CN114911047A - 用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜检查标本的方法和装置 - Google Patents
用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜检查标本的方法和装置 Download PDFInfo
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Abstract
提出一种用于确定焦平面的优化位置的方法，以用于通过显微镜检查标本，该方法包括以下步骤：a)用光照明标本并且在焦平面的不同位置处记录被照明的标本的图像，以便能够获得被照明的标本的一堆强度图像，其中，每个强度图像分配有焦平面的一个位置；b)根据至少两个强度图像计算相位图像，其中，计算出的相位图像分配有位于焦平面区域内的焦平面位置，所述焦平面区域的边界是所述至少两个强度图像的焦平面的两个间隔最远的位置；c)使用不同的强度图像多次重复步骤b)，以便能够获得一堆相位图像；d)针对每个相位图像计算至少一个聚焦测量值；以及，e)基于计算出的聚焦测量值和分配给相位图像的焦平面位置确定焦平面的优化位置。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜检查标本的方法和装置。
背景技术
未染色或荧光染色的显微标本在显微镜范围内的发射光记录中尤其经常表现出只有很小的对比度。因此，焦平面的优化位置(也可以被称为标本的焦点)在许多情况下无法使用基于对比度的软件自动聚焦来确定，在这种情况下，在不同的工作距离处或“聚焦位置”处记录多个发射光图像，并进行聚焦测量评估。光学对比方法(如DIC或相位对比方法)可以用于增加未染色标本的对比度。然而，这需要光学元件，这些光学元件要么需要从光束路径中移除以进行之后期望的荧光记录，要么不移除这些光学元件，这会损害荧光记录。此外，使用荧光记录来确定聚焦是已知的，在该情况下，例如在共焦检测的情况下，使用荧光信号的水平而不是图像中的清晰度。然而，荧光记录通常需要更长的曝光时间，并因此聚焦程序需要相对较长的时间。此外，已在此确定聚焦期间或作为随后进一步光剂量的结果，存在荧光染料漂白的风险，或在活细胞成像的情况下存在细胞被刺激光所损害的风险。
发明内容
因此，本发明的目的是开发一种用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜进行检查的方法和装置，从而可以稳健地快速地确定焦平面的优化位置，并且在可能的情况下没有用于系统的额外成本。
本发明在独立权利要求1和9中被限定。有利的改进方案在从属权利要求中被指定。
按照步骤a)，在被照明的标本的强度图像中，标本中的相位差(取决于焦平面的位置)可识别为图像中的强度的变化。因此，按照步骤b)，相位图像具有增大的相位对比度，记录的强度图像为更接近焦平面的优化位置。此外，不仅相位对比度发生变化，图像中的结构也发生变化，并因此相位对比度图像在焦平面的优化位置中也具有更大的高频分量。因此，根据聚焦测量，相位对比度图像中的此类频率分量可以用于确定焦平面的优化位置。
然后，可以在步骤d)中使用已知的聚焦测量(尤其是基于对比度的聚焦测量)来评估相位图像，从而可以为每个相位图像计算相应的聚焦测量值。然后，可以从聚焦测量值的序列中确定焦平面的优化位置已用于通过显微镜进行检查。例如，可以寻求聚焦测量值的最大值，并且可以将抛物线与最大值及其邻近值相配。然后，抛物线的相对位置指定焦平面的优化位置位于哪里。后者也可以位于强度图像的焦平面的位置之间。然而，也可以确定聚焦测量值的最大值并将相应的相位图像的焦平面位置确定为焦平面的优化位置。
在步骤a)中，用于记录强度图像的焦平面位置可以使用启停模式归位。然而，也可以在要横跨的整个z范围(焦平面的所有期望的位置)上实施连续移动，并在设想的焦平面位置处记录标本。由于在到达焦平面位置时执行记录并且由于照明仅受短光脉冲(例如10μs的数量级)影响，强度图像中的运动模糊被最小化。替代地，还可以将用于记录的相机的曝光时间设置得足够短，使得连续照明或持续照明成为可能。
为了能够在记录标本时尽可能准确地知道或限定焦平面的位置，标本的记录、照明和/或移动可以有利地通过触发器来控制。
尤其是，步骤a)中的记录可以是发射光记录。然而，也可以进行反射光记录。
优选地，在步骤b)中使用三个强度图像以实现计算相位图像的目的。然而，也可以使用四个、五个、六个或更多个强度图像以实现计算相位图像的目的。
尤其是，如在步骤a)中记录的，两个邻近强度图像的焦平面的位置之间的距离可以对应于用于记录图像的记录光学单元的景深的两倍。邻近强度图像的焦平面的位置之间的距离优选地是恒定的。然而，这个距离也可以变化。
在步骤a)中记录的所有强度图像的焦平面的位置也可以被称为z堆区域。例如，可以将这样的z堆区域调整为较早获得的聚焦值(例如通过改变z堆区域的相对位置和大小)。例如，如果已经在附近(即在横向方向上)确定了聚焦位置，则可以将z堆区域随之调整(例如最小化)。如果无法确定聚焦位置，则可以将z堆区域随之调整(例如扩展)。然而，也可以指定固定预定的z堆区域并在步骤a)中横跨该z堆区域。例如，在较早的点确定的聚焦值可以用作后续z堆的中心。
根据本发明，在步骤b)中，可以分别直接给至少两个强度图像分配焦平面的邻近位置。为了能够计算相位对比度图像，使用在z堆中不是直接邻接的强度图像可能是有利的。例如，与所记录的z堆中的强度图像相比，这些强度图像然后可以彼此具有更大的距离。因此，例如，可以使用堆中的下一个最接近的或第三个最接近的或第四个最接近的图像来计算相位对比度图像。
可以用不相干的光照明标本。优选地，用部分相干的光照明标本。这尤其被理解为，意味着存在受限的空间相干性和/或时间相干性。例如，由于在步骤a)中用光照明标本的照明模块的数值孔径小于在步骤a)中用于记录被照明的标本的图像的成像模块的数值孔径，可能产生受限的空间相干性。尤其是，照明模块的数值孔径可以小于或等于成像模块的数值孔径的0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.66倍、0.6倍或0.5倍。小于或等于0.16、0.1或0.09的值可以作为照明模块的数值孔径的绝对值存在。
可以通过限制照明光的波长光谱来产生时间相干性。为此可以提供适当的过滤器。尤其是，波长光谱可以小于或等于70nm或60nm。
此外，可以以如下方式限制检测侧上的时间相干性，使得过滤来自标本的光，以便使光谱具有小于或等于70nm或60nm的带宽，在步骤a)中使用被过滤的光来记录图像。例如，为此可以使用在荧光显微镜中提供的检测光束路径中的荧光发射过滤器。
此外，也可以使用具有窄光谱的光源产生用于在步骤a)中照明标本的光。这种光源可以是LED光源或激光光源。在步骤a)中用于照明标本的光的波长可以在可见波长范围内或者在近红外范围内。
可以在步骤d)中计算两个、三个或更多个不同聚焦测量值。例如，可以以加权方式或通过步骤e)中的多数决定来考虑各种聚焦测量的这些值。
然后可以使用所确定的焦平面的优化位置，例如执行尽可能清晰的标本记录(其中可以添加与焦平面的优化位置的偏移，例如以在使用不同波长或波长范围的记录的情况下考虑记录光学单元的纵向色差)和/或创建标本的聚焦图。通过显微镜检查标本可以使用显微镜来实施，显微镜尤其可以是荧光显微镜。标本可以是未染色或荧光染色的标本。显微镜可以被设计为发射光显微镜和/或反射光显微镜。
尤其是，根据本发明的用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜检查标本的装置可以借助显微镜来实现。
应当理解，在不背离本发明的范围的情况下，上面指定的特征和下面将要解释的特征不仅可以以指定的组合使用，而且可以以其他组合使用或单独使用。
附图说明
下面将基于示例性实施例并参考附图更详细地解释本发明，这些附图同样公开了对本发明必不可少的特征。这些示例性实施例仅是说明性的，并且不应被解释为是限制性的。例如，对具有多个元件或部件的示例性实施例的描述不应被解释为意味着所有这些元件或部件对于实施都是必要的。相反，其他示例性实施例也可以包含替代元件和部件、更少的元件或部件、或附加的元件或部件。除非另有说明，否则不同示例性实施例的元件或部件可以相互组合。针对示例性实施例之一描述的修改和变型也可以适用于其他示例性实施例。为避免重复，不同附图中的相同元件或对应元件采用相同的附图标记表示并不再多次解释。其中：
图1示出了根据本发明的用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜检查标本的装置的实施例的示意图；
图2示出了用于讨论被记录的强度图像和由此计算的相位图像的示意图；并且
图3示出了根据本发明的用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜检查标本的方法的实施例的流程图的示意图。
具体实施方式
图1示意性地示出了根据本发明的用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜检查标本2的装置1的实施例的结构，该显微镜在这种情况下被实施为用于确定标本2的焦平面的优化位置的显微镜1。在该实施例中，显微镜1被设计为反向发射光显微镜，反向发射光显微镜包括照明模块3、成像模块4以及用于控制照明模块3和成像模块4(由虚线13表示)的控制单元5。此外，示意性地绘制了光轴OA。
照明模块3包括光源6(例如LED光源)、聚光器光学单元7和光谱带通过滤器8。带通过滤器8可以在图1中的虚线位置(其中带通过滤器8定位在光束路径外部)和使用实线所示的位置(其中带通过滤器8定位在光束路径内)之间来回移动。
光源6可以优选地发射来自可见波长范围和/或来自红外范围的光。
成像模块4可以包括标本平台9、成像光学单元10和具有图像传感器12(例如CCD传感器或CMOS传感器)的相机11。
标本2可能是未染色或荧光染色的标本2，该标本在发射光记录中经常仅具有非常小的对比度，使得使用迄今为止已知的方法难以或不可能确定标本的焦平面的优化位置。
根据本发明，控制单元5以如下方式控制照明模块3以确定焦平面的优化位置，使得使用部分相干光来照明标本2，结果是标本2的借助成像光学单元10和相机11记录的发射光记录在对比度上变得更丰富。
由于传统显微镜中的发射光照明单元通常配备有不相干光源，因此根据本发明，借助经常通常显微镜的基本装备的显微镜部件，可以增加空间和/或时间相干性。例如，可以通过在孔径平面中设置小孔径或者将聚光光学单元7的可变光圈组合在一起从而减小其尺寸来增加不相干光源6的空间相干性。优选地，照明模块3的数值孔径小于成像模块4的数值孔径。因此，照明模块3的数值孔径例如可以为0.1、0.16、0.1或0.09。
例如，可以通过使用光谱带通过滤器8限制由光源6发射的光的光谱来增加时间相干性。例如，发射光的光谱带宽可以小于或等于70nm或60nm。
以此方式，来自光源6的光可以作为部分相干光入射到标本2上并且因此可以用其来照明标本。在过程中，借助成像光学单元4和相机11在焦平面的不同位置处以发射光实现被照明的标本2的图像，使得被照明的标本的一堆强度图像是可获得的，给每个强度图像分配焦平面的位置(z位置)(图3中的步骤S1)。在此处描述的示例中，例如，如图2示意性所示，记录了七个强度图像B1、B2、…B7，给每个强度图像分配焦平面的z位置(zB1、zB2、…zB7)。
因此，可以获得一堆强度图像B1-B7，也可以被称为散焦堆B1-B7。
如下所述，从这些强度图像B1-B7中计算出相位图像的z堆(图3中的步骤S2)。这里所利用的是，标本2中的取决于聚焦位置(或焦平面的位置)的相位差可以被视为图像中的强度变化。在这种情况下，从至少两个强度图像B1-B7(给强度图像分别分配焦平面的直接相邻位置)中计算出每个相位图像P1-P5(图2)。在这里描述的示例性实施例中，从三个强度图像中计算出每个相位图像P1。例如，从强度图像B1-B3中计算出相位图像P1并且从强度图像B4、B5和B6中计算出相位图像P4。基于焦平面的分配给至少两个强度图像B1-B7的位置zB1-zB7，给每个计算出的相位图像P1-P5分配焦平面位置zP1、zP2、...zP5。优选地，区域(其边界为用于计算相应相位图像的强度图像B1-B7的焦平面的间隔最远的位置)的中值被确定为焦平面位置zP1-zP7。因此，例如，zP1对应于zB2，并且zP4对应于zB5。
例如，基于强度传输方程(TIE)的算法可以用于相位图像P1-P5的这种计算。TIE的简化版本从恒定强度分布的近似值中产生(另见A.Barty、KANugent、D.Paganin和A.Roberts的“定量光学相位显微镜”(Quantitative optical phase microscopy)，Opt.Lett.23，817-819(1998))。
尽管这里描述的示例性实施例中的每个相位图像P1-P5是从分别分配给焦平面的直接相邻位置的至少两个强度图像B1-B7中计算出的，但这不是强制性的。也可能有利地是，用于计算相位图像(例如P2)的邻近强度图像(例如如果使用强度图像B1、B3和B5时的B1和B3，以及B3和B5)在焦平面(例如zB1、zB3和zB5)中具有不直接相邻的位置(因此在这种情况下为zB1和zB3，以及zB3和zB5)。因此，所使用的强度图像与该堆强度图像B1-B7中或散焦堆B1-B7中的直接相邻的强度图像B1-B7相比具有焦平面位置的更大间隔。
然后，为相位图像P1-P5中的每一个计算出至少一个聚焦测量值(图3中的步骤S3)。例如，聚焦测量是xy梯度的总和。
通过相位图像P1-P5给焦平面位置分配计算出的聚焦测量值。因此，焦平面的优化位置zopt可以从相位图像P1-P5的聚焦测量值的序列中确定。为此，例如可以搜索聚焦测量值的最大值并将抛物线与最大值及其邻近值相配，其中，该抛物线的相对位置用于准确确定焦平面的优化位置zopt，甚至在焦平面位置zP1-zP5之间以及因此的强度图像B1-B7的焦平面zB1-zB7的位置之间的优化位置zopt(图3中的步骤S4)。以示例性方式绘制在图2中的该确定的焦平面的优化位置zopt可以例如随后被归位，以便对标本2进行所期望的清楚记录(图3中的步骤S5)和/或创建聚焦图(图3中的步骤S6)。此外，例如可以将预先限定的偏移量添加到该确定的焦平面的优化位置zopt，以便例如能够考虑用于与发射光记录有关的荧光记录的不同聚焦位置。例如，如果光学图像表示具有纵向色差并且针对不同的波长/波长范围进行记录，则这可能是必要的。
例如，如果需要以放大的方式记录标本2的相对较大的区域，则可以创建聚焦图。在这种情况下，标本2在许多位置(每个位置被称为图像贴片)处以高倍率被记录并且图像贴片被结合以形成大的连续图像。由于在高倍率的情况下成像光学单元10的景深通常很小，并且标本2在景深的数量级处不是平面的或以相对于光轴倾斜的方式移动，因此标本2需要经常重新聚焦。因此，为了使实验快速运行，首先在标本2的不同支撑点确定标本2的焦平面的优化位置是有利的。在过程中，首先足够以大于一个图像贴片的间隔来实施这一点，并且足够通过插值来确定位于其间的图像贴片位置的焦平面的优化位置。
有利地，出于快速记录强度图像B1-B7的目的，可以不以启停模式来记录在相应z位置处的图像。相反，在所期望的z堆的整个区域上在z方向上进行连续移动，并且仅使用短光脉冲(例如，通过光源6大约10μs)来照明标本2，以便在z向移动期间最大限度地减少图像记录中的运动模糊。替代地，可以使用相机11的短曝光时间并让光源6连续发光。然而，其缺点是在某些情况下，标本2在曝光时间之外不必要地受到光负荷。附加地，由于连续照明，标本2中的热负荷可能太高。为了能够在图像记录期间尽可能准确地知道或限定标本2的z位置，有利的是，通过相机12、借助光源6的短期照明和使用触发器的z向移动来控制记录。z位置也可能以触发方式被读取。
当记录强度图像B1-B7时焦平面中的两个位置zB1-zB7之间的距离优选地是恒定的。此外，该距离可以优选地大于成像光学单元4的景深并且小于或等于成像光学单元4的景深的两倍。可以在聚光器光学单元7的孔径平面中设置针孔孔径，用于产生空间相干性的目的。尤其是，可以设置准准直照明。
时间相干性不仅可以通过所描述的带通过滤器8在照明侧实现，而且可以通过适当的带通过滤器在检测侧实现。在这种情况下，例如可以使用目前的荧光发射过滤器。
光源6可以是LED光源或激光光源。
所使用的波长可以来自可见光范围或近红外线。如果使用来自近红外的光，标本上的负荷可能较低和/或染料的漂白较少。还可以通过取决于波长的光束分裂器在荧光通道中并行地进行记录。所确定的焦平面的优化位置可以用于自动聚焦功能和/或用于创建具有单独界面的聚焦图。
根据本发明，还可以用不相干光来照明标本并且也不设置任何增加检测侧的相干性的措施。以这种方式，焦平面的优化位置zopt也可以通过相位图像P1-P5的至少一个聚焦测量描述的方式来确定。
除了上面已经描述的xy梯度总和的聚焦测量值之外，还可以使用本领域技术人员已知的其他聚焦测量方式，这些测量方式通常根据其基本方法评估图像(在这种情况下是相位图像P1-P5)的图像清晰度。可以以示例性方式将高斯滤波器或拉普拉斯滤波器应用于图像数据作为聚焦测量。阈值方法或方差方法也是可能的。尤其是，可以使用文献“对活检和细胞学显微镜图像的自动聚焦测量的评估”(Evaluation of autofocus measures formicroscopy images of biopsy and cytology)，R.Redondo等，Proc.of SPIE Vol.8011801194-1 to 801194-9中描述的聚焦测量。当然，也可以不仅使用一种聚焦措施，而且可以使用两种、三种或更多种不同的聚焦措施。
Claims (9)
1.一种用于确定焦平面的优化位置的方法，以用于通过显微镜检查标本(2)，所述方法包括以下步骤：
a)用光照明所述标本(2)，并且在所述焦平面的不同位置(zB1，zB2，...zB7)处记录被照明的标本(2)的图像(B1-B7)，以便能够获得被照明的标本(2)的一堆强度图像(B1-B7)，其中，每个强度图像(B1-B7)分配有所述焦平面的一个位置(zB1，zB2，...zB7)，
b)根据至少两个强度图像(B1-B7)计算相位图像(P1，P2，...P5)，其中，计算出的相位图像(P1-P5)分配有位于焦平面区域内的焦平面位置(zP1，zP2，...zP5)，所述焦平面区域的边界是所述至少两个强度图像(B1-B7)的所述焦平面的两个间隔最远的位置(zB1-zB5)，
c)使用不同的强度图像(B1-B7)多次重复步骤b)，以便能够获得一堆相位图像(P1-P5)，
d)针对每个相位图像(P1-P5)计算至少一个聚焦测量值，以及
e)基于计算出的聚焦测量值和分配给所述相位图像(P1-P5)的所述焦平面位置(zP1-zP5)确定所述焦平面的所述优化位置(zopt)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤a)中，照明标本(2)是借助照明模块(3)来实现的，并且对被照明的标本的所述图像的记录是借助成像模块(4)来实现的，其中，所述照明模块(3)的数值孔径小于所述成像模块(4)的数值孔径。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，通过其光谱具有小于或等于70nm的带宽的光来照明所述标本。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，过滤来自标本(2)的光，使得来自标本的光的光谱具有小于或等于70nm的带宽，步骤a)中的所述图像使用被过滤的光来记录。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在发射光中记录步骤a)中的所述图像。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤b)中，所述焦平面位置(zP1-zP5)位于所述焦平面区域的中心。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤b)中，给所述至少两个强度图像(B1-B7)在该堆强度图像(B1-B7)中分别分配所述焦平面的直接相邻位置。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，连续改变所述焦平面的位置，并且在这个过程中的不同位置处记录图像。
9.一种用于确定焦平面的优化位置以用于通过显微镜检查标本的装置，其中，所述装置包括用于照明标本(2)的照明模块(3)、用于记录被照明的标本(2)的图像(B1-B7)的成像模块(4)和用于控制所述照明模块(3)和所述成像模块(4)的控制单元(5)，
其中，所述控制单元(5)被设计成执行以下步骤：
a)用光照明所述标本(2)，并且在所述焦平面的不同位置(zB1，zB2，...zB7)处记录被照明的标本(2)的图像(B1-B7)，以便能够获得被照明的标本(2)的一堆强度图像(B1-B7)，其中，每个强度图像(B1-B7)分配有所述焦平面的一个位置(zB1，zB2，...zB7)，
b)根据至少两个强度图像(B1-B7)计算相位图像(P1，P2，...P5)，其中，计算出的相位图像(P1-P5)分配有位于焦平面区域内的焦平面位置(zPl，zP2，...zP5)，所述焦平面区域的边界是所述至少两个强度图像(B1-B7)的所述焦平面的两个间隔最远的位置(zB1-zB5)，
c)使用不同的强度图像(B1-B7)多次重复步骤b)，以便能够获得一堆相位图像(P1-P5)，
d)针对每个相位图像(P1-P5)计算至少一个聚焦测量值，以及
e)基于计算出的聚焦测量值和分配给所述相位图像(P1-P5)的所述焦平面位置(zP1-zP5)确定所述焦平面的所述优化位置(zopt)。
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