JP2014178357A - デジタル顕微鏡装置、その撮像方法およびプログラム - Google Patents

デジタル顕微鏡装置、その撮像方法およびプログラム Download PDF

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Abstract

【課題】大量の検体の画像を可及的に高い品質でかつ高速に取得することのできるデジタル顕微鏡装置を提供する。
【解決手段】スライドガラス上の検体ＳＰＬを含む領域を区画する複数の小領域について、小領域毎の観察像を撮像する観察像撮像部２０と、観察像撮像部により撮像された小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、評価領域毎にエッジ検出を行い、複数の観察像を区画に従って接続した接続画像において隣接する２つの観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて２つの観察像間のボケ評価量の差分を求める制御部５０とを具備する
【選択図】図１

Description

本技術は、生体サンプルなどの検体の拡大像を観察像として撮像するデジタル顕微鏡装置、その撮像方法およびプログラムに関する。
従来、デジタル顕微鏡装置で検体の全体を観察するために、スライドガラス上の検体を含む領域を区画する小領域を拡大撮像系により撮像し、小領域毎の複数の像を繋ぎ合わせて１枚の大画像が作成される。
拡大撮像系の対物レンズの焦点を撮像対象である病理検体に合わせる合焦方式にはオートフォーカス（ＡＦ：Ａｕｔｏ Ｆｏｃｕｓ）が採用される。例えば、拡大撮像系の対物レンズの焦点位置を光軸方向に所定間隔毎に移動させ、各々の移動位置で撮像を行い、撮像された各々の画像のうち最もコントラストが高い画像を撮像したときの位置を合焦位置として検出するものなどが提案されている（例えば、特許文献１参照）。この種の合焦方式は「コントラストＡＦ」と呼ばれる。
コントラストＡＦは、比較的高い焦点精度が得られるものの、焦点位置を探索するために対物レンズの焦点位置の移動および評価の繰り返しを伴う。このため焦点位置が得られるまでに比較的時間がかかる。
そこで、対物レンズを通して取り込んだ光をスプリッタレンズにより二つに分けて、二つの結像された画像の間隔から焦点の位置と方向を判断する「位相差ＡＦ」を採用した顕微鏡装置も提案されている（例えば、特許文献２参照）。この位相差ＡＦ方式は、コントラストＡＦ方式に比べて焦点探索の必要が無いため高速に焦点位置を得ることができる。しかしその反面、撮像面内にある対象物の大きさや組織の数により精度が低下するおそれがある。
特開２０１１−１９７２８３号公報 特開２０１１−０９０２２２号公報
デジタル顕微鏡装置では、大量の検体の画像を可及的に高い品質でかつ高速に取得したいという要望があるものの、未だ十分な解決には至っていない。
以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、大量の検体の画像を可及的に高い品質でかつ高速に取得することのできるデジタル顕微鏡装置、その撮像方法およびプログラムを提供することにある。
上記の課題を解決するために、本技術にかかるデジタル顕微鏡装置は、スライドガラス上の検体を含む領域を区画する複数の小領域について、当該小領域毎の観察像を撮像する観察像撮像部と、前記観察像撮像部により撮像された前記小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、当該評価領域毎にエッジ検出を行い、前記複数の観察像を前記区画に従って接続した接続画像において隣接する２つの前記観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて前記２つの前記観察像間のボケ評価量の差分を求める制御部とを具備する。
前記制御部は、前記ボケ評価量の差分が予め決められた許容範囲から逸脱する前記観察像間の境界部分をボケ境界部分として判定するものであってよい。
前記制御部は、前記ボケ境界部分の判定結果をもとに、前記観察像撮像部によって再撮像を行うべき前記小領域と、前記再撮像を行うべき小領域に対する前記再撮像の条件を決定するものであってよい。
より具体的には、前記制御部は、前記ボケ境界部分によって囲まれた前記小領域を前記再撮像を行うべき小領域として判定し、前記再撮像の条件としてオートフォーカス方式を切り替えることを決定してもよい。
これにより、検体の状態に応じた、より適切なオートフォーカス方式による観察像が得られる。
前記制御部は、所定の一軸方向に連続するｎ（但し、ｎは３以上の整数）個の各々の小領域間に前記ボケ境界部分が存在することが判定された場合に、そのｎ個の小領域を再撮像を行うべき小領域として判定し、前記再撮像の条件として、前記観察像撮像部による前記一軸方向の撮像範囲を初回撮像時の撮像範囲の１／ｍ（但し、ｍは２以上の整数）に変更し、一つの小領域をｍ個の領域に分けて再撮像することを決定してもよい。
これにより、例えば、検体がスライドガラス面に対して大きく傾いた姿勢で封入されたプレパラートなどからも、検体の良好な観察像を得ることが可能である。
また、本技術にかかるデジタル顕微鏡装置は、前記スライドガラス上の検体の全体を撮像するサムネイル像撮像部をさらに具備し、前記制御部は、前記観察像撮像部により再撮像された前記小領域の観察像を含む前記接続画像について前記ボケ境界部分が再度判定された場合、前記サムネイル像撮像部により撮像されたサムネイル像において前記ボケ境界部分の位置を明示した画像を生成して表示部に表示させるものであってよい。
これにより、例えば、ユーザは、接続画像におけるボケ境界部分の位置を確認しながら、実のプレパラート上の該当するボケ境界部分を目視で確認し、もしプレパラートにゴミなどが入り込んでいた場合には、例えば、マニュアルで焦点位置を合わせて再撮像をすることができる。
本技術かかる別の側面であるデジタル顕微鏡装置の撮影方法は、スライドガラス上の検体を含む領域を区画する複数の小領域について、当該小領域毎の観察像を撮像する観察像撮像部により撮像された前記小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、当該評価領域毎にエッジ検出を行い、前記複数の観察像を前記区画に従って接続した接続画像において隣接する２つの前記観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて前記２つの前記観察像間のボケ評価量の差分を求めるものである。
本技術かかる別の側面であるプログラムは、スライドガラス上の検体を含む領域を区画する複数の小領域について、当該小領域毎の観察像を撮像する観察像撮像部により撮像された前記小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、当該評価領域毎にエッジ検出を行い、前記複数の観察像を前記区画に従って接続した接続画像において隣接する２つの前記観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて前記２つの前記観察像間のボケ評価量の差分を求める制御部としてコンピュータを動作させるものである。
以上のように、本技術によれば、大量の検体の画像を可及的に高い品質でかつ高速に取得することができる。
本実施形態に係るデジタル顕微鏡装置の全体構成を示した図である。 図１のデジタル顕微鏡装置における統合制御部の機能ブロック図である。 図１のデジタル顕微鏡装置による撮像動作の流れを示すフローチャートである。 グレースケール画像に変換された観察像の一部を示す図である。 図４の観察像における評価領域の具体的な設定例とボケ境界部分の判定結果を示す図である。 第２の判定方法により再撮像すべき小領域が判定される観察像の例を示す図である。 図７の観察像に対するボケ境界部分の判定結果を示す図である。 スライドガラス面に対して大きく傾いた姿勢で配置された検体の一部のｘ−ｚ軸断面と、焦点位置、焦点位置毎の撮像範囲、許容ボケ評価量、合焦領域およびボケ領域の関係を示す図である。 再撮影の説明図である。 サムネイル像の上にボケ境界部分の位置を明示した表示例を示す図である。 変形例１による再撮像の説明図である。 評価領域の別の設定方法を示す図である。 評価領域の別の設定方法を示す図である。 評価領域の別の設定方法を示す図である。 変形例４を説明する撮像動作のフローチャートである。 ボケ境界部分によって囲まれ、かつ互いに連結された複数の小領域の例を示す図である。
以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。
＜第１の実施形態＞
図１は、本実施形態に係るデジタル顕微鏡装置１００の全体構成を示した図である。
［全体構成］
このデジタル顕微鏡装置１００は、サムネイル像撮像部１０と、観察像撮像部２０と、位相差像取得部３０と、ステージ４０と、制御部５０とを有する。
サムネイル像撮像部１０は、検体ＳＰＬが配設されるプレパラートＰＲＴ全体の像（以下、この像を「サムネイル像」と称する。）を撮像する。
観察像撮像部２０は、プレパラートＰＲＴ上の検体ＳＰＬが所定倍率で拡大された像（以下、この像を「観察像」と称する。）を撮像する。
位相差像取得部３０は、観察像撮像部２０の対物レンズ２３の焦点とプレパラートＰＲＴ上の検体ＳＰＬとの光軸方向のずれの量と向きを情報として含む位相差像を撮像する。
ステージ４０は、プレパラートＰＲＴを載置してサムネイル像撮像部１０による撮像位置および観察像撮像部２０による撮像位置に移動させる。ステージ４０は、ステージ駆動機構４１により、観察像撮像部２０の対物レンズ２３の光軸の方向（ｚ軸方向）と、光軸の方向に対して直交する方向（ｘ軸方向およびｙ軸方向）に移動自在とされる。さらには、光軸の方向に対して直交する面に対して傾斜する方向にも移動自在なものであることが望ましい。また、光軸方向の移動は、例えばピエゾステージなどを用いることにより、対物レンズ２３を上下させる構成であってもよい。
なお、プレパラートＰＲＴは、血液等の結合組織、上皮組織又はそれらの双方の組織などの組織切片又は塗抹細胞からなる生体サンプルである検体ＳＰＬを、所定の固定手法によりスライドガラスに固定したものである。これらの組織切片又は塗抹細胞には、必要に応じて各種の染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色、ギムザ染色、パパニコロウ染色、チール・ネールゼン染色、グラム染色等に代表される一般染色のみならず、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ−Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）や酵素抗体法等の蛍光染色が含まれる。
このデジタル顕微鏡装置１００には、検体ＳＰＬを含むプレパラートＰＲＴを蓄積し、蓄積されたプレパラートＰＲＴを一つずつステージ４０の上にローディングするプレパラート・ストック・ローダ７０が付設されている。なお、プレパラート・ストック・ローダ７０はデジタル顕微鏡装置１００に組み込まれたものであってもよい。
次に、上述のサムネイル像撮像部１０と、観察像撮像部２０と、位相差像取得部３０と、制御部５０の詳細について説明する。
［サムネイル像撮像部１０］
サムネイル像撮像部１０は、図１に示したように、光源１１と、対物レンズ１２と、撮像素子１３とを有する。
光源１１は、ステージ４０のプレパラート配置面とは逆の面側に設けられる。光源１１は、一般染色が施された検体ＳＰＬを照明する光（明視野照明光）と、特殊染色が施された検体ＳＰＬを照明する光（暗視野照明光）とを切り替えて照射可能である。また、光源１１は、明視野照明光または暗視野照明光のいずれか一方だけを照射可能なものであってもよい。この場合、光源１１として、明視野照明光を照射する光源と、暗視野照明光を照射する光源の２種類の光源が設けられる。なお、暗視野照明光を照射する光源は、ステージ４０のプレパラート配置面側に設けられてもよい。
対物レンズ１２は、プレパラート配置面におけるサムネイル像撮像部１０の基準位置の法線を光軸ＳＲとして、ステージ４０のプレパラート配置面側に配設される。ステージ４０上に配設されたプレパラートＰＲＴを透過した透過光は、この対物レンズ１２によって集光され、対物レンズ１２の後方（すなわち、照明光の進行方向）に設けられた撮像素子１３に結像する。
また、前述のような有限共役配置ではなく、無限共役配置で、対物レンズ１２の後に結像レンズを配置し、撮像素子１３に結像するような構成であってもよい。
撮像素子１３には、ステージ４０のプレパラート配置面に載置されたプレパラートＰＲＴ全体を包括する撮像範囲の光が結像する。この撮像素子１３上に結像した像が、プレパラートＰＲＴ全体を撮像したサムネイル像となる。
［観察像撮像部２０］
観察像撮像部２０は、図１に示したように、光源２１と、コンデンサレンズ２２と、対物レンズ２３と、撮像素子２４と、コンデンサレンズ駆動機構２５と、ビームスプリッター２６とを有する。
光源２１は、明視野照明光を照射するものである。光源２１はステージ４０のプレパラート配置面とは逆の面側に設けられる。また、光源２１とは異なる位置（例えばプレパラート配置面側）には、暗視野照明光を照射する光源（図示せず）が設けられる。
コンデンサレンズ２２は、光源２１から照射された明視野照明光や暗視野照明用の光源から照射された暗視野照明光を集光して、ステージ４０上のプレパラートＰＲＴに導くレンズである。このコンデンサレンズ２２は、プレパラート配置面における観察像撮像部２０の基準位置の法線を光軸ＥＲとして、光源２１とステージ４０との間に配設される。
コンデンサレンズ駆動機構２５は、コンデンサレンズ２２を光軸ＥＲ方向に沿って駆動することによって、コンデンサレンズ２２の光軸ＥＲ上の位置を変える。
対物レンズ２３は、プレパラート配置面における観察像撮像部２０の基準位置の法線を光軸ＥＲとして、ステージ４０のプレパラート配置面側に配設される。観察像撮像部２０では、この対物レンズ２３を適宜交換することで、検体ＳＰＬを様々な倍率に拡大して撮像することができる。また、無限共役系で結像レンズを配置する構成の場合、上記の結像レンズを適宜交換することで、倍率を変更することも可能である。ステージ４０上に配設されたプレパラートＰＲＴを透過した透過光は、対物レンズ２３によって集光され、ビームスプリッター２６に到達する。
ビームスプリッター２６は、対物レンズ２３を透過した透過光を、撮像素子２４へと向かう反射光と、位相差像取得部３０内のフィールドレンズ３２へと向かう透過光とに分岐する。
撮像素子２４には、撮像素子２４の画素サイズ及び対物レンズ２３の倍率に応じて、ステージ４０のプレパラート配置面上における小領域の撮像範囲の像が結像される。
［位相差像取得部３０］
位相差像取得部３０は、図１に示したように、フィールドレンズ３２と、セパレータレンズ３３と、撮像素子３４とを有する。
フィールドレンズ３２は、ビームスプリッター２６を透過した反射光を集光して、フィールドレンズ３２の後方（反射光の進行方向側）に設けられたセパレータレンズ３３へと導く。
セパレータレンズ３３は、フィールドレンズ３２から導光された光束を２つの光束に分割する。分割された光束は、セパレータレンズ３３の後方（反射光の進行方向側）に設けられた撮像素子３４の結像面に対して１組の被写体像を形成する。
撮像素子３４には、セパレータレンズ３３を透過した１組の被写体像がそれぞれ結像する。セパレータレンズ３３には、フィールドレンズ３２を射出した様々な方向の光束が入射するため、形成される１組の被写体像間には位相差が存在する。以下では、この１組の被写体像を「位相差像」と称する。
なお、以上の説明では、対物レンズ２３と撮像素子２４との間にビームスプリッター３１が設けられる場合について説明したが、光線を分岐するための光線分岐手段はビームスプリッターに限定されるわけではなく、可動式ミラー等を利用することも可能である。
また、以上の説明では、位相差像取得部３０を対物レンズ２３の光軸ＥＲ上に配置し、観察像撮像部２０の撮像素子２４をビームスプリッター２６にて分岐された反射光が入射される位置に配置した。しかし、逆に、観察像撮像部２０の撮像素子２４を対物レンズ２３の光軸ＥＲ上に配置し、位相差像取得部３０をビームスプリッター２６にて分岐された反射光が入射される位置に配置してもよい。
また、前述の説明では、位相差像取得部３０内の位相差ＡＦ光学系としてフィールドレンズ、セパレータレンズ及び撮像素子を有する構成を示したが、かかる例に限定されるわけではない。かかる位相差ＡＦ光学系は、例えば、フィールドレンズ及びセパレータレンズの代わりにコンデンサレンズ及び２眼レンズを利用したりするなど、同等の機能を実現可能なものであれば、他の光学系であってもよい。
また、サムネイル像撮像部１０、観察像撮像部２０及び位相差像取得部３０それぞれに設けられる撮像素子は、１次元撮像素子（ラインセンサ）であってもよく、２次元撮像素子（エリアセンサ）であってもよい。
［制御部５０］
制御部５０は、統合制御部５１と、照明制御部５２と、ステージ駆動制御部５３と、コンデンサレンズ駆動制御部５４と、位相差像撮像制御部５７と、サムネイル像撮像制御部５６と、観察像撮像制御部５５と、記憶部５８と、現像部５９と、画像符号化部６０と、通信部６１と、表示制御部６２を有する。
統合制御部５１は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）と、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）と、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）とを含むコンピュータのハードウェア要素で構成される。あるいはＦＰＧＡ（ｆｉｅｌｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｇａｔｅ ａｒｒａｙ）などの専用ＩＣによって構成されてもよい。統合制御部５１は、照明制御部５２、ステージ駆動制御部５３、コンデンサレンズ駆動制御部５４、観察像撮像制御部５５、サムネイル像撮像制御部５６、位相差像撮像制御部５７、記憶部５８、現像部５９、画像符号化部６０、通信部６１、表示制御部６２との間で各種信号をやりとりして、観察像を取得するための様々な演算処理および制御を実行する。ＲＡＭには、そのための各種のプログラムおよびデータがロードされ、ＣＰＵはＲＡＭにロードされたプログラムを実行する。ＲＯＭには、ＲＡＭにロードされるプログラムやデータなどが格納される。
照明制御部５２、ステージ駆動制御部５３、コンデンサレンズ駆動制御部５４、位相差像撮像制御部５７、サムネイル像撮像制御部５６および観察像撮像制御部５５は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭなどを含むコンピュータのハードウェア要素で構成されてもよいし、ＦＰＧＡなどの専用ＩＣによって構成されてもよい。
現像部５９および画像符号化部６０は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭなどを含むコンピュータのハードウェア要素で構成される。あるいはＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）によって構成されてもよい。
照明制御部５２は、統合制御部５１から与えられる、検体ＳＰＬの照明方法の指示をもとに光源１１、２１の制御を行う。例えば、照明制御部５２は、統合制御部５１からの指示に従って、光源１１、２１の照明光の強度や、明視野用の光源、暗視野用の光源など、光源の種類の選択等を行う。明視野用の光源としては、例えば、可視光を照明するものなどが想定される。明視野用の光源としては、例えば、特殊染色で用いられる蛍光マーカを励起可能な波長を含む光を照明するものなどが挙げられる。
ステージ駆動制御部５３は、例えば、統合制御部５１からサムネイル像を撮像する指示が与えられると、プレパラートＰＲＴ全体が撮像素子１３の撮像範囲に入るようにステージ駆動機構４１を駆動して、ステージ面方向（ｘ軸およびｙ軸の方向）にステージ４０を移動させる。ステージ駆動制御部５３は、プレパラートＰＲＴ全体に対物レンズ１２の焦点が合うようにステージ駆動機構４１を駆動してステージ４０をｚ軸方向に移動させる。また、ステージ駆動制御部５３は、統合制御部５１から観察像を撮像する指示が与えられると、その指示された検体ＳＰＬの小領域が撮像素子２４の撮像範囲に入るように、ステージ駆動機構４１を駆動して、ステージ面方向にステージ４０を移動させる。ステージ駆動制御部５３は、対物レンズ２３の焦点を検体ＳＰＬに合わせるように、ステージ駆動機構４１を駆動してステージ４０をｚ軸方向に移動させる。
コンデンサレンズ駆動制御部５４は、統合制御部５１からの照明視野絞りに関する情報に基づいてコンデンサレンズ駆動機構２５の制御を行うことで、光源２１からの照明光が検体ＳＰＬの撮像対象の小領域にだけ当たるように調整する。照明視野絞りに関する情報はデフォーカス量とデフォーカスの向きを含む。これらの情報は、位相差像取得部３０により生成される一組の位相差像の距離をもとに求められる。
位相差像撮像制御部５７は、位相差像取得部３０に設けられた撮像素子３４の結像面に結像した一組の位相差像の信号を取得し、統合制御部５１に供給する。統合制御部５１は、位相差像撮像制御部５７より取得した一組の位相差像の距離をもとに、観察像撮像部２０の対物レンズ２３の焦点の検体ＳＰＬに対するデフォーカス量とデフォーカスの向きを算出する。統合制御部５１は、これらの情報をもとにステージ４０の制御情報を生成し、ステージ駆動制御部５３に供給する。ステージ駆動制御部５３は、統合制御部５１からの制御情報をもとにステージ４０をｚ軸方向に移動させるようにステージ駆動機構４１を駆動する。これにより、観察像撮像部２０の対物レンズ２３の焦点を検体ＳＰＬに合わせる位相差ＡＦ（Ａｕｔｏ Ｆｏｃｕｓ）が行われる。
サムネイル像撮像制御部５６は、サムネイル像撮像部１０の撮像素子１３の結像面に結像したサムネイル像に対応する信号をもとに当該サムネイル像に対応するデータを生成して統合制御部５１に供給する。統合制御部５１は、サムネイル像撮像制御部５６から取得したサムネイル像から検体ＳＰＬが存在する領域を検体領域として検出し、さらに、この検体領域を観察像撮像部２０の視野に応じたサイズの複数の領域にメッシュ状に区画して各々の領域を、観察像撮像部２０によって一回に撮像される領域として設定するなどの処理を行う。以下、この領域を「小領域」と呼ぶ。
観察像撮像制御部５５は、観察像撮像部２０の撮像素子２４の結像面に結像した小領域毎の観察像に対応する信号をもとに当該小領域毎の観察像に対応するＲＡＷデータを生成して統合制御部５１に供給する。統合制御部５１は、観察像撮像制御部５５より取得した小領域毎のＲＡＷデータを現像部５９に供給して現像処理を実行させる。統合制御部５１は、現像部５９にて現像された小領域毎の観察像のデータを接続して検体ＳＰＬ単位の大画像を生成し、生成された検体ＳＰＬ単位の大画像をタイルと呼ばれる所定の解像度の単位に分割する処理などを行う。さらに、統合制御部５１は、生成された各々のタイルを画像符号化部６０に供給して、所定の圧縮符号化形式の画像データを生成させ、記憶部５８に保存させる。
記憶部５８は、デジタル顕微鏡装置１００を制御するための各種設定情報やプログラム、さらには所定の圧縮符号化形式のタイル群などを格納する。
現像部５９は、観察像撮像部２０によって撮像された小領域毎の観察像のＲＡＷデータを現像する。
画像符号化部６０は、タイル毎の画像データを所定の画像圧縮形式に符号化する。ここで、画像圧縮形式として、例えば、ＪＰＥＧ（Ｊｏｉｎｔ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｅｘｐｅｒｔｓ Ｇｒｏｕｐ）などが採用される。勿論、ＪＰＥＧ以外の圧縮符号化形式が採用されてもよい。
記憶部５８に記憶された各タイルは、通信部６１によってネットワーク８０を通じて画像管理サーバ８１に蓄積される。画像管理サーバ８１は、ビューワ端末８２からのリクエストに応じて該当する１以上のタイルをビューワ端末８２に応答する。ビューワ端末８２は、画像管理サーバ８１より取得した１以上のタイルを用いて表示用の観察像を生成して、ビューワ端末８２の表示部に表示させる。
表示制御部６２は、デジタル顕微鏡装置１００に接続された表示部９０に表示させる画面データを生成する。
［観察像撮像系のオートフォーカス］
この実施形態のデジタル顕微鏡装置１００には、観察像撮像部２０の対物レンズ２３の焦点を撮像対象である検体ＳＰＬに自動的に合わせるオートフォーカス機能として、位相差オートフォーカス方式およびコントラストオートフォーカス方式が実装されている。
位相差オートフォーカス方式を用いる場合、統合制御部５１は位相差像撮像制御部５７に位相差像を撮像させるように指示を出す。位相差像撮像制御部５７は、この指示を受けると、位相差像取得部３０から、撮像素子３４の撮像面に並んで結像された一組の位相差像の信号を取り込み、これらの位相差像の位相差を求める。
観察像撮像部２０において、対物レンズ２３の焦点が適切な面から遠ざかると、２つの位相差像上における観測面の同一の領域は、撮像素子２４の外側方向に向かって互いに離れるように移動する。逆に、対物レンズ２３の焦点が適切な面よりも近くなると、２つの位相差像上における観測面の同一の領域は撮像素子２４の内側方向に向かって互いに近づくように移動する。統合制御部５１は、２つの位相差像上における観測面の同一の領域間の距離を、上記の位相差として求める。
統合制御部５１は、求めた位相差から対物レンズ２３の焦点の検体ＳＰＬに対するデフォーカス量とデフォーカスの向きを求める。統合制御部５１は、求めたデフォーカス量とデフォーカスの向きをもとにステージ４０の制御情報を生成し、ステージ駆動制御部５３に供給する。ステージ駆動制御部５３は、統合制御部５１からの制御情報をもとにステージ４０をｚ軸方向に移動させるようにステージ駆動機構４１を駆動する。このようにして観察像撮像部２０の対物レンズ２３の焦点を検体ＳＰＬに合わせる位相差オートフォーカスが行われる。
位相差オートフォーカス方式は、コントラストオートフォーカス方式に比べて焦点探索の必要が無いため高速に焦点位置を得ることができる。その反面、撮像面内にある対象物の大きさや組織の数により精度が低下するおそれがある。
一方、コントラストオートフォーカス方式は、観察像撮像部２０を用いて山登り方式で焦点探索を行う方式である。コントラストオートフォーカス方式を用いる場合、統合制御部５１は、対物レンズ２３の焦点位置を所定の距離ずつずらし、各々の焦点位置で観察像撮像部２０に撮像を実行させる。統合制御部５１は、撮像された画像の中でコントラストがもっとも高い画像が撮像されたときの焦点位置を最適な焦点位置として判定する。
コントラストオートフォーカス方式は、一般的に、位相差オートフォーカス方式に比較して高い焦点精度が得られるとされている。しかし、焦点位置を探索するために対物レンズの焦点位置の移動および評価の繰り返しを伴う。このため焦点位置が得られるまでに比較的時間（焦点探索時間）がかかる。
また、位相差オートフォーカス方式とコントラストオートフォーカス方式のいずれの方式をもってしても十分な焦点精度が得られない場合もある。例えば、プレパラートＰＲＴにおいて検体ＳＰＬがスライドガラス面に対して大きく傾いた姿勢で封入されている場合には、どの高さ位置に焦点が設定されても、許容範囲を逸脱する程度のボケが部分的に発生してしまう可能性がある。
上記のように、デジタル顕微鏡装置では、小領域毎に位相差オートフォーカス方式またはコントラストオートフォーカス方式により焦点を検出して観察像の撮像が行われる。このため、場所によっては不十分な合焦状態での撮像が行われる可能性がある。その場合には、小領域単位の観察像が全体的あるいは部分的にボケた状態となる。しかし、このようにボケた観察像は、スティッチング処理によって複数の小領域の観察像を接続することによって生成された大画像をユーザが観察した際に、そのボケた観察像部分が周囲の観察像との対比によって目立つことによってはじめて発見されることが多かった。
本実施形態のデジタル顕微鏡装置１００は、上記の課題を解決するために、以下の機能を備えるものである。
すなわち、本実施形態のデジタル顕微鏡装置１００は、観察像撮像部２０により撮像された小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、当該評価領域毎にエッジ検出を行う。続いてデジタル顕微鏡装置１００は、複数の観察像を接続した接続画像において隣接する２つの観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて２つの観察像間のボケ評価量の差分を求める。そしてデジタル顕微鏡装置１００は、２つの観察像間のボケ評価量の差分が予め決められた許容範囲から逸脱する当該観察像間の境界部分をボケ境界部分として判定し、この判定結果をもとに、観察像撮像部によって再撮像を行うべき小領域と、この小領域に対する再撮像の条件を決定する。
以下に、かかる機能の詳細を説明する。
［統合制御部５１の機能］
図２は、統合制御部５１の機能ブロック図である。
同図に示すように、統合制御部５１は、検体領域検出部５１１、小領域設定部５１２、スティッチング部５１３、ボケ評価部５１４、再撮像制御部５１５を備える。これらの機能は、統合制御部５１内のＣＰＵがＲＡＭにロードされたプログラムを実行することによって実現される。
検体領域検出部５１１は、サムネイル像撮像制御部５６がサムネイル像撮像部１０を用いて取得したサムネイル像において、検体ＳＰＬが存在する領域を検体領域として検出する。検体領域検出部５１１は、例えば、サムネイル像において、輝度値が急峻に変化する画素の分布から検体領域を判定する。輝度値が急峻に変化する画素の検出には、例えばエッジ検出によって検体の境界を検出する方法などが用いられる。なお、検体領域の判定はユーザがサムネイル像をモニターで観察し、マニュアルで行うことも可能である。
小領域設定部５１２は、検体領域検出部５１１により検出された検体領域を観察像撮像部２０の視野に応じたサイズ単位でメッシュ状に区画し、区画された各々の領域を観察像撮像部２０によって一回に撮像される領域（小領域）として設定する。小領域設定部５１２は、各々の小領域の位置に関する情報をステージ駆動制御部５３に与える。ステージ駆動制御部５３は、与えられた小領域の位置に関する情報をもとに、ステージ駆動機構４１を駆動して、観察像撮像部２０の撮像範囲に小領域が順次入るようにステージ４０を移動させる。そして小領域設定部５１２は、観察像撮像制御部５５に対して撮像を指示する。
スティッチング部５１３は、観察像撮像制御部５５により撮像された複数の小領域の観察像を接続して、検体ＳＰＬ単位の大画像（接続画像）を生成する。
ボケ評価部５１４は、小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、評価領域毎にエッジ検出を行い、上記の接続画像において隣接する２つの観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて２つの観察像間のボケ評価量の差分を求める。ボケ評価部５１４は、２つの観察像間のボケ評価量の差分が予め決められた許容範囲から逸脱する当該観察像間の境界部分をボケ境界部分として判定し、ボケ境界部分の判定結果をもとに、観察像撮像部２０によって再撮像を行うべき小領域を判定したり、再撮像を行うべき小領域に対する再撮像の条件を決定したりするものである。以下、ボケ評価部５１４による上記の一連の処理を「ボケ評価」と呼ぶ。
再撮像制御部５１５は、ボケ評価部５１４によって判定された、再撮像対象の小領域および再撮像の条件を受け、ステージ駆動制御部５３、観察像撮像制御部５５および位相差像撮像制御部５７を制御して、再撮像対象の小領域の再撮像を実行させるものである。
［撮像動作の流れ］
次に、本実施形態のデジタル顕微鏡装置１００による撮像動作の流れを、特に上記のボケ評価部５１４および再撮像制御部５１５の動作を中心に説明する。
図３は、かかる撮像動作の流れを示すフローチャートである。
まず、サムネイル像撮像部１０によって撮像されたサムネイル像が統合制御部５１に供給される。統合制御部５１においてサムネイル像が取得されると、検体領域検出部５１１が当該サムネイル像において検体領域を検出する（ステップＳ１０１）。
次に、統合制御部５１の小領域設定部５１２が、検体領域検出部５１１により検出された検体領域に対して複数の小領域を設定し、各々の小領域の位置に関する情報をステージ駆動制御部５３に与える一方で、観察像撮像制御部５５に撮像を指示する。これにより、小領域が観察像撮像部２０の撮像範囲に入るようにステージ４０が移動され、オートフォーカスが行われ、観察像撮像部２０による小領域の撮像が行われる（ステップＳ１０２）。この観察像の撮像の際に実行されるオートフォーカスの方式は位相差オートフォーカス方式およびコントラストオートフォーカス方式のいずれであってもよい。初回の撮影のためのオートフォーカス方式は、例えば、ユーザによって適宜選択可能であってもよい。
続いて、統合制御部５１のスティッチング部５１３が、小領域毎の観察像をｘ軸方向およびｙ軸方向に繋ぎ合わせるように接続して、検体ＳＰＬ単位の大画像（接続画像）を生成する（ステップＳ１０３）。
次に、ボケ評価部５１４によるボケ評価が次のように行われる。
［ボケ評価部５１４によるボケ評価］
ボケ評価部５１４は、処理の高速化のため、検体ＳＰＬ単位の大画像（接続画像）を、所定のビット数のグレースケール画像に変換する（ステップＳ１０４）。このとき処理のよりいっそうの高速化のため、グレースケール画像への変換の前に大画像（接続画像）を縮小したり、グレースケール画像に変換された観察像を縮小したりしてもよい。また、評価領域のみを切り出し、評価領域のみグレースケール画像に変換してもよい。
次に、ボケ評価部５１４は、グレースケール画像に変換された観察像あるいは縮小観察像に対して、フィルタリングによるエッジ検出を行う（ステップＳ１０５）。エッジ検出には、例えば、Canny法などを用いることができる。しかし、本技術はこれに限定されない。
次に、ボケ評価部５１４は、グレースケール画像に変換された観察像あるいは縮小観察像において複数の評価領域を設定する（ステップＳ１０６）。評価領域は、小領域毎の観察像に対して１以上設定される。評価領域は、小領域毎の観察像の外周領域付近に複数個設定されることが望ましい。
評価領域の具体的な設定方法を説明する。
図４はグレースケール画像に変換された観察像の一部を示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅはそれぞれ小領域毎の観察像の部分である。実際には、ｘ軸方向およびｙ軸方向にＡからＥ以外の小領域毎の観察像も接続されているが、図４においてそれらの図示は省略されてある。
図５は図４の観察像における評価領域の具体的な設定例を示す図である。Ａ１−Ａ４は小領域Ａの観察像に設定された評価領域、Ｂ１−Ｂ４は小領域Ｂの観察像に設定された評価領域、Ｃ１−Ｃ４は小領域Ｃの観察像に設定された評価領域、Ｄ１−Ｄ４は小領域Ｄの観察像に設定された評価領域、Ｅ１−Ｅ４は小領域Ｅの観察像に設定された評価領域である。この設定例では、それぞれの小領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ毎の観察像の外周領域付近の４辺の中間部分に評価領域が一つずつ設定される。
次に、ボケ評価部５１４は、各々の評価領域について上記のエッジ検出結果を用いて隣接する２つの小領域の観察像間のボケ評価量の差分を求める。すなわち、ボケ評価部５１４は、まず、エッジ検出結果からエッジ密度ｄを求める（ステップＳ１０７）。エッジ密度ｄは、例えば、エッジ検出により得られたエッジの強さが閾値を超える部分が評価領域において占める割合や、評価領域におけるエッジの強さの平均値など、である。一般的に、ボケ評価量が大きいほど、空間周波数が高い成分が減衰するため、エッジ密度ｄは低くなり、ボケ評価量が小さいほど、空間周波数が高い成分が多く含まれるため、エッジ密度ｄは高くなる。
次に、ボケ評価部５１４は、接続画像において隣接する小領域毎の観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ密度ｄの差Δｄの絶対値を、当該観察像間のボケ評価量の差分として求める（ステップＳ１０８）。
例えば、図５に示した評価領域の設定例によれば、接続画像において隣接する小領域の観察像間で最も近接する２つの評価領域とは、Ａ４とＢ１、Ｂ２とＣ３、Ｂ４とＤ１、Ｂ３とＥ２である。ここで、Ａ４とＢ１とのエッジ密度差の絶対値を｜ΔｄＡ４−Ｂ１｜、Ｂ２とＣ３とのエッジ密度差を｜ΔｄＢ２−Ｃ３｜、Ｂ４とＤ１とのエッジ密度差を｜ΔｄＢ４−Ｄ１｜、Ｂ３とＥ２とのエッジ密度差を｜ΔｄＢ３−Ｅ２｜とする。
ボケ評価部５１４は、エッジ密度差Δｄの絶対値が予め決められた閾値εより大きい２つの評価領域間の境界部分を、ボケ評価量の差分が予め決められた許容範囲から逸脱する「ボケ境界部分」として判定する（ステップＳ１０９）。すなわち、もし、隣接する２つの小領域に対してそれぞれ適切な焦点位置で撮像が行われている場合、それらの隣接する小領域の観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ密度ｄは同じ程度であるはずである。２つの評価領域間のエッジ密度差Δｄが大きいということは、少なくとも一方の小領域の観察像の少なくとも境界部分がボケていることを意味する。
また、一方の小領域に検体が存在しない場合もエッジ密度差Δｄが大きくなる。但し、これは、ボケ評価部５１４が、接続画像内の検体の存在の有無を判定し、該当する評価領域をボケ評価から除外することによって回避することが可能である。例えば、ボケ評価部５１４は、接続画像内の検体の存在しない背景に等しい領域を検出したり、逆に検体の染色に由来する色情報を含む領域を検出したりすることによって、検体の存在位置を判定することができる。この際、判定に使用する画像は、サムネイル像撮像部１０によるサムネイル画像、もしくは撮像素子１３による観察像のどちらでもよい。
さて、上記の各々のエッジ密度差と閾値εとの関係が、例えば、｜ΔｄＡ４−Ｂ１｜＞ε、｜ΔｄＢ２−Ｃ３｜＞ε、｜ΔｄＢ４−Ｄ１｜＞ε、｜ΔｄＢ３−Ｅ２｜＞εである場合、図５に示すように、小領域Ａと小領域Ｂとの境界部分、小領域Ｃと小領域Ｂとの境界部分、小領域Ｄと小領域Ｂとの境界部分、小領域Ｅと小領域Ｂとの境界部分がそれぞれ、ボケ境界部分３ＡＢ、３ＢＣ、３ＢＤ、３ＢＥとして判定される。
この後、ボケ評価部５１４は、このボケ境界部分の判定結果をもとに、観察像撮像部２０によって再撮像を行うべき小領域を判定したり、再撮像を行うべき小領域に対する再撮像の条件を決定したりする。より具体的には、次のようにして、再撮像を行うべき小領域の判定と、再撮像を行うべき小領域に対する再撮像の条件の決定が行われる。
ボケ境界部分が検出されなかった場合（ステップＳ１１０のＮＯ）、当該プレパラートＰＲＴの撮影は成功したものとして、当該プレパラートＰＲＴの撮影処理は終了となり、次のプレパラートＰＲＴの撮影が続いて実行される。
［再撮像をすべき小領域の判定方法と再撮像条件の決定方法］
再撮像をすべき小領域の判定方法としては、
１．ボケ境界部分によって囲まれた少なくとも１つ以上の小領域を、再撮像を行うべき小領域として判定する第１の判定方法。
２．所定の一の軸方向（ｘ軸またはｙ軸の方向）に連続するｎ（但し、ｎは３以上の整数）個の各々の小領域間にボケ境界部分が存在する場合に、そのｎ個の小領域を再撮像を行うべき小領域として判定する第２の判定方法。
とがある。
（第１の判定方法について）
ボケ評価部５１４は、ボケ境界部分によって四方が囲まれた小領域が存在する場合（ステップＳ１１１のＹＥＳ）、その小領域を再撮像を行うべき小領域として判定する。例えば、図６に示したように、小領域Ｂの観察像はボケ境界部分３ＡＢ、３ＢＣ、３ＢＤ、３ＢＥによって四方が囲まれている。このような場合、小領域Ｂの観察像は全体的なボケた画像である場合が多い。ボケ評価部５１４は、このように四方がボケ境界部分によって囲まれている小領域Ｂを再撮影を行うべき小領域と判定し、再撮像制御部５１５に当該小領域Ｂの第１の条件による再撮像を指示する。
加えて、ボケ境界部分によって囲まれた複数の連結した小領域が存在する場合に、これら複数の小領域を再撮影を行うべき小領域として判定する。
図１６は、ボケ境界部分によって囲まれ、かつ互いに連結された複数の小領域の例を示す図である。説明の都合上、図１６に示す各々の小領域には１から１５のショット番号を付してある。ここで、ショット番号が７，８，１２，１３，１４，１９の６個の小領域は、ボケ境界部分によって囲まれ、かつ互いに連結された複数の小領域として判定される。
再撮像制御部５１５は、小領域Ｂの第１の条件による再撮像の指示を受けると、当該第１の条件に従ってオートフォーカス方式を変更して当該小領域Ｂの再撮像を行うように、ステージ駆動制御部５３、観察像撮像制御部５５および位相差像撮像制御部５７の制御を行う（ステップＳ１１２）。例えば、初回の撮像の際に位相差オートフォーカス方式で合焦が行われる場合、再撮像制御部５１５は再撮影時にはコントラストオートフォーカス方式で焦点探索を行うように制御をする。逆に、初回の撮像の際にコントラストオートフォーカス方式で焦点探索が行われる場合、再撮像制御部５１５は再撮影時には位相差オートフォーカス方式での合焦を行うように制御をする。
これにより、観察対象の状態に応じて、より適切なオートフォーカス方式による良好な観察像を効率的に得ることができる。例えば、初回の撮像時に効率を優先するために位相差オートフォーカス方式で撮像を行い、必要に応じて、コントラストオートフォーカス方式に切り替えて再撮像を行うことによって、大量のプレパラートＰＲＬに対する撮像効率の向上を期待できる。
（第２の判定方法について）
ボケ評価部５１４は、所定の一の軸方向（ｘ軸またはｙ軸の方向）に連続して並ぶｎ個の各々の小領域間にボケ境界部分が存在することを判定した場合には（ステップＳ１１３のＹＥＳ）、そのｎ個の小領域を再撮像を行うべき小領域として判定する。ここで、ｎは３以上の整数である。
図６は第２の判定方法により再撮像すべき小領域が判定される観察像の例である。図７に示すように、評価領域は前述と同様に設定される。この例では、ΔｄＢ２−Ｃ３｜＞ε、｜ΔｄＢ３−Ｅ２｜＞εが成立する一方で、｜ΔｄＡ４−Ｂ１｜＞ε、ΔｄＢ４−Ｄ１｜＞εは成立しない。したがって、この例では、図７に示すように、ｘ軸の方向に連続して並ぶ３個の各々の小領域Ｂ、Ｃ、Ｅ間にボケ境界部分３ＢＣ、３ＢＥが存在することが判定される。この結果、小領域Ｂ、Ｃ、Ｅが再撮影を行うべき小領域と判定される。ボケ評価部５１４は、このような再撮像の対象である小領域Ｂ、Ｃ、Ｅを判定すると、再撮像制御部５１５に当該小領域Ｂ、Ｃ、Ｅの第２の条件による再撮像を指示する。
このように所定の一の軸方向（ｘ軸またはｙ軸の方向）において周期的なボケが発生する要因としては、検体ＳＰＬがスライドガラス面に対して大きく傾いた姿勢で配置されていること、などが挙げられる。
また、検体ＳＰＬの面積の大部分がスライドガラス面に対して平行に配置されていても、検体の端が部分的に大きく傾くことがある。このような場合にも、所定の一の軸方向（ｘ軸またはｙ軸の方向）において周期的なボケが発生しやすい。
図８はスライドガラス面に対して大きく傾いた姿勢で配置された検体ＳＰＬの一部（小領域Ｂ、Ｃ、Ｅ）のｘ−ｚ軸断面（下の図）と、焦点位置z_focus1、z_focus2、z_focus3、焦点位置毎の撮像範囲、許容ボケ評価量δｚ、合焦領域およびボケ領域の関係を示す図である。
図中の縦軸は光軸方向ｚ、横軸はｘ方向である。z_focus1は小領域Ｃを撮像した際の焦点位置、z_focus2は小領域Ｂを撮像した際の焦点位置、z_focus3は小領域Ｅを撮像した際の焦点位置である。ボケ評価量は焦点位置と検体ＳＰＬの位置との差に比例することとする。また、検体ＳＰＬの傾きによって、ボケ評価量が予め決められた許容ボケ評価量δｚの範囲から逸脱した部分を「ボケ領域」と定義する。ボケ評価量が許容ボケ評価量δｚの範囲にある部分は「合焦領域」と定義する。
同図に示すように、検体ＳＰＬがスライドガラス面に対して大きく傾いた姿勢で配置されている場合、一軸方向（この例ではｘ軸方向）に連続する複数の小領域にわたって、小領域間の境界を挟んでボケ領域と合焦領域とが隣り合わせに現れる。すなわち、一軸方向（この例ではｘ軸方向）に並ぶｎ個の各々の小領域間にはボケ境界部分が存在することとなり、上記の第２の判定方法の判定条件が成立することとなる。
上記のようにしてボケ評価部５１４は、第２の判定方法によって再撮像の対象であるｎ個の小領域Ｂ、Ｃ、Ｅを判定すると（ステップＳ１１３のＹＥＳ）、再撮像制御部５１５に、これらｎ個の小領域Ｂ、Ｃ、Ｅの第２の条件による再撮像を指示する。
再撮像制御部５１５は、この第２の条件による再撮像の指示を受けると、観察像撮像部２０による一軸方向の撮像範囲を初回撮像時の撮像範囲の１／ｍに変更し、一つの小領域をｍ個の領域に分けて再撮像するようにステージ駆動制御部５３、観察像撮像制御部５５および位相差像撮像制御部５７の制御を行う（ステップＳ１１４）。なお、再撮影時のオートフォーカス方式は初回時と同じである。ｍは２以上の整数である。
図９は再撮影の具体例を示す図である。同図は、ｘ軸方向の撮像範囲を初回撮像時の撮像範囲の１／２に変更し、再撮像の対象である小領域Ｂ、Ｃ、Ｅをそれぞれ２回の撮像によってｘ軸方向において１／２のサイズずつ再撮像する例である。同図に示すように、この例は、小領域をｘ軸方向において並ぶ２つの領域に等分し、各々の領域毎にオートフォーカスによって得られた焦点位置で再撮像が行われる場合を示している。その結果、各小領域Ｂ、Ｃ、Ｅにおいて最大ボケ評価量が許容ボケ評価量δｚの範囲に収まり、ボケ領域の無い良好な観察像が得られたことを示している。
なお、ここでは、ｘ軸方向の撮像範囲を１／ｍに変更する場合を述べたが、合焦領域とボケ領域がｙ軸方向に連続するｎ個の小領域にわたって交互に現れる場合には、ｙ軸方向の撮像範囲を初回撮像時の撮像範囲の１／ｍに変更し、個々の小領域Ｂ、Ｃ、Ｅをそれぞれｍ個の領域に分けて再撮像すればよい。
観察像撮像部２０の撮像範囲を１／ｍに変更する方法としては以下のようなものがあげられる。
１．観察像撮像部２０の撮像素子３４としてラインセンサが用いられる場合、ステージ４０の撮像時の送り量を１／ｍに変更する方法。
２．観察像撮像部２０の撮像素子３４としてエリアセンサが用いられる場合、エリアセンサのｘ軸方向またはｙ軸方向の読み出しエリアの幅を初回撮像時の幅の１／ｍに制御する方法。
以上のようにして再撮像された観察像について、ボケ評価部５１４は上記のステップＳ１０７からステップＳ１０９と同様にボケ評価を行う（ステップＳ１１５）。このボケ評価の結果、ボケ境界部分が残っていないことが判定された場合（ステップＳ１１６のＮＯ）、当該プレパラートＰＲＴの撮影が成功したものとして、当該プレパラートＰＲＴの撮影処理は終了となり、次のプレパラートＰＲＴの撮影が続いて実行される。また、１以上のボケ境界部分が残っていることが判定された場合（ステップＳ１１６のＹＥＳ）、再撮像制御部５１５は、変更したオートフォーカス方式によっても焦点探索が失敗したものとみなし、検体のサムネイル像を表示した画面において、該当するボケ境界部分の位置を明示するように制御を行う（ステップＳ１１７）。
図１０は、サムネイル像の上にボケ境界部分の位置を明示した表示例を示す図である。ここで、表示部９０はデジタル顕微鏡装置１００の制御部５０に直接接続された表示装置であってよい。サムネイル像９１には、ボケ境界部分の位置が例えば枠線などの合成画像９２によって明示される。なお、合成画像９２に限らず、ボケ境界部分の位置をユーザが認識できるように、ボケ境界部分の位置の観察像の輝度、色を変えるなどして明示してもよい。
また、上記のサムネイル像の上にボケ境界部分の位置を明示して表示する画面のユーザインターフェースに、ユーザが閾値εの設定を変更できるような操作子（つまみ等）を設けてもよい。閾値εの設定の変更により、ボケ境界部分がユーザがより視認しやすい状態で表示させることが可能である。これにより、例えば、検体により許容ボケ量が変動するような場合に、ボケ境界部分の位置をユーザが確認する際の効率を向上させることができる。加えて、閾値εの調整によって、検体に応じたボケ境界部分の判定精度の向上を期待できる。
ユーザは、ボケ境界部分の位置の表示を見ながら、プレパラートＰＲＬ上の該当するボケ境界部分を目視もしくは拡大画像で確認し、もしプレパラートＰＲＬにゴミなどが入り込んでいた場合には、例えば、マニュアルで焦点位置を合わせて再撮像をすることができる。
ところで、第２の判定方法のｎの設定値によっては、第１の判定方法と第２の判定方法の両方の判定条件が同時に成立する可能性がある。そこで双方の判定方法による判定条件が同時に成立した場合には、次のようにすることができる。
１．第１の判定方法による判定結果を有効とする。
２．ｎの設定値に応じて、第１の判定方法による判定結果を有効とするか、第２の判定方法による判定結果を有効とするかを変更する。例えば、ｎが３である場合には第１の判定方法による判定結果を有効とし、ｎが４以上である場合には、第２の判定方法による判定結果を有効とする。
以上のように本実施形態によれば、次のような効果が得られる。
１．接続画像において互いに隣接する２つの小領域の観察像間のボケ評価量の差分を良好に求めることができる。
２．小領域の観察像間のボケ評価量の差分をもとに、当該観察像間の境界部分がボケ領域と合焦領域との境界部分としてのボケ境界部分であるかどうかを良好かつ効率的に判定することができる。
３．ボケ境界部分を良好かつ効率的に判定することができることによって、この結果をもとに再撮像をすべき小領域を良好に判定することができる。
４．再撮像時に初回撮像とは異なるオートフォーカス方式を使用することによって、検体の状態に応じた、より適切なオートフォーカス方式による観察像が得られる。
５．観察像撮像部２０による所定の一軸方向の撮像範囲を初回撮像時の撮像範囲の１／ｍに変更し、一つの小領域をｍ個の領域に分けて再撮像する検体ＳＰＬがスライドガラス面に対して大きく傾いた姿勢で封入されたプレパラートＰＲＴなどからも、検体の良好な観察像を得ることができる。
＜変形例１＞
上記の実施形態では、所定の一の軸方向（ｘ軸またはｙ軸の方向）に連続して並ぶｎ個の各々の小領域間にボケ境界部分が存在することが判定された場合には、上記一の軸方向の撮像範囲を初回撮像時の撮像範囲の１／ｍに変更し、一つの小領域をｍ回の撮像によって再撮像することとした。この制御に代えて、ステージ４０もしくは観察像撮像部２０の光学系を検体ＳＰＬの傾きを打ち消すように傾ける制御を行ってもよい。
また、検体ＳＰＬが部分的に傾いている場合は、該当する位置で局所的に傾きを打ち消すように傾ける制御を行ってもよい。
図１１は、本変形例１による再撮像の説明図である。このようにステージ４０もしくは観察像撮像部２０の光学系を、検体ＳＰＬの傾きを打ち消すように傾けることによって、撮像範囲の全域にわたって許容ボケ評価量δｚの範囲に検体ＳＰＬが収まり、ボケ領域の無い良好な観察像が得られることがある。この場合、最初に図中右側を所定の角度持ち上げるように傾かせて再撮像を行った後、ボケの再評価を行い、ボケ境界部分が残っていれば、逆に図中左側を所定の角度持ち上げるように傾かせて再撮像とボケの再評価を行えばよい。また、傾斜させる角度についても、段階的に角度を大きくしながら再撮像と再評価を繰り返せばよい。
＜変形例２＞
観察像における評価領域として、第１の実施形態では図５に示したように、小領域の４辺の中間部分に評価領域を設定することとした。これに限らず、図１２に示すように、各々の小領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの四隅に評価領域Ａ１−Ａ４、Ｂ１−Ｂ４、Ｃ１−Ｃ４、Ｅ１−Ｅ４が設定されてもよい。この場合、接続画像において隣接する小領域間で最も近接する２つの評価領域は、小領域Ａと小領域Ｂとの間で言えば、Ａ３とＢ１、Ａ４とＢ２の２組となる。そして、Ａ３とＢ１とのエッジ密度差の絶対値を｜ΔｄＡ３−Ｂ１｜、Ａ４とＢ２とのエッジ密度差の絶対値を｜ΔｄＡ４−Ｂ２｜とすると、
（｜ΔｄＡ３−Ｂ１｜＋｜ΔｄＡ４−Ｂ２｜）／２＞ε
が成立した場合に、小領域Ａと小領域Ｂとの境界部分がボケ境界部分として判定される。
その他の小領域間のボケ評価も同様に行われる。例えば、小領域Ｂと小領域Ｃとの間で言えば、接続画像において隣接する小領域間で最も近接する２つの評価領域とは、Ｂ１とＣ２、Ｂ３とＣ４の２組となり、上記と同様の計算方法によりボケ評価が行われる。
あるいは、図１３に示すように、小領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの観察像の個々の辺に対応して３つ以上の評価領域Ａ１−Ａ８、Ｂ１−Ｂ８、Ｃ１−Ｃ８、Ｅ１−Ｅ８が設定されてもよい。この場合のボケ評価のための計算方法も上記と同様である。
また、評価領域は必ずしも小領域の外周領域付近に設定される必要はなく、例えば、図１４に示すように、小領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄをｙ軸方向に２分する直線とｘ軸方向に２分する直線との交点を挟んだ計４本のそれぞれの直線に対して評価領域Ａ１−Ａ４、Ｂ１−Ｂ４、Ｃ１−Ｃ４、Ｅ１−Ｅ４が割り当てられてもよい。
＜変形例３＞
評価領域は検体領域であることが可及的に保証されていることが望ましい。検体の存在しない領域（非検体領域）と検体領域とのエッジ密度差Δｄは大きくなる傾向があるため、小領域の観察像間で最も近接する２つの評価領域のうち一方が非検体領域を含む場合には、双方の小領域の観察像とも焦点が合っているのにかかわらず、その小領域間の境界部分かボケ境界部分として誤って判定される可能性がある。
例えば、検体領域検出部５１１より検体領域が検出され、この検体領域が観察像の撮像対象となる。しかし、観察像撮像部２０の撮像範囲の単位で撮像が行われるため、実際には非検体部分を含む小領域も撮像されることがある。
そこで、次のような処理を加えることが可能である。
１．ボケ評価部５１４は、検体領域検出部５１１より検体領域の位置情報を取得する。この検体領域の位置情報は、当然ながら、観察像撮像部２０の撮像範囲よりはるかに高い分解能をもつ。
２．ボケ評価部５１４は、小領域に評価領域を設定するとき、検体領域の位置情報をもとに、当該評価領域内に非検体領域が含まれない位置を選んで評価領域の設定を行う。あるいは、評価領域のサイズや形状を変更してもよい。
これにより、評価領域内に非検体領域が含まれないようにすることができ、ボケ評価の精度を高めることができる。
＜変形例４＞
上記の第１の実施形態では、複数の小領域の観察像を接続して接続画像を生成してからボケ評価部５１４によるボケ評価の処理を行うこととした。
しかし、本技術はこれに限定されるものではない。
例えば、図１５に示すように、小領域の観察像の単位で、グレースケール変換（ステップＳ２０３）、エッジ検出（ステップＳ２０４）、評価領域の設定（ステップＳ２０５）、エッジ密度ｄの計算（ステップＳ２０６）を実行した後、複数の小領域の観察像を接続するようにしてもよい（ステップＳ２０７）。この後、エッジ密度差Δｄの計算（ステップＳ２０８）、ボケ境界部分の判定（ステップＳ２０９）が同様に行われる。
＜変形例５＞
上記の実施形態では、オートフォーカス方式を変更したり、撮像範囲を１／ｍに変更して一つの小領域をｍ回に分けて再撮像された観察像を再評価して、この評価の結果、ボケ境界部分が残っている場合には、検体のサムネイル像を表示した画面において該当するボケ境界部分の位置を明示することとした。これに限らず、初回の撮像により得られた観察像に対するボケ評価によってボケ境界部分が検出された場合に、検体のサムネイル像を表示した画面において該当するボケ境界部分の位置を明示するようにしてもよい。
なお、本技術は以下のような構成も採ることができる。
（１） スライドガラス上の検体を含む領域を区画する複数の小領域について、当該小領域毎の観察像を撮像する観察像撮像部と、
前記観察像撮像部により撮像された前記小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、当該評価領域毎にエッジ検出を行い、前記複数の観察像を前記区画に従って接続した接続画像において隣接する２つの前記観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて前記２つの前記観察像間のボケ評価量の差分を求める制御部と
を具備するデジタル顕微鏡装置。
（２）前記（１）に記載のデジタル顕微鏡装置であって、
前記制御部は、前記ボケ評価量の差分が予め決められた許容範囲から逸脱する前記観察像間の境界部分をボケ境界部分として判定する
デジタル顕微鏡装置。
（３）前記（２）に記載のデジタル顕微鏡装置であって、
前記制御部は、前記ボケ境界部分の判定結果をもとに、前記観察像撮像部によって再撮像を行うべき前記小領域と、前記再撮像を行うべき小領域に対する前記再撮像の条件を決定する
デジタル顕微鏡装置。
（４）前記（１）から（３）に記載のいずれかのデジタル顕微鏡装置であって、
前記制御部は、前記ボケ境界部分によって囲まれた前記小領域を前記再撮像を行うべき小領域として判定し、前記再撮像の条件としてオートフォーカス方式を切り替えることを決定する
デジタル顕微鏡装置。
（５）前記（１）から（４）に記載のいずれかのデジタル顕微鏡装置であって、
前記制御部は、所定の一軸方向に連続するｎ（但し、ｎは３以上の整数）個の各々の小領域間に前記ボケ境界部分が存在することが判定された場合に、そのｎ個の小領域を再撮像を行うべき小領域として判定し、前記再撮像の条件として、前記観察像撮像部による前記一軸方向の撮像範囲を初回撮像時の撮像範囲の１／ｍ（但し、ｍは２以上の整数）に変更し、一つの小領域をｍ個の領域に分けて再撮像することを決定する
デジタル顕微鏡装置。
（６）前記（１）から（５）に記載のいずれかのデジタル顕微鏡装置であって、
前記スライドガラス上の検体の全体を撮像するサムネイル像撮像部をさらに具備し、
前記制御部は、前記観察像撮像部により再撮像された前記小領域の観察像を含む前記接続画像について前記ボケ境界部分が再度判定された場合、前記サムネイル像撮像部により撮像されたサムネイル像において前記ボケ境界部分の位置を明示した画像を生成して表示部に表示させる
デジタル顕微鏡装置。
ＳＰＬ…検体
ＰＲＴ…プレパラート
１０…サムネイル像撮像部
２０…観察像撮像部
３０…位相差像取得部
４０…ステージ
５０…制御部
５１…統合制御部
５２…照明制御部
５３…ステージ駆動制御部
５４…コンデンサレンズ駆動制御部
５５…観察像撮像制御部
５６…サムネイル像撮像制御部
５７…位相差像撮像制御部
５８…記憶部
１００…デジタル顕微鏡装置
５１１…検体領域検出部
５１２…小領域設定部
５１３…スティッチング部
５１４…ボケ評価部
５１５…再撮像制御部

Claims (8)

  1. スライドガラス上の検体を含む領域を区画する複数の小領域について、当該小領域毎の観察像を撮像する観察像撮像部と、
    前記観察像撮像部により撮像された前記小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、当該評価領域毎にエッジ検出を行い、前記複数の観察像を前記区画に従って接続した接続画像において隣接する２つの前記観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて前記２つの前記観察像間のボケ評価量の差分を求める制御部と
    を具備するデジタル顕微鏡装置。
  2. 請求項１に記載のデジタル顕微鏡装置であって、
    前記制御部は、前記ボケ評価量の差分が予め決められた許容範囲から逸脱する前記観察像間の境界部分をボケ境界部分として判定する
    デジタル顕微鏡装置。
  3. 請求項２に記載のデジタル顕微鏡装置であって、
    前記制御部は、前記ボケ境界部分の判定結果をもとに、前記観察像撮像部によって再撮像を行うべき前記小領域と、前記再撮像を行うべき小領域に対する前記再撮像の条件を決定する
    デジタル顕微鏡装置。
  4. 請求項３に記載のデジタル顕微鏡装置であって、
    前記制御部は、前記ボケ境界部分によって囲まれた前記小領域を前記再撮像を行うべき小領域として判定し、前記再撮像の条件としてオートフォーカス方式を切り替えることを決定する
    デジタル顕微鏡装置。
  5. 請求項３に記載のデジタル顕微鏡装置であって、
    前記制御部は、所定の一軸方向に連続するｎ（但し、ｎは３以上の整数）個の各々の小領域間に前記ボケ境界部分が存在することが判定された場合に、そのｎ個の小領域を再撮像を行うべき小領域として判定し、前記再撮像の条件として、前記観察像撮像部による前記一軸方向の撮像範囲を初回撮像時の撮像範囲の１／ｍ（但し、ｍは２以上の整数）に変更し、一つの小領域をｍ個の領域に分けて再撮像することを決定する
    デジタル顕微鏡装置。
  6. 請求項２に記載のデジタル顕微鏡装置であって、
    前記スライドガラス上の検体の全体を撮像するサムネイル像撮像部をさらに具備し、
    前記制御部は、前記観察像撮像部により再撮像された前記小領域の観察像を含む前記接続画像について前記ボケ境界部分が再度判定された場合、前記サムネイル像撮像部により撮像されたサムネイル像において前記ボケ境界部分の位置を明示した画像を生成して表示部に表示させる
    デジタル顕微鏡装置。
  7. スライドガラス上の検体を含む領域を区画する複数の小領域について、当該小領域毎の観察像を撮像する観察像撮像部により撮像された前記小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、
    当該評価領域毎にエッジ検出を行い、
    前記複数の観察像を前記区画に従って接続した接続画像において隣接する２つの前記観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて前記２つの前記観察像間のボケ評価量の差分を求める
    デジタル顕微鏡装置の撮像方法。
  8. スライドガラス上の検体を含む領域を区画する複数の小領域について、当該小領域毎の観察像を撮像する観察像撮像部により撮像された前記小領域毎の観察像に１以上の評価領域を設定し、当該評価領域毎にエッジ検出を行い、前記複数の観察像を前記区画に従って接続した接続画像において隣接する２つの前記観察像間で最も近接する２つの評価領域のエッジ検出結果を用いて前記２つの前記観察像間のボケ評価量の差分を求める制御部
    としてコンピュータを動作させるプログラム。
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