펙트럼 해상도를 보장한다. 또한, 본 발명의 일 실시형태의 스펙트럼 선택적 시스템으로서 사용되는 간섭 스펙트럼 디바이스는, 다른 스펙트럼 필터링 엘리먼트와 비교하여 주어진 획득 시간의 단위에 대해 스펙트럼 디바이스를 통해 투과되는 매 파장에 대해 더 높은 광 스루풋을 제공한다는 것을 예기치 않게도 경험적으로 알아냈다. 도 11a를 참조하면, 본 발명의 시스템의 다초점 이미징 실시형태의 부분인 간섭 스펙트럼 디바이스는, 시스템에 의해 형성되는 다초점 이미지 상에 겹쳐지는 간섭 무늬내에 스펙트럼 디바이스를 통하여 투과된 광의 스펙트럼 정보의 인코딩을 일으킨다. 그러므로, 간섭계 (1110) 는 주파수 도메인에서 공간 도메인으로 검출기 평면에 전달된 이미지 형성 광에 포함된 스펙트럼 정보를 변환함으로써 푸리에 변환기 (Fourier Transformer) 로서 동작하도록 구성된다. 최종 이미지에서 간섭 무늬의 공간 분포를 분석함으로써, 그러므로, 이미지 형성 광의 스펙트럼 분포가 회복된다. 도 11b의 실시형태에서, 예를 들어, 스펙트럼 디바이스 (1110) 는, 서포트 (1114) 상에 배치된 사냑 간섭계를 포함한다. 도 11a에 도시된 바처럼, 서포트 (1114) 는 축 (1118) 을 중심으로 회전가능하여, 스펙트럼 필터 (1110) 가 전체 시스템으로부터 관여해제되고 단순 미러 (1122) 등의 스펙트럼 무관 반사기로, 예를 들어 서포트 (1114) 의 단순 회전에 의해 대체될 수 있도록 보장하고, 검출기 평면 상의 최종 이미지에서 간섭 무늬가 도입될 수 있도록 보장한다. 푸리에 변환 분광술에서 채용되는 본 발명의 일 실시형태에서 스펙트럼 디바이스로서 사냑 또는 Michelson 간섭계 등의 간섭계를 사용하는 다른 장점은, (예를 들어, 형광 분광술에서 처럼) 낮은 광 레벨들에서 신호 데이터의 보다 효율적인 수집을 포함한다. 특히, 직접 측정이 아니라 멀티플렉싱된 측정들을 취할 때 신호 대 잡음 비에서의 개선이 얻어진다 (Felgett 이점으로서 알려진 효과). 간섭 스펙트럼 디바이스 (1110) 가 광학 경로 (도 11a, 도 11b에서 미도시) 로부터 관여해제될 때, 멀티스펙트럼 이미징이 상이한 스펙트럼 필터의 사용으로 보장될 수 있다.

이미지 획득 시간의 감소

종래, 직렬 이미지 획득 시스템의 획득 레이트는, 적어도 (i) (멀티스펙트럼 이미징에 대해) 스펙트럼 선택적 디바이스의 스텝 레이트 (step-rate) 곱하기 주어진 스펙트럼 대역폭 내의 노출 수 또는 (단색 이미징에 대해) 노출 시간 곱하기 노출 수; (ii) z-스캐닝 유닛의 스텝 레이트 곱하기 샘플의 이미지들이 취해지는 대물렌즈의 z-위치들의 선택된 수; 및 (iii) 상이한 물체 평면들에서 획득되는 스펙트럼 이미지들을 프로세싱하는데 요구되는 계산 시간을 포함하는 여러 인자들에 의해 제한된다. 도 3-5, 도 6, 도 7, 도 9, 및 도 10을 참조하여 논의된 바처럼, 본 발명의 실시형태들은 종래 현미경 시스템의 광학 피사계 심도의 향상을 가능하게 하고, 종래 현미경 기반 이미징 시스템이 단일 물체 평면의 이미지를 캡쳐할 수 있는 위치를 넘어서 시스템의 컴포넌트의 이동 및/또는 특수 기구 제어 없이 다수의 물체 평면들을 이미징한다. 결과적으로, 이미지 획득 시간의 단위에서, 상이한 심도내 물체 평면들을 나타내는 이미징 데이터의 보다 많은 양이, 종래 현미경 이미지 획득 시스템으로 획득되고 단일 물체 평면을 나타내는 것보다 본 발명의 다초점 실시형태로 획득된다. 다르게 언급하면, 한번에 단일 물체 평면을 이미징할 수 있는, 종래 연속 획득 시스템으로 보다 본 발명의 다초점 이미징 시스템의 실시형태로 여러 물체 평면들을 기술하는 이미지 데이터를 획득하는데 더 짧은 시간 인터벌이 소요된다. 이 이점은, 물체내 상이한 심도에 위치된 4개의 물체 평면들을 나타내는 하이퍼스펙트럼 데이터를 수집하기 위하여 z-스텝핑 모터가 갖추어진 종래 단일 물체 평면 이미징 시스템에 요구되는 전체 획득 시간의 그래프 (1210) 를 나타내는 도 12에 예시되어 있다. 비교를 위해, 동일한 이미징 데이터를 획득하기 위하여 4개의 이미징 채널들 (도 4 참조) 및 간섭계 (도 11 참조) 가 갖추어진 본 발명의 다초점 시스템에 요구되는, 계산된, 시간을 나타내는 그래프 (1220) 가 보여져 있다. 데이터의 스펙트럼 분포는 다초점 시스템의 조정가능 간섭계의 512 간섭 스텝들 (노출들) 을 정의하고, 여기서 각 스텝은 약 80 ms 가 소요된다. 종래 시스템에 의한 동일한 데이터의 획득은, 물체 평면당 100 sec 초보다 많이 소요된다.

또한, 도 8a, 도 8b 및 도 12a 를 참조하면, 본 발명의 다초점 이미징 시스템을 사용한 멀티스펙트럼 이미지 획득의 광표백 감소 효과들은 도 12b 및 도 12c에 나타나 있다. 도 12b는, 본 발명의 다초점 능력들이 결여된 종래 시스템의 FOV 내에서, 대략 160 초 노출에서, 획득된 DAPI 스테인드 전립선 조직 샘플 (DAPI-stained prostate tissue sample) 의 이미지를 예시한다. 이 종래 배열을 기술하는 스케치는 도 12d에 개략적으로 도시되어 있다. 도 12b에 대응하는 샘플의 광표백의 정도는 약 75% 로 추산된다. 대비하여, 도 12c의 이미지는, 검출기의 대응하는 4분면 상에 연속적인 스텝들의 각각에서 전술된 FOV의 대략 1/4를 이미징함으로써, 4개의 연속적인 스텝들에서, 본 발명의 다초점 실시형태로 획득된 동일한 샘플의 이미지이다. 이 예는, 조명된 영역을, 다초점 광학 부분을 통해 이미징되는 보다 작은 영역으로만 제한하기 위한 필드 조명 경로에서의 조리개의 사용을 예시한다. 이 이미징 배열에 관련되는 개략도는 도 12e 에 도시되어 있다. 도 12c의 1/4 FOV 서브이미지들 (1, 2, 3 및 4) 의 각각은 40초 노출만을 요구하며, 그에 의해 약 18.75%으로 샘플의 광표백의 전체 정도를 감소시킨다는 것이 이해된다. 필드 평면에 켤레 (conjugate) 인 평면에서 보다 작은 조리개의 사용은, 여기를 위한 피사계 심도가 증가되도록 조명의 피사계 심도를 확장하는데 사용될 수 있다. (예를 들면, 대응하는 개구수 (numerical aperture) 를 감소시키는 것을 통하여) 입사를 위해 입사각을 감소시킴으로써, 균일한 조명 플럭스의 보다 큰 심도가 빔 축을 따라 실현될 수 있다. 이러한 고려는 다초점 디바이스로 이미징된 심도를 통해 형광단의 적절한 여기를 보장하는데 도움이 될 수 있다.

하이퍼스펙트럼 다초점 이미지 데이터 획득 및 프로세싱의 구체적인 예들

생물학적 샘플의 멀티스펙트럼 이미징이, 도 3의 현미경 시스템, 도 11a, 도 11b 등의 사냑 간섭계를 포함하는 스펙트럼 디바이스, 그리고 도 4의 실시형태에 따라 배열되고 4개의 광학 이미징 채널들을 갖는 다초점 광학 부분을 포함한 도 2와 유사한 실시형태로 수행되었다. 그러므로, 다음의 논의는 도 2, 3, 4, 및 7 을 참조하여 제시된다. 4개의 물체 평면들이 단일 검출기 (224) 의 4개의 사분면 상으로 각각 이미징되는 것을 허용하기 위하여, 필드 조리개 (406) 는 직사각형으로 형상화되고 실시형태의 옵틱스에 의해 제공되는 FOV의 중심 25%를 투과시키도록 사이징된다. 표 1에 요약된 조향 미러들 (412A, 412B, 412C, 412D, 412E, 412F, 412G, 및 412H) 의 광학 특성들은, 다초점 광학 부분의 4개 광학 이미징 채널들을 통해 형성된 서브이미지들이, 비슷한 세기 레벨들을 갖도록 보장하게 선택되었다.

조절 렌즈들 (428, 432, 및 436) 의 초점 길이들 f _i 은 다음에 따라 적절히 선택되었다

식중에서 d 는 유효 초점 길이 f ₁ 를 갖는 렌즈 (440) 와 유효 초점 길이 f _i 를 갖는 주어진 i번째 초점 조절 렌즈의 일부 사이의 기하학적 거리이고 F _i 는 i번째 광학 채널에 대응하는 유효 초점 길이다. 실시형태의 광학 이미징 채널들 중에서 유효 초점 길이들의 차이는, 대물 렌즈의 배율 곱하기 대물 렌즈 (330) 의 DOF의 증분에 대응하는 것으로 계산되었다. 예를 들어, 물체 공간에서 DOF가 2미크론이고, 광학 채널에서 배율이 40x 인 경우, CCD에서의 이미지 평면의 타겟 시프트는 80미크론이다. 그러므로, 실제로, 일부 조절 렌즈들 (428, 432, 및 436) 은 네가티브 광학 파워(들) 를 갖도록 선택되고 일부는 포지티브 광학 파워(들) 을 갖도록 선택된다. 결과적으로, 검출기 (224) 는 대응하는 사분면들에서, 서브이미지들 (721A, 722A, 723A, 및 724A) 을 기록하고, 서브이미지들 중 하나는 선택된 물체 평면을 나타내고, 나머지 3개의 서브이미지들은 선택된 물체 평면 아래로 2미크론에 그리고 선택된 물체 평면 위로 2 및 4 미크론에 위치된 물체 평면들을 나타낸다. 전체적으로, 기록된 서브이미지들은, 약 8 미크론의, 물체 공간에서, (도 3의 z-축을 따라) 심도의 범위를 스피닝 (spinning) 한다. 커스텀 반사 방지 (AR) 코팅된 렌즈들은 40x NA=0.75 (대물 렌즈 (330), 2 마이크론 피사계 심도) 에서의 이미징에 적합하다는 것을 알아냈다.

도 13a는, (스펙트럼 디바이스로서 사용되는) 간섭계가, 20x 배율에서 관여해제된 본 발명의 이미징 시스템의 실시형태의 4개의 광학 이미징 채널들에 의해, 동시에, 형성된 4개의 물체 평면들의 4개 다초점 서브이미지들 (A), (B), (C), 및 (D) 을 도시한다. 이미징된 물체는 그리드로서 패터닝되고 투과 광 현미경을 위한 투명 기판 상에 장착된 박형 금속 포일을 포함한다. 이미지들의 각각에 대응하는 피사계 심도는 2 미크론이다. 도 6의 도면을 참조하여, 전체적으로, 도 13a의 4개 이미지들은 8 미크론의 물체 공간 심도를 나타낸다는 것이 인식된다. 이 이미지 획득에서, 최선 초점의 평면은 이미지 (A) 에 대응하는 것으로 선택되었다.

전술된 바처럼 다초점 광학 부분 (400) 및 (스펙트럼 디바이스 (220) 로서 사냑 간섭계 (1110) 양자 모두를 포함한) 본 발명의 다초점 스펙트럼 이미징 간섭계의 완전한 실시형태 (200) 를 통한 동일한 박형 금속 포일 그리드 물체의 이미징 결과로서, 검출기 (224) 는 도 14의 서브이미지들 (E), (F), (G), 및 (H) 을 기록했다. 이미지 (G) 는, 실질적으로 초점이 맞은, 물체 공간에서의 평면에 대응한다. 이미지들 (F) 및 (H) 는 (이미지 (G) 의 물체 평면의 위와 아래로 각각) 2 미크론 및 -2 미크론 만큼 이미지 (G) 에 대해, 시프트된 물체 평면들을 나타낸다. 이미지 (E) 는 이미지 (G) 에 대응하는 물체 평면 위 약 4 미크론에 위치된 물체 평면을 나타낸다. 전술된 바처럼, 사냑 간섭계를 사용하여 공간 도메인으로 이미징 데이터의 스펙트럼 콘텐트의 변환의 결과로서, 도 14의 각각의 서브이미지들 (E), (F), (G), 및 (H) 은, 간섭계가 광학 경로에 존재한다는 것을 나타내는 수직 간섭 무늬 (1410) 를 포함한다. 적절히 프로그램된 컴퓨터 프로세서로 간섭 무늬 (1410) 의 지오메트리를 분석하는 것은 도 14의 이미지들의 스펙트럼 콘텐트를 추출하는 것을 허용한다. 도 14 등과 같은 이미지들은, 선택된 방향을 따라 공간적으로 이격되고 선택된 파장들에서 이미징된 4개의 상이한 2D 물체들 (즉, 4개의 물체 평면들) 에 관한 정보를 포함하는 데이터 세트를 나타낸다는 것이 인식된다.

본 발명의 일 실시형태는 또한, 도 15에 도시된 바처럼, Q-점 (QD) 로 레이블된 3D 전립선 조직 샘플의 심도내 평면들의 시리즈를 나타내는 하이퍼스펙트럼 이미징 데이터를, 단일 이미지 획득 사이클에서, 획득하는데 사용되었다. 조직 레이블링 또는 타겟팅을 달성하기 위하여, QD들은 종종, 조직의 선택된 부분에 선택적으로 바인딩하기 위하여 조직 특이 바인딩 사이트들로 관능화 (functionalize) 된다. 예를 들면, QD들은, 형광 분광술을 사용하여 생물학적 조직 성분들의 검출을 위해 무기 형광단으로서 사용될 수도 있다. 여기서, QD들은 조직 분자의 성분들로서 사용되고, 이는 이 분자로 하여금 대응하는 타입의 조직 성분들을 특이적으로 식별하는 방식으로 형광하게 한다. 가까이에 있는 조직 샘플의 QD-특이 형광을 검출함으로써, 조직의 생물학적 구조 및/또는 조직의 특정 성분의 위치에 관하여 결론내릴 수 있다.

도 16은 위에서 논의된 바처럼 획득된 3D 전립선 조직 샘플의 상이한 심도내 평면들의 4개의 서브이미지들 (M), (N), (O), (P) 을 예시하고, 여기서 예를 들어, 핵들 (1620) 과 연관된 QD 들과 같은 상이한 물체 특징들이 물체에서 상이한 심도로 구별된다. 각 이미지에 대해 2 미크론 피사계 심도는, 초점의 심도에서 오버랩 없는 40x NA=0.75 (대물 렌즈 (330)) 이미징 상태들에 대응한다.

상이한 형광단들 (이를테면, QD들의 상이한 종들) 이 코-로컬라이징 (co-localizing) 되는 경우에, (도 16 등의) 형광 마커들로 레이블된 물체의 상이한 평면들을 나타내는 서브이미지들은 또한, 코-로컬라이징된 형광단의 존재 및 기여를 해상하는데 사용될 수 있다. 도 17은, 예를 들면, 도 16에 대응하는 FOV에서 프로브들의 코-로컬리제이션을 나타내는 3 x 3 픽셀 영역에서 마커들로부터 수신된 광의 스펙트럼들의 평균으로부터 도출된 합계 (미프로세싱된) 스펙트럼 트레이스를 예시한다. 스펙트럼 커브 (1710) 의 특징들은 QD565, QD655, 및 DAPI 카운터스테인에 대응하는 형광의 스펙트럼 피크들과 일치되며, 그에 의해 스펙트럼 정보가 (예를 들어, 도 14의 이미지의 간섭 무늬 (1410) 와 같은) 최종 이미지의 간섭도 부분으로부터 성공적으로 디코딩되었음을 나타낸다. 여기에서, 565 nm 부근에서 광을 방출하는 QD 종은 QD565 으로 레이블되고, 655 nm 부근에서 광을 방출하는 그것은 QD655 로 레이블된다.

본 발명의 시스템의 실시형태들로 획득되는 이미징 데이터를 프로세싱하도록 구성된, 본 발명의 컴퓨터 프로그램 제품의 일 실시형태는, 또한 (i) 검출기의 동일 픽셀 상으로 이미징된 (예를 들어, QD565 및 QD655 등의) 상이한 마커들에 대응하는 데이터의 스펙트럼 비혼합 (또는 분해), 및 (ii) 각 마커의 존재 및 그의, 이미지에 대한 기여의 상대량을 해상하는 것을 가능하게 하는데 사용될 수 있다. 스펙트럼 비혼합은, 업계에 알려져 있는 선형 방법들을 사용하여 또는 특정 실시형태에서, 2011년 5월 6일자로 출원되고 발명의 명칭이 "Method and System of Spectral Unmixing of Tissue Images" 인, 일반적으로 양도되고 함께 계류중인 미국 가출원 제61/483,202호에 기술된 비선형 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 그의 개시는 참조에 의해 본원에 원용된다. 다음으로, 본 발명의 시스템의 광학 이미징 채널들의 각각에서 획득된 스펙트럼 비혼합된 이미징 데이터는, 샘플의 상이한 심도들을 나타내는 대응하는 서브이미지들을 형성하는데 사용된다. 이들 서브이미지들은, 독립적으로 또는, 대안적으로 또는 추가적으로, 분석될 수 있고, 이들 서브이미지들은 필요한 경우 적절히 크롭되고 오버레이되어, 식별된 물체 평면들에서 샘플링된 3D 생물학적 물체의, 단일 이미지 평면 상에, 투영된 이미지를 나타내는 궁극적인 2D 이미지를 형성한다. 도 18의 예는 도 16의 물체의 (3개의 상이한 심도들에 각각 대응하는) 3개의 상이한 물체 평면들을 나타내는 3개의 스펙트럼 비혼합 서브이미지들의 "오버레이" 로부터 발생되는 그러한 궁극적인 이미지를 보여준다. 도 16의 이미지를 얻기 위하여, 본 발명의 실시형태의 간섭계로 미리정의된 파장들에서 획득된, 물체의 4개 중에서 3개 평면들 (심도들) 을 나타내는 이미징 데이터의 세트가 업계에 알려진 바처럼 스펙트럼 비혼합되고 오버레이되었다.

추가 특징들

본 발명의 실시형태들은, 추가의 유리한 특징들, 특성들 및 능력들, 이를테면, 예를 들어, A) 대물 렌즈의 초점 평면에 대해 이미징되고 있는 다초점 체적의 자동화된 축 배치의 가능함; 및 B) 굴절률 미스매칭 상태들하에서 이미지 획득 동안 광학 포어쇼트닝 (fore-shortening) 의 완화를 제공한다.

오토포커싱 능력. 하나의 예에서, 전기기계적 z-스텝핑 수단 및 본 발명의 이미징 시스템의 하이브리드 다초점 실시형태 (즉, 도 4의 부분 (400) 과 같은 다초점 광학 부분을 양자 모두 포함하는 실시형태) 의 사용은 (시스템의 부분으로서 스펙트럼 디바이스의 사용에 의해서든 (예를 들면, 도 2 참조), 또는 도 5c에 도시된 바처럼, 관여해제되는 스펙트럼 디바이스에 의해서든) 이미징 데이터의 획득 동안 오토포커싱을 달성하는데 사용될 수 있다. 자동화된 필터 터릿 (turret) 또는 방출 필터 휠의 조합은, 파장 해상 오토포커싱 능력을 제공하도록 레버리지 (leverage) 될 수 있다. 또한, 도 5c, 13a, 및 13b를 참조하여, 예를 들면, 도 5c의 실시형태를 사용하여 획득된 그리드 표준 엘리먼트의 상이한 물체 평면들을 나타내는 서브이미지들 (A) 내지 (D) 에 대응하는 이미징 데이터 세트들은, 하나의 서브이미지으로부터 다른 것으로 블러링 정도의 변화를 나타내는 메트릭 또는 성능 지수를 마련하기 위하여 쌍으로 비교된다. 하나의 실시형태에서, 데이터 세트들의 비교는, 이미징 데이터의 픽셀-바이-픽셀 (pixel-by-pixel) 차이의 결정 및 상이한 이미지 데이터 세트들에 대응하는 차이 서브이미지 (difference-sub-image) 들의 생성을 포함한다. 블러링 정도를 정의하는 메트릭은, 그러한 차이 서브이미지들의 픽셀들에 대해 평균내어진 세기의 값을 포함한다. 예를 들면, 표 2는, 각각 대응하는 이미징 데이터 세트들을 감산함으로써, 각각 얻어진 차이 서브이미지들 (BA)=(B)-(A), (CB)=(C)-(B), 및 (DC)=(D)-(C) 을 나타내는 데이터를 요약한다.

대물렌즈의 초점 평면에 위치된 동안 이미징된 물체 평면에 대응하는 도출된 메트릭의 값은, 모든 결정된 메트릭 값들 중에서 가장 높다는 것이 이해된다. 하나의 실시형태에서, 메트릭은, "차이" 서브이미지의 모든 픽셀들에 걸쳐 세기 값들의 합계로서 정의될 수 있다. 대안의 실시형태에서, 메트릭은, 픽셀 세기의 평균 값으로서 정의된다. 그러므로, 도출된 메트릭 값들에서의 변화에 기초하여, 본 발명의 시스템의 프로세서는, 대물렌즈의 현재 위치로부터, 최소량의 블러 (또는 디포커스) 로 이미징된 물체 평면에 도착하도록 요구되는 샘플에 대한 현미경 대물렌즈의 이동의 방향을 결정할 수 있다. 도 13a, 13b, 및 표 2에 대응하는 "최선 초점" 의 방향의 자동화된 결정의 예가 도 19에 예시되어 있다. 이 예에서, 현미경 대물렌즈를, 그것이, 최적으로 포커싱된 물체 평면의 이미지를 획득할 때 있는 지점에 배치하기 위하여, 대물렌즈는, 적절히 프로그램된 프로세서에 의해, 실시간으로, 결정된 메트릭 값의 증가에 의해 특성화되는 그러한 방향으로 이동되야 한다.

관련 실시형태에서, 예를 들어, 몇가지만 들자면, (i) 인접 픽셀들에 의한 정의되는 이미지 부분들의 콘트라스트의 결정; (ii) 스펙트럼 분석; (iii) 히스토그램 분석; (iv) 분산 분석; (v) Brenner의 방법; (vi) Range 방법; 및 Mendelsohn/Mayall 방법과 같이, 연속적으로 이미징된 물체 평면들을 나타내는 서브이미지들의 변화를 특성화하는 대안의 베뉴 (alternative venue) 들이 채용될 수 있다.

본 발명의 이미징 시스템의 오토포커싱 방법의 전술된 실시형태는, 이미징되고 있는 샘플과 현미경 대물렌즈를 이격시키는 거리를 자동적으로 또는 수동적으로 변화시키도록 (예를 들어, 대물렌즈에 대하여, 샘플을 위한 서포트를 제공하는 엘리먼트를 자동으로 재배치하도록) 구성된 모터화된 스테이지가 구비된 암시야 또는 명시야 현미경 시스템 중 어느 하나와 사용될 수 있다. 특히, 작동 거리의 그러한 변화는, 광검출기의 평면과 선택된 서브이미지가 형성되는 이미지 평면을 코-로케이팅 (co-locating) 하기 위하여 달성될 수도 있다. 샘플 두께 변화의 경우 또는 샘플이 틸팅될 때, 오토포커싱 능력은, 다수의 물체 평면들로부터 높은 초점 콘트라스트의 샘플 영역들을 선택하고, 대응하는 이미지 데이터를 프로세싱함으로써, 이들 영역들의 이미지들을, 높은 콘트라스트를 갖는 하나의 연속적인 이미지로 선택적으로 "병합" 하는데 사용될 수도 있다. 오토포커싱 능력은, 높은 콘트라스트로 이미징된 물체 평면으로부터 선택된 스펙트럼 특성들을 갖는, 높은 콘트라스트 타겟들 (예를 들면, 가시 스펙트럼의 녹색 부분에서 형광하는 QD들) 을 선택하는데 사용될 수도 있다. 추가적으로, 이 능력은, 예를 들면, 정의된 스펙트럼 영역들에서 높은 콘트라스트를 갖는 물체 평면들을 병합함으로써, 예를 들어, 색수차 (chromatic aberration) 등의 다양한 이미징 결점의 보상에 채용될 수 있다. 그러한 병합기의 하나의 예는, 스펙트럼의 녹색 영역에서 높은 콘트라스트를 갖는 것들과 스펙트럼의 적색 부분에서 높은 콘트라스트를 갖는 이미지 영역들의 병합기를 포함한다.

굴절률 매칭된 이미징 대 굴절률 미스매칭된 이미징. 본 발명의 시스템 및 방법의 실시형태들은, 물체를 특성화하는 유효 굴절률이, 그의 이미징에 대해 주어진 현미경 대물렌즈가 최적화된 매질의 굴절률과 상이할 때 (예를 들어, 그 보다 더 높을 때) (물체내의 상이한 심도들에 위치된) 물체 평면들을 나타내는 이미징 데이터의 정확한 획득을 위해 유리하게 사용될 수 있다. 공기중에서 동작하도록 설계된 현미경 대물렌즈는, z-축을 따라 단일 위치에서의 (예를 들어, 샘플/커버슬립 계면에 대응하는 위치에서의) 이미징을 위해 사용되도록 의도되고, 그러한 대물렌즈가 공기보다 더 높은 굴절률을 갖는 샘플의 이미징을 위해 사용될 때, 이미징되고 있는 물체 평면의 축 위치를 나타내는 측정들은 정확하지 않 (고 오일 침지 대물렌즈 (oil-immersion objective) 의 사용이 바람직하다) 다는 것이 인식된다. 이 에러는, 입사 매질 (공기) 과 이미지들인 매질 (샘플) 사이에 굴절률 미스매치에 의해 야기되고, 이미징되고 있는 ROI의 겉보기 "스트레칭" 에서, 샘플 내부의 그러한 ROI의 위치가 증가함에 따라, 분명해진다.

이 수차는, 스넬의 법칙의 적용 및 도 20, 21a, 및 21b에서 제시된 개략적인 예시들로부터 용이하게 이해된다. 도 20은 다음의 매질들에서 장착된 오일 침지 대물렌즈로 이미징되고 커버 슬립 아래에 배치된 타겟 형광 구형 비드 (약 10.2 미크론의 직경을 갖는 형광 캘리브리이션 마이크로스피어) 의 3개 이미지들을 나타낸다: 굴절률 매칭된 오일 (1.51의 굴절률, 이미지 A); 굴절률 미스매칭된 글리세롤 (약 1.42의 굴절률; 이미지 A); 그리고 굴절률 미스매칭된 물 (약 1.3의 굴절률; 이미지 C). 축 방향 (z-축) 을 따라 이미지의 겉보기 수차 (예상 원형 형상으로부터 비드의 이미지의 형상의 편차) 는 굴절률 미스매치의 증가에 따라 증가된다. 유사하게, 그리고 도 21A 및 도 21B를 참조하여, 공기중에서의 이미징을 위해 설계된, 대물렌즈가, (공기보다 더 큰 굴절률을 갖는) 조직학적 시료를 이미징하는데 사용될 때, 이미징되고 있는 물체 평면의 심도가 증가함에 따라 샘플의 이미징된 특징들은 점진적으로 광학적으로 포어쇼트닝 (이미지에서 압축) 된다. 도 21A 및 도 21B는, 각각 굴절률 매칭 및 굴절률 미스매칭된 상태들하에서 90-도 유리 (n~ 1.51) 반사 프리즘 엘리먼트 (그의 경계는 라인 (2110) 으로 표시되어 있다) 의 이미징을 측면도로 계략적으로 예시한다. 굴절률 매칭된 상태들하에서의 이미징이, 샘플 위의 커버슬립 상에 오일 (n~ 1.51) 에 침지된 오일 침지 렌즈 (2112, 40x, NA=1.2) 로 수행되었다. 다른 한편, 굴절률 미스매칭된 상태들하에서의 이미징은, 공기 중에서의 이미징을 위해 설계된 렌즈 (2114) (20x, NA=0.7) 로 공기중에서 달성되었다. 종래에, 현미경 대물렌즈의 z-스텝핑 재배치의 사용으로 이미징된 상이한 물체 평면들을 나타내는 획득된 이미징 데이터의 재구성은, 연속적으로 이미징된 물체 평면들 사이의 이격이 대물렌즈들의 연속 위치들 사이의 이격과 동일하다는 가정하에서 수행된다. 즉, 종래 데이터 프로세싱은, 이미징과 연관된 기하학적 경로가 광학 경로와 동일하다는 가정하에서 수행된다. 하지만, 이 가정은, 실제로는 굴절률 매칭 상태들에만 제한된다 (도 21A 참조). 광학 경로가 굴절률 미스매치에 의해 변경될 때, 도 21B에 예시된 경우에서와 같이, 입사 매질 (공기) 및 이미징되는 매질 (유리 프리즘) 의 굴절률들이 실질적으로 상이한 경우에, z-스텝핑은 재구성된 이미지 데이터에서 치수 왜곡 (dimensional distortion) 을 야기한다. 굴절률 미스매칭된 이미징 상태들하에서 발생되는 수차는, (i) 파선으로 도 21B에 도시된, 프리즘 엘리먼트 자체의 경계 (2110) 로부터 프리즘 엘리먼트의 이미지의 경계를 나타내는 라인 (2120) 의 편이 (deviation); 및 (ii) 프리즘 자체의 꼭지각 (90도) 과 비교하여 프리즘의 이미지의 꼭지각 (~ 119 도) 의 변화에 의해 도 21B에 나타낸다. 도 21B에 나타낸 바처럼, 이미징된 프리즘 (경계 (2120) 에 의해 표시됨) 은 스캐닝의 방향 (z-축) 에서 "압축" 되는 것으로 나타난다. 측정 오차의 값은 이미징의 심도 및 샘플의 굴절률 양자 모두에 의존하고, 이는 이미징 절차의 캘리브레이션을 현저히 복잡하게 한다. 도 21B에 예시된 측정 오차는, (커버슬립/샘플 계면으로부터 측정될 때, 거리 B인) 이미징의 심도의 약 38% 로 결정되었다.

도 22a는, 굴절률 미스매칭된 상태들하에서 3D 샘플의 이미징으로부터 발생되는 수차 (재구성된 이미지의 광학 포어쇼트닝) 에 대한 추가 예시를 제공한다. 공기 침지 이미징 (air-immersion imaging) (은, 병리 시료들의 스펙트럼 이미징에 바람직한데, 왜냐하면 더 높은 피사계 심도, 더 큰 FOV 및 슬라이드/샘플 취급의 용이성을 가져오기 때문이다라는 것이 인식된다. 다초점 광학 부분을 포함하는 본 발명의 실시형태들의 사용은, 위에서 논의된 측정 오차를 완화하는데, 왜냐하면 (z-축을 따라) 현미경 대물렌즈의 축 배치의 변화들을 나타내는 데이터는 물체 공간에서보다는 이미지 공간에서 도출되기 때문이다. 본 발명의 실시형태들에 따른 다초점 이미징을 사용할 때, 이미지 평면들과 이들 평면들에 대응하는 이미지 데이터 사이의 이격(들) 은 동일한 광학 경로 수차들을 받는다. 결과적으로, 이미지 재구성 절차 동안, 도 22b에 개략적으 도시된 바처럼, 이들 공통 수차들은 동등하게 오프셋된다.

본 발명의 다초점 이미징 시스템 및 방법의 전술된 수차 보상 능력은, 조직에서 병리 상태들의 결정에 유용할 수도 있는데, 왜냐하면 그러한 능력은 3D 공간에서 상대적인 거리들의 보다 정확한 측정들을 가능하게 하기 때문이다. 또한, 본 시스템의 다초점 광학 부분은 현미경 대물렌즈의 전기기계적인 배치의 오차를 받지 않기 때문에, 물체 평면들의 상대적인 위치는, 예를 들면, 스펙트럼 FISH 이미지 획득에서 현재 채용되는 종래 이미징 시스템들과 대비하여, 굴절률 미스매칭된 상태들하에서 본질적으로 더 정확하다.

본 발명의 전술된 실시형태들의 실제 응용의 예들 중 하나는, 포르말린 고정, 파라핀 임베딩된 조직에 대한, 확장된 피사계 심도로 병리 결정을 가능하게 하는 것을 포함한다. 동시에 다수의 초점 평면들을 획득하는 본 실시형태들의 독특한 능력 때문에, 명시야 ISH 또는 단일 또는 이중 채널 형광 또는 멀티 모드 명시야 렌더링된 콘텍스트 시각화 ('의사-명시야') 에서 확장된 피사계 심도 이미지들이 실시간으로 생성되어, 확장된 피사계 심도로 네비게이션 및 편리한 사진 문서화 (photo documentation) 를 허용할 수 있다. 이미지들의 고속 디블러링 또는 확장된 피사계 심도 프로세싱은, 디포커스 블러 없이 신호 검출 및 조직을 인지하는 능력을 향상시키도록 구현될 수도 있다. 이것은, 종래 스트리밍 CCD 카메라에 의한 실시간 디스플레이 상에서 또는 접안렌즈들을 통해 직접 볼 수 있는 것보다 더 높은 품질의 실험 결과들을 보장한다. 본 발명의 시스템을 이용한 멀티스펙트럼 이미징을 구현하는 방법의 실시형태들은, 도 12a, 도 12b, 도 12c를 참조하여 논의된 바와 같이, (종래에, 각각 상이한 초점 평면에서, 다수회 스텝 방식 스펙트럼 획득을 반복하는 것과 연관된) 시간적 오버헤드를 덜게 한다. 그러한 개선은 이것이 특히, 다초점 획득을 위한 노출 시간이, 스펙트럼 획득 스텝 레이트 또는 카메라 독출 레이트에 대응하는 것보다 지속시간이 더 짧은 경우에 특히 관련된다.

본 발명은 특정 실시형태들의 예들을 참조하여 설명되었지만, 예시된 실시형태들에 대한 변경 및 변형들이 여기에 개시된 본 발명의 개념들로부터 이탈함이 없이 이루어질 수도 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 일부 양태들이 플로우차트를 참조하여 설명되었지만, 당업자는 플로우차트의 각 블록 또는 블록들의 조합의 전부 또는 일부의 기능들, 동작들, 판단들 등이 조합되거나, 분리된 동작들로 분리되거나, 또는 다른 순서로 수행될 수도 있다는 것을 손쉽게 인식할 것이다.

또한, 실시형태들이 다양한 예시적인 데이터 구조들과 관련하여 설명되었지만, 당업자는, 그 시스템이 다양한 데이터 구조들을 사용하여 구체화될 수도 있다는 것을 깨달을 것이다. 본 발명의 실시형태들에 대해 선택된 특정 값들이 기재되었지만, 본 발명의 범위 내에서, 모든 파라미터들의 값들은 상이한 응용들에 대해 적합하도록 폭넓은 범위들에 대해 변화될 수도 있다는 것이 이해되야 한다. 예를 들면, 도 2의 실시형태 (200) 의 다초점 광학 부분 (220) 의 대안의 구현들은, 피라미드형 형상 미러들 및/또는 프리즘 엘리먼트들을 포함할 수도 있다; 복수의 광학 이미지 형성 채널들을 달성하는 광학 빔 스플리팅은, 편광 기반 및/또는 파장 기반 빔 분할 및 스플리팅을 포함할 수도 있다. 다수의 검출기들이 (도 2의 엘리먼트 (224) 로서) 사용되어 FOV, 독출 대역폭을 증가시키거나, 또는 고속 이미징 데이터 획득을 가능하게 하는 복잡한 빔 스플리팅 스킴들을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 이미징 시스템의 다초점 옵틱스 및 광학 검출기 부분들의 특정 대안의 실시형태 (2300) 가 도 23에 도시되어 있다. 도 2의 실시형태 (200) 와 비교하여, 실시형태 (2300) 는, 예를 들면, 디바이스 (220) 와 같은 스펙트럼 디바이스로부터 광 (2304) 을 수신하도록 구성된다. 광의 빔 (2304) 은 프리즘 (2308) 을 횡단하고 또한 프리즘 (2308) 의 면 (2312) 에서 분할되고, 이 면은 옵션적으로, 반사 빔 (2320) 의 세기와 면 (2312) 을 통한 투과 빔 (2324) 의 세기들의 미리결정된 비를 가능하게 하는 박막 코팅 (2316) 으로 코팅된다. 반사된 빔 (2320) 은 또한, 프리즘 (2308) 의 다른 면에서 전반사 (TIR) 되고, 검출기 (2332) 쪽으로 측면 (2328) 을 통해 빠져나간다. 입력 빔 (2304) 의 투과 부분 (2324) 은, (옵션적으로 박막 코팅 (2348) 으로 코팅된) 계면 (2344) 을 따라 제 3 프리즘 (2340) 에 인접한, 다른 프리즘 (2336) 에 진입하고, 계면 (2344) 에서 부분 반사 그리고 프리즘 (2336) 의 계면 (2352) 에서 TIR 후에, 검출기 (2356) 쪽으로 빠져나간다. 빔의 잔여 부분 (2360) 은 프리즘 (2340) 을 횡단하고 또한 검출기 (2364) 에 의해 기록된다. 검출기들 (2332, 2356, 및 2364) 과 각각 연관된 조절 렌즈들 (2368, 2372, 및 2376) 은 도 2의 실시형태의 조절 렌즈들 (428, 432, 및 436) 의 그것들과 유사한 기능들을 수행하도록 구성된다. 하나의 구현에서, 빔 스플리팅 계면들 (2312/2352) 및 대응하는 코팅 (2316) 은, 빔들 (2320 및 2324) 의 세기들의 비가 약 33/67가 되도록 보장하게 구성되고; 중간 스플리팅 계면 (2344) 및 대응하는 코팅 (2348) 은, 계면 (2344) 에서 빔 스플리팅이 대략 50/50가 되도록 보장하게 적절히 구성된다.

또한, 개시된 양태들, 또는 이들 양태들의 부분들이 위에 열거되지 않은 방식들로 조합될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 개시된 실시형태(들) 에 한정되는 것으로 고려되지 않아야 한다.

Claims (40)

1. 입력부를 갖는 광학 시스템으로 샘플을 이미징하는 방법으로서,
   상기 입력부의 광학 축을 따라, 상기 샘플과 연관되고 제 1 스펙트럼 분포를 갖는 광을 수신하는 단계;
   수신된 상기 광을 광학 채널들 안으로 공간적으로 재지향시키는 단계로서, 각 광학 채널은 대응하는 유효 광학 파워 (effective optical power) 를 갖는, 상기 공간적으로 재지향시키는 단계; 및
   광학 채널들에 각각 대응하는 상기 샘플의 복수의 실질적으로 비중첩 이미지들로 광검출기의 조리개를 충전하도록 상기 광검출기로 상기 광학 채널들의 각각을 통해 투과된 광을 검출하는 단계를 포함하고,
   각각의 광학 채널은, 제 1 스펙트럼 분포를 갖는 광을 투과시키도록 구성되고,
   상이한 광학 채널들은 상이한 유효 광학 파워들을 갖는, 샘플을 이미징하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   복수의 스펙트럼 대역폭들을 정의하는 스펙트럼 필터링된 광을 형성하도록 광학 필터 시스템으로 수신된 상기 광을 스펙트럼 필터링하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 이미징하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 복수의 스펙트럼 대역의 상이한 스펙트럼 대역폭들에서 스펙트럼 필터링된 광은 상이한 광학 경로들을 따라 형성되는, 샘플을 이미징하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서,
   선택된 스펙트럼 등거리 파장들에서의 세기가 상기 스펙트럼 등거리 파장들에서, 상기 입력부에서 수신된 광의 세기보다 더 큰, 스펙트럼 필터링된 광을 형성하도록 광학 필터 시스템으로 수신된 상기 광을 스펙트럼 필터링하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 이미징하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서,
   광학 필터 시스템으로 수신된 상기 광을 스펙트럼 필터링하는 단계는, 미리결정된 파장 범위에 걸쳐 상기 광학 필터 시스템을 통해 투과된 광의 파장을 스캔하기 위해 상기 광학 필터 시스템을 조정하는 단계를 포함하는, 샘플을 이미징하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서,
   공간적으로 재지향시키는 단계는, 상기 입력부의 광학 축에 대해 나선 및 계단형 관계로 배치된 반사기들로 수신된 상기 광을 광 빔들로 분할하는 단계를 포함하는, 샘플을 이미징하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서,
   광을 검출하는 단계는, 물체 평면들의 이미지들을 기록하는 단계를 포함하고, 상기 물체 평면들은 상기 샘플의 체적을 정의하고, 상기 이미지들은 체적 이미지를 정의하는, 샘플을 이미징하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서,
   광을 검출하는 단계는, 미리정의된 파장들에서 선택된 물체 평면들의 각각의 이미지들을 기록하는 단계를 포함하는, 샘플을 이미징하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 광학 채널들에 의해 각각 정의되는 이미징 평면들은 서로 상이한, 샘플을 이미징하는 방법.
10. 병리 샘플의 체적 이미징 방법으로서,
    상기 병리 샘플의 체적을 정의하는 물체 평면들로부터 나오는 광을 수신하는 단계; 및
    상기 병리 샘플의 체적 이미지를 형성하기 위하여 광검출기로, 공간적으로 상이한 광학 채널들을 통해 투과된, 수신된 상기 광을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 체적 이미지는, 각각 대응하는 광학 채널들로 상기 광검출기의 인접하는 부분들 상에 형성된 물체 평면들의 이미지들을 포함하는, 병리 샘플의 체적 이미징 방법.
11. 제 10 항에 있어서,
    상이한 광학 채널들의 유효 초점 길이들은 서로 상이한, 병리 샘플의 체적 이미징 방법.
12. 제 10 항에 있어서,
    상기 체적 이미지는, 상기 물체 평면들로부터 나오는 광의 스펙트럼 콘텐트를 나타내는 간섭 무늬를 더 포함하는, 병리 샘플의 체적 이미징 방법.
13. 제 10 항에 있어서,
    로렌치안 함수들의 시리즈에 의해 나타낸 스펙트럼 투과 특성을 갖는 광학 필터를 통해 수신된 상기 광을 투과시키는 단계를 더 포함하는, 병리 샘플의 체적 이미징 방법.
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 광학 필터는 스펙트럼 조정가능 광학 필터를 포함하는, 병리 샘플의 체적 이미징 방법.
15. 제 10 항에 있어서,
    수신된 상기 광의 스펙트럼 특성을 결정하기 위하여 체적 이미지의 지오메트릭 파라미터들을 분석하는 단계를 더 포함하는, 병리 샘플의 체적 이미징 방법.
16. 광학 이미징 시스템으로서,
    체적을 갖는 물체로부터 광을 수신하도록 구성된 입력부;
    상기 입력부와 광학적으로 통신하고 공간적으로 상이한 광학 채널들을 통해 수신된 상기 광을 투과시키도록 구성된 스펙트럼 선택적 광학 시스템; 및
    상기 공간적으로 상이한 광학 채널들을 통해 횡단된 광을 수신하도록 구성된 광검출기를 포함하고,
    상기 공간적으로 상이한 이미징 채널들의 유효 광학 파워 (effective optical power) 들은 서로 상이하고,
    상기 공간적으로 상이한 광학 채널들을 통해 횡단된 광은 상기 물체의 체적을 정의하는 상이한 물체 평면들의 인접 이미지들로 상기 광검출기의 조리개를 충전하는, 광학 이미징 시스템.
17. 제 16 항에 있어서,
    상기 스펙트럼 선택적 광학 시스템은 스펙트럼 등거리 파장들에서 광을 투과시키도록 구성되는, 광학 이미징 시스템.
18. 제 16 항에 있어서,
    상기 스펙트럼 선택적 광학 시스템은, 수신된 상기 광의 공간적으로 코딩된 스펙트럼을 포함하는 출력을 생성하도록 구성된 디바이스를 포함하는, 광학 이미징 시스템.
19. 제 16 항에 있어서,
    공간적으로 상이한 광학 채널들은 빔 조향 반사기들을 포함하는, 광학 이미징 시스템.
20. 제 16 항에 있어서,
    상기 입력부는, 상기 물체를 지지하도록 구성된 현미경 스테이지 및 현미경 대물렌즈로부터 상기 현미경 스테이지를 이격시키는 거리를 변화시키도록 구성된 배치기가 구비된 현미경을 포함하는, 광학 이미징 시스템.
21. 제 16 항에 있어서,
    상기 스펙트럼 선택적 광학 시스템은, 상기 물체로부터 광 분포를 수신하고 수신된 상기 광 분포의 푸리에 변환 (FT) 에 대응하는 광 분포를 생성하도록 구성된 푸리에 변환 (FT) 디바이스를 포함하고, 상기 FT는 수신된 상기 광의 공간적으로 코딩된 스펙트럼 콘텐트를 포함하는, 광학 이미징 시스템.
22. 제 16 항에 있어서,
    상기 공간적으로 상이한 광학 채널들은, 상기 물체내에 상이한 심도들에 위치된 상기 물체의 층들을 나타내는 이미지들을 형성하도록 이미지 평면들 상에 스펙트럼 선택적 광학 시스템으로부터 수신된 광 분포를 리이미징하도록 구성된 빔 스플리터 (BS) 디바이스를 포함하는, 광학 이미징 시스템.
23. 복수의 이미지 평면들을 갖는 광학 이미징 시스템으로서,
    제 1 평면으로 물체를 이미징하도록 구성된 현미경;
    입력부 및 출력부를 갖고, 상기 입력부에서, 상기 현미경에 의해 상기 제 1 평면에서 형성된 이미지를 수신하고, 상기 출력부에서, 제 1 이미지의 푸리에 변환 (FT) 에 대응하는 광 분포를 생성하도록 구성된 푸리에 변환 (FT) 디바이스로서, 상기 FT는 상기 제 1 평면에서 상기 현미경에 의해 형성된 상기 이미지의 공간적으로 코딩된 스펙트럼 콘텐트를 포함하는, 상기 푸리에 변환 (FT) 디바이스;
    상기 FT 디바이스와 광학적으로 통신하는 빔 스플리터 (BS) 디바이스로서, 상기 BS 디바이스는 입력 광학 축을 갖고 상기 복수의 이미지 평면들에 각각 대응하는 복수의 광학 채널들을 포함하고, 상기 복수의 광학 채널들로부터의 상기 광학 채널들의 각각은, 상기 물체 내의 대응하는 심도에 위치된 상기 물체의 대응하는 층을 나타내는 대응하는 이미지를 형성하도록 대응하는 이미지 평면 상에 상기 광 분포를 리이미징하도록 구성된, 상기 빔 스플리터 (BS) 디바이스
    를 포함하는, 광학 이미징 시스템.
24. 제 21 항에 있어서,
    상기 FT 디바이스는 간섭계를 포함하는, 광학 이미징 시스템.
25. 제 21 항에 있어서,
    상기 BS 디바이스는 상기 BS 디바이스의 입력 광학 축에 대해 나선 및 계단형 관계로 배치된 조절가능한 미러들을 포함하는, 광학 이미징 시스템.
26. 제 21 항에 있어서,
    상기 복수의 이미지들로부터 상기 물체의 대응하는 층을 나타내는 상기 이미지의 일부는, 상기 물체의 상기 대응하는 층의 기하학적으로 코딩된 스펙트럼 콘텐트를 나타내는, 광학 이미징 시스템.
27. 제 21 항에 있어서,
    상기 물체내에 상이한 심도들에 위치된 상기 물체의 층들을 나타내는 이미지들을 검출하도록 구성된 광검출기를 더 포함하는, 광학 이미징 시스템.
28. 제 21 항에 있어서,
    상기 현미경은, 상기 물체를 받도록 구성된 현미경 스테이지, 및 상기 현미경 스테이지로부터 현미경 대물렌즈를 이격시키는 거리를 변화시키도록 구성된 배치기를 갖는, 광학 이미징 시스템.
29. 제 28 항에 있어서,
    상기 물체내에 상이한 심도들에 위치된 상기 물체의 층들을 나타내는 이미지들을 검출하도록 구성된 광검출기를 더 포함하고, 상기 물체가 상기 현미경 스테이지에 위치할 때, 상기 배치기의 구동은, 상기 복수의 광학 채널들에 대응하는 이미지 평면들의 적어도 하나가 상기 광검출기의 평면과 일치하게 하는, 광학 이미징 시스템.
30. 멀티스펙트럼 이미징 시스템으로서,
    생물학적 샘플을 받도록 구성된 현미경 스테이지 및 현미경 대물렌즈를 갖는 현미경;
    상기 현미경과 광학적으로 통신하고, 공간적으로 상이한 광학 채널들을 따라 상기 현미경 스테이지 상에 배치된 상기 생물학적 샘플의 이미지들을 형성하도록 구성된 다초점 이미지 획득 장치로서, 상기 공간적으로 상이한 광학 채널들은 상기 형성된 이미지들에 각각 대응하고, 상기 다초점 이미지 획득 장치는, 광검출기를 포함하고, 상기 생물학적 샘플과 연관된 광의 스펙트럼 분포는 상기 이미지들의 각각에서 기하학적 분포들에 의해 나타낸, 상기 다초점 이미지 획득 장치; 및
    상기 현미경 및 상기 다초점 이미징 장치와 동작가능하게 통신하는 프로세서를 포함하고,
    상기 프로세서는,
    유형의 컴퓨터 판독가능 매체 상에, 상기 적어도 하나의 이미지에 대응하는 이미지 데이터를 수신 및 저장하고,
    상기 광검출기의 평면에서 상기 생물학적 샘플의 미리결정된 이미지를 배치하는데 요구되는, 상기 현미경 대물렌즈 및 상기 현미경 스테이지 상에 배치된 상기 생물학적 샘플을 이격시키는, 거리의 변화를 결정하도록 프로그램된,
    멀티스펙트럼 이미징 시스템.
31. 제 30 항에 있어서,
    상기 거리를 변화시키도록 구성된 모터화된 배치기를 더 포함하고, 상기 모터화된 배치기는 상기 프로세서로 제어가능한, 멀티스펙트럼 이미징 시스템.
32. 제 30 항에 있어서,
    상기 다초점 이미지 획득 장치는, 상이한 이미지 평면들내에 위치된, 상기 공간적으로 상이한 광학 채널들에 각각 대응하는 이미지들을 형성하도록 구성되는, 멀티스펙트럼 이미징 시스템.
33. 제 30 항에 있어서,
    거리의 변화를 결정하도록 프로그램된 상기 프로세서는, 차이 이미지들을 형성하기 위해 상기 형성된 이미지들을 서로로부터 연속하여 감산하고, 상기 차이 이미지들과 연관된 세기 특성을 나타내는 성능 지수를 결정하고, 최고 성능 지수를 결정함으로써, 상기 거리의 변화를 결정하도록 프로그램된 프로세서를 포함하는, 멀티스펙트럼 이미징 시스템.
34. 제 33 항에 있어서,
    상기 프로세서는, 상기 최고 성능 지수를 결정한 것에 대응하여, 상기 광검출기의 평면에서 상기 최고 성능 지수에 대응하는, 상기 생물학적 샘플의 이미지를 배치하도록 상기 현미경 대물렌즈와 현미경 스테이지 사이의 상기 거리의 변화를 일으키도록 더 프로그램되는, 멀티스펙트럼 이미징 시스템.
35. 제 30 항에 있어서,
    상기 다초점 이미지 획득 장치는, 상기 기하학적 분포들을 변경하도록 구성되는, 멀티스펙트럼 이미징 시스템.
36. 시스템을 사용하여 생물학적 조직의 다초점 이미징을 위한 컴퓨터 프로그램 제품으로서,
    상기 시스템은
    (i) 현미경 대물렌즈, 상기 조직을 받도록 구성된 현미경 스테이지, 및 상기 스테이지로부터 상기 대물렌즈를 이격시키는 거리를 변화시키도록 구성된 모터화된 배치기를 갖는 현미경, 및
    (ii) 상기 조직의 이미지를 기록하도록 구성된 광검출기를 포함하고,
    상기 컴퓨터 프로그램 제품은, 컴퓨터 판독가능 프로그램 코드를 갖는 컴퓨터 사용가능한 매체를 포함하고,
    상기 컴퓨터 판독가능 프로그램은,
    물체내에 상이한 심도들에 위치된 물체 층들의 이미지들을 나타내는 이미징 데이터를 수신하기 위한 프로그램 코드; 및
    상기 광검출기의 평면에서 미리결정된 이미지를 배치시키는데 요구되는 상기 거리의 변화를 결정하기 위한 프로그램 코드를 포함하는,
    컴퓨터 프로그램 제품.
37. 제 36 항에 있어서,
    차이 이미지들을 형성하기 위하여 상기 이미지들을 서로로부터 감산하고 상기 차이 이미지들과 연관된 세기 특성을 나타내는 성능 지수들을 결정하기 위한 프로그램 코드를 더 포함하는, 컴퓨터 프로그램 제품.
38. 제 37 항에 있어서,
    상기 성능 지수들 중에서 최고 성능 지수를 결정한 것에 대응하여, 상기 광검출기의 평면에서 상기 최고 성능 지수에 대응하는 이미지를 배치하도록 상기 거리의 변화를 야기하기 위한 프로그램 코드를 더 포함하는, 컴퓨터 프로그램 제품.
39. 제 36 항에 있어서,
    상기 물체내에 상이한 심도들에 위치된 물체 층들의 이미지들의 적어도 하나에 대응하는 시각적으로 인지가능한 표현을 생성하기 위한 프로그램 코드를 더 포함하는, 컴퓨터 프로그램 제품.
40. 제 36 항에 있어서,
    상기 물체내에 상이한 심도들에 위치된 물체 층들의 상기 이미지들의 지오메트리의 분석에 기초하여 상기 조직으로부터 상기 광검출기에 의해 수신된 광의 스펙트럼 콘텐트를 결정하기 위한 프로그램 코드를 더 포함하는, 컴퓨터 프로그램 제품.
    
    

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