CN114047619B - 一种三维显微成像的方法及其成像光路结构 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维显微成像的方法及其成像光路结构，照明光源通过照明光阑形成点光源或通过狭缝形成线光源，经过第一透镜形成准直光束，再经起偏器使光束偏振方向调整为预设的方向，最后经分光镜反射进入照明主光路；光束依形成平行光束；经偏光棱镜分出两束偏振方向互相垂直的光束，两束光通过显微物镜投射在待检测的样品表面；两束光在样品表面形成两束反射光，并逆向重新合为一个光束，被探测器捕获并记录；结合扫描点的二维移动或扫描线的一维移动，合成高分辨率样品表面图像。该方法结合混合应用相衬技术和空间门控方法，层扫能力和三维方向都有较好分辨率，通过叠加成像方法，使得样品表面的划痕和凹/凸点的成像更清晰。

Description

一种三维显微成像的方法及其成像光路结构
技术领域
本发明涉及三维成像技术领域，具体为一种三维显微成像的方法及其成像光路结构。
背景技术
显微成像一直在追求更高的分辨率、更好的对比度以及一些特殊功能，如分层扫描以及一定的3D/准3D层析成像能力。多种光学成像方法针对不同的应用场景，都展现出自己的优点，比较有特点的显微成像方法有差分干涉衬度(DIC)、共聚焦、移频照明成像、受激发射损耗荧光显微成像等。
(透射式)差分干涉衬度(DIC)成像方法核心是利用偏光棱镜分出两束偏正方向垂直的光，并在光的传播方向上平行分开一点微小的距离(亚毫米级)，打在样品上，因为样品的厚度/杂质缺陷造成了两束光的光程差，待再经过一次偏光棱镜后合束，产生干涉，把(和光程相关)位相的变化以光强明暗变化的形式展现出来，靠成像边缘对比度的提升来获得伪3D的成像效果。共聚焦成像方法是依靠在照明端、像端设置光阑(小孔，狭缝)，实现对物像共轭成像的空间门控，只让待检测的样品的某个微小区域成像在相机端，待检区域之外的杂散光都被光阑实现空间遮挡过滤。在很多检测设备中，多模态显微成像(暨集成多种成像手段)也经比较普遍。
然而上述的每种成像方法都有其适合的应用场景和局限性：差分干涉衬度(DIC)适合检测样品表面的凹凸起伏及划痕，它有样品表面垂直方向的变化敏感度(定性但不定量)，可以对10nm级别的高度变化有响应，但是在水平方向上，就受制于阿贝成像极限而只能有微米级的水平分辨率。共聚焦成像有分层扫描的能力，而且在水平和垂直方向上都有亚微米的分辨率，但是其分辨率是靠光阑的孔径来控制的(照明光波长确定时)，更高的分辨率需要更小的孔径，则其缺点就是通过小孔的光强(照明和散射)也变小，影响了成像的亮度以及检测速度(相机需要更多曝光时间)。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提出了一种三维显微成像的方法及其成像光路结构，该方法结合混合应用相衬技术和空间门控方法，层扫能力和三维方向都有较好分辨率，通过叠加相称成像方法，提升反射式显微成像方法的对比度，使得样品表面的划痕和凹/凸点的成像更清晰。
为实现上述效果，本发明采用的技术方案为：
一种三维显微成像的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
S10、由发光装置产生照明光源，照明光源通过照明光阑形成点光源或通过狭缝形成线光源，再经过第一透镜形成准直光束，再经一个起偏器使光束偏振方向调整为预设的方向，最后经分光镜反射进入照明主光路；
S20、进入主光路的光束，依次经过一个第二透镜和一个筒镜形成平行光束；
S30、平行光束经一个偏光棱镜分出两束偏振方向互相垂直的光束，且两个光束之间形成一定的侧向偏移，两束光通过显微物镜投射在待检测样品的表面；
S40、两束光在样品表面形成两束反射光，并逆向射入主光路返回，经显微物镜和偏光棱镜后重新合为一个具有干涉效果的光束；
S50、重新合成后的光束反向依次经过筒镜、第二透镜、分光镜后，再依次经过检偏器、第三透镜和视场光阑(小孔光阑或狭缝)后被探测器捕获并记录；
S60、移动样品载台，结合样品表面扫描点的二维移动或扫描线的一维移动，合成高水平解析度、高垂直解析度的高分辨率样品表面图像。
进一步的，步骤S30中，两个光束之间的侧向偏移不大于50微米。
进一步的，步骤S30中，一束光入射在样品的表面上，另一束光入射在样品的凹/凸面上。
进一步地，步骤S50所使用的探测器可针对点扫描或线扫描进行相应选择。点扫描探测器方案包括但不限于光电二极管、光电场效应管、光电倍增管等；线扫探测器方案包括但不限于线列电荷耦合器件(CCD)、时域延迟积分器(TDI)等。
还提供了一种应用所述三维显微成像方法的成像光路结构，包括设置于探测器与待检测样品之间的主光路结构、设置于主光路结构一侧的入射光路结构，所述主光路结构包括主光筒，所述主光筒内依次固定安装由同轴设置的视场光阑、第三透镜、检偏器、分光镜、第二透镜、筒镜、偏光棱镜和显微物镜；
所述入射光路结构包括位于主光筒一侧并与主光筒内部连通的入射光筒，所述入射光筒内由外而内依次固定安装有同轴设置的照明光阑、第一透镜和起偏器，所述起偏器位于分光镜的一侧。
进一步的，所述主光路结构轴线和入射光路结构轴线的交点位于分光镜的表面上，所述分光镜的反射面朝向起偏器和第二透镜所在侧。
进一步的，第二透镜的前焦面设置为与筒镜的后焦面重合。
与现有技术相比较，本发明的有益效果如下：
本发明该方法结合混合应用相衬技术和空间门控方法，层扫能力和三维方向都有较好分辨率，通过叠加成像方法，提升反射式显微成像方法的对比度，使得样品表面的划痕和凹/凸点的成像更清晰；图像对比度相较于单一的成像方法共聚焦效果更好，相对于差分干涉衬度成像方法，极大提升了三维成像的分辨率。
附图说明
图1为本发明相衬方法结合空间门控的三维显微成像方法光路结构示意图。
其中：1探测器、2视场光阑、3第三透镜、4检偏器、5分光镜、6第二透镜、7筒镜、8偏光棱镜、9显微物镜、10照明光阑、11第一透镜、12起偏器、13待检测样品。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
首先对应用三维显微成像方法的成像光路结构进行阐述。
请参阅图1，该成像包括设置于探测器1与待检测样品13之间的主光路结构、设置于主光路结构一侧的入射光路结构，主光路结构包括主光筒(图中未示出)，主光筒垂向设置，其轴线与待检测样品13的表面垂直。主光筒内依次固定安装由同轴设置的视场光阑2、第三透镜3、检偏器4、分光镜5、第二透镜6、筒镜7、偏光棱镜8和显微显微物镜9。入射光路结构包括位于主光筒一侧并与主光筒内部连通的入射光筒(图中未示出)，入射光筒水平设置，其轴线与主光筒的轴线相交，入射光筒内由外而内依次固定安装有同轴设置的照明光阑10、第一透镜11和起偏器12，且起偏器12位于分光镜5的一侧。
主光筒和入射光筒均为采用不透光的材质制成的筒体结构，其具体结构及其内部各部件的安装方式可参照现有的光镜检测装置，主光筒和入射光筒内各组成部件也均为现有的市售产品，根据参数需要进行选择匹配即可，此处不在详细赘述。
照明光阑10和视场光阑2均为视场光阑装置，以控制入射光束的大小范围。照明光源可根据波长、单色性、相干性等需求采用相干的激光光源或非相干的汞灯、氙灯、LED等光源。照明光阑10的光线出射口位于第一透镜11的焦点位置，则由照明光阑10射出的小扩散角的光束经第一透镜11后形成平行光束，平行光束经起偏器12将光束的偏振方向调整为预设的方向，以便后续偏振光束的形成。
主光路结构轴线和入射光路结构轴线的交点位于分光镜5的表面上，且分光镜5的反射面朝向起偏器12和第二透镜6所在侧，起偏器12的出射方向与第二透镜6的入射方向垂直，分光镜5的反光面与水平线/垂直线呈45°夹角设置，则由起偏器12射出的光束经分光镜5的反射后垂直地射入第二透镜6，并在第二透镜6的底部焦点(位于第二透镜6远离分光镜5的一侧)处汇聚。筒镜7(内置透镜)设置在第二透镜6的下方，且其后焦面与第二透镜6的前焦面重合，第二透镜6底部汇聚的光线在其焦点下方扩散，经筒镜7接收后再次形成平行光束。
紧接着，平行光束经一个位于筒镜7正下方的偏光棱镜8分出两束偏振方向互相垂直的光束，如图中所示的o光(图中深色填充区域)和e光(图中浅色填充区)，且两个光束之间形成一定的侧向偏移，侧向偏移不大于50微米，具体值需考虑本系统的水平分辨率以及显微物镜放大倍率选择设定。两束光通过显微物镜9投射在待检测样品13的表面，图示中，o光打在待检测样品13的表面(位于在o光焦平面，如图中所示的b处双点划线对应位置)，e光打在样品的凹凸面(如图中所示的c处虚线对应位置)。
待检测样品13的表面造成的反射光，逆向射入光路返回。经过显微物镜9后，两束光经过偏光棱镜8重新合为一束光，由于o光和e光打在样品不同的深度上，二者的光程不同且偏振方向垂直，最终产生干涉，体现在亮度上有增强或变暗的效果；回程光束再依次经过筒镜7、第二透镜6、分光镜5，而后再经检偏器4检测后，光束经第三透镜3聚焦。视场光阑2位于探测器1的接收端近场，并位于第三透镜3的焦点处，则由第三透镜3前端射入的平行光束可汇聚于视场光阑2的光束入射孔处，再经视场光阑2后，被探测器1接收并记录。
照明光束中打在焦点外的一部分光线反射或者(二次)散射回来的杂散光，如图中光路两侧黑色连续的虚线表示为o光光路的反射杂散光，由于其物点和相机的像点不再满足共轭关系，因而被视场光阑2在空间上(图中所示a处)过滤。而e光因为有偏折，打在o光焦平面外，最终也能够通过视场光阑2，最终改善了成像的衬度，从而提升了反射式显微成像方法的对比度，使得样品表面的划痕和凹/凸点的成像更清晰。
对应于所述三维显微成像光路结构的一种三维显微成像的方法，主要包括以下步骤：
S10、由发光装置产生照明光源，照明光源通过照明光阑10形成点光源或通过狭缝形成线光源，再经过第一透镜11形成准直光束，再经一个起偏器12使光束偏振方向调整为预设的方向，最后经分光镜反射进入照明主光路；
S20、进入主光路的光束，依次经过共焦设置的一个第二透镜6和一个筒镜7形成平行光束；
S30、平行光束经一个偏光棱镜8分出两束偏振方向互相垂直的光束，且两个光束之间形成一定的侧向偏移，两束光通过显微物镜9投射在待检测的样品表面；一束光入射在样品的表面上，另一束光入射在样品的凹/凸面上，两个光束之间的侧向偏移不大于50微米；
S40、两束光在样品表面形成两束反射光，并逆向射入主光路返回，经显微物镜9和偏光棱镜8后重新合为一个具有干涉效果的光束；
S50、重新合成后的光束反向依次经过筒镜7、第二透镜6、分光镜5后，再依次经过检偏器4、第三透镜3和视场光阑2(小孔光阑或狭缝)后被探测器1捕获并记录；所使用的探测器可针对点扫描或线扫描进行相应选择。点扫描探测器方案包括但不限于光电二极管、光电场效应管、光电倍增管等；线扫探测器方案包括但不限于线列电荷耦合器件(CCD)、时域延迟积分器(TDI)等。
S60、移动样品载台，结合样品表面扫描点的二维移动或扫描线的一维移动，合成高水平解析度、高垂直解析度的高分辨率样品表面图像。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种三维显微成像的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
S10、由发光装置产生照明光源，照明光源通过照明光阑形成点光源或通过狭缝形成线光源，再经过第一透镜形成准直光束，再经一个起偏器使光束偏振方向调整为预设的方向，最后经分光镜反射进入照明主光路；
S20、进入主光路的光束，依次经过一个第二透镜和一个筒镜形成平行光束；
S30、平行光束经一个偏光棱镜分出两束偏振方向互相垂直的光束，且两个光束之间形成一定的侧向偏移，两束光通过显微物镜投射在待检测样品的表面；
S40、两束光在样品表面形成两束反射光，并逆向射入主光路返回，经显微物镜和偏光棱镜后重新合为一个具有干涉效果的光束；
S50、重新合成后的光束反向依次经过筒镜、第二透镜、分光镜后，再依次经过检偏器、第三透镜和视场光阑后被探测器捕获并记录；
S60、移动样品载台，结合样品表面扫描点的二维移动或扫描线的一维移动，合成高水平解析度、高垂直解析度的高分辨率样品表面图像。
2.根据权利要求1所述的一种三维显微成像的方法及其成像光路结构，其特征在于：步骤S30中，两个光束之间的侧向偏移不大于50微米。
3.根据权利要求1所述的一种三维显微成像的方法及其成像光路结构，其特征在于：步骤S30中，一束光入射在样品的表面上，另一束光入射在样品的凹/凸面上。
4.根据权利要求1所述的一种三维显微成像的方法及其成像光路结构，其特征在于：步骤S50所使用的探测器可针对点扫描或线扫描进行相应选择；点扫描探测器方案包括但不限于光电二极管、光电场效应管、光电倍增管；线扫探测器方案包括但不限于线列电荷耦合器件、时域延迟积分器。
5.一种应用权利要求1-4任意一项所述三维显微成像方法的成像光路结构，其特征在于：包括设置于探测器（1）与待检测样品（13）之间的主光路结构、设置于主光路结构一侧的入射光路结构，所述主光路结构包括主光筒，所述主光筒内依次固定安装由同轴设置的视场光阑（2）、第三透镜（3）、检偏器（4）、分光镜（5）、第二透镜（6）、筒镜（7）、偏光棱镜（8）和显微物镜（9）；
所述入射光路结构包括位于主光筒一侧并与主光筒内部连通的入射光筒，所述入射光筒内由外而内依次固定安装有同轴设置的照明光阑（10）、第一透镜（11）和起偏器（12），所述起偏器（12）位于分光镜（5）的一侧。
6.根据权利要求5所述的一种三维显微成像光路结构，其特征在于：所述主光路结构轴线和入射光路结构轴线的交点位于分光镜（5）的表面上，所述分光镜（5）的反射面朝向起偏器（12）和第二透镜（6）所在侧。
7.根据权利要求5所述的一种三维显微成像光路结构，其特征在于：所述第二透镜（6）的前焦面设置为与筒镜（7）的后焦面重合。
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