CN103487421B - 时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法，包括以下步骤：1）激发光经显微物镜投射到的待测样品之上，对待测样品进行宽敞激发发出荧光；2）损耗光通过光束调制模块进行调制后，同样经显微物镜投射到待测样品上，形成暗斑阵列状照明光斑，对宽敞激发区域进行受激辐射损耗；3）待测样品在受激辐射损耗后发出的荧光由显微物镜收集，并聚焦投射到光电感应器件上，得到待测样品的荧光图像；4）平移待测样品，并重复步骤1）～3），对待测样品进行水平二维扫描，得到与各扫描位置相对应的荧光图像；5）对所有荧光图像进行平移、叠加处理，最终恢复出二维超分辨图像。本发明还公开了一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微装置。
Description
技术领域
本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法及装置。
背景技术
由于衍射极限的存在，常规光学显微镜的横向分辨率一直被限制在半波长左右，无法在可见光波段内对于亚百纳米尺寸的微观物体进行分辨。20世纪90年代以来，研究人员们陆续提出了多种超分辨显微成像方法来实现小于衍射极限的空间分辨率。其中，受激辐射损耗显微术（STED）是第一种能在远场实现超分辨显微的技术，同时也是目前应用最为广泛的。
STED显微镜是在常规共焦显微镜的基础上，通过引入一路损耗光，以受激辐射的方式将激发光斑外围部分的被激发电子送回基态，从而减少有效荧光的发光面积，提高成像分辨率。这种技术可以突破衍射极限的限制，实现小于10纳米的横向分辨率。但是，由于目前的STED显微术均是通过单点扫描的方式来进行成像的，其成像速度在一定程度上受到了限制。
发明内容
本发明提供了一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法及装置，可以有效地提高STED显微术的成像速度。
一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法，包括以下步骤：
1）平行入射的激发光，经显微物镜投射在位于纳米水平位移台的待测样品之上，对所述的待测样品进行宽敞激发发出荧光；
2）平行入射的损耗光，通过光束调制模块进行调制后，同样经所述的显微物镜投射到所述的待测样品上，形成暗斑阵列状照明光斑，对宽敞激发区域进行受激辐射损耗；
3）所述待测样品在受激辐射损耗后发出的荧光由显微物镜收集，并通过聚焦投射到光电感应器件上，得到待测样品的荧光图像；
4）移动所述的纳米水平位移台，并重复步骤1）～3），对待测样品进行水平二维扫描，得到与各扫描位置相对应的荧光图像；
5）对所得到的各幅荧光图像进行平移、叠加处理，最终恢复出待测样品的二维超分辨图像。
其中，所述光束调制器件的作用为对损耗光束进行调制，使其在待测样品上形成暗斑阵列状照明光斑；一般可采用两个渥拉斯顿棱镜使两对寻常光与非寻常光发生相干或是采用空间光调制器对损耗光束进行位相编码来实现。
其中，在步骤3）中，对光电感应器件的成像设置时间门控进行探测延时，即当待测样品被激发产生荧光时，并不立即对其成像，而是延后一定时间，才开始收集荧光。
其中，所述的光电感应器件优选使用ICCD。
本发明还提供了一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微装置，包括：
布置在激发光光路上的第一透镜，
沿损耗光光路依次布置的光束调制模块和第二透镜，
用于承载荧光样品的纳米水平位移台，
用于将所述激发光路和损耗光路的光线投射至荧光样品的投射装置，
以及检测所述荧光样品发光的探测成像系统。
其中，第一透镜用于将平行入射的激发光束进行聚焦。
其中，光束调制模块用于对平行入射的损耗光进行调制，使其在待测样品上形成暗斑阵列状照明光斑；一般可采用两个渥拉斯顿棱镜使两对寻常光与非寻常光发生相干或是采用空间光调制器对损耗光束进行位相编码来实现，优选使用空间光调制器。
其中，第二透镜，用于将调制后的损耗光束聚焦。
其中，投射装置包括第一二色镜、第二二色镜和显微物镜；第一二色镜用于使激发光束反射，同时使样品发出的荧光透射；第二二色镜用于使激发光束透射，使损耗光束反射，同时使样品发出的荧光透射；显微物镜用于将激发光和损耗光投射到待测样品之上，同时用于收集待测样品所发出的荧光。
其中，纳米水平位移台用于放置待测样品，并进行水平移动，实现对于样品的二维扫描。
其中，探测成像系统包括场镜和光电感应器件；场镜用于将荧光光束投射到光电感应器件上；光电感应器件用于收集荧光，得到相应的荧光图像。
其中，所述光电感应器件的成像应可以通过时间门控进行探测延时，即当待测样品被激发产生荧光时，并不立即对其成像，而是延后一定时间，才开始收集荧光。
本发明原理如下：
常规STED显微方法是基于单点扫描成像的。换句话说，在常规STED方法中，单次只能获得一个扫描点处的光强信息。因此，要实现对于样品的二维成像，必须通过扫描，重复多次单点成像的过程，从而限制了其的成像速度。
要提高STED显微术的成像速度，可以采用并行多点成像的方式，即单次获取多个扫描点处的光强信息，从而减少所需的扫描次数。
在本发明中，通过对损耗光束进行调制，可以使其在样品面上形成暗斑阵列状照明光斑。在此照明光斑中，多个损耗暗斑以一定的间隔成阵列状排布。根据STED的成像原理，在激发光成宽场照明的情况下，只有每个损耗暗斑中的空心区域所对应的样品才可以发出荧光。并且，由于此时所生成的暗斑阵列状照明光斑中，相邻两个损耗暗斑之间的间隔大于衍射极限，因此，相邻两个损耗暗斑中空心区域所对应的样品发出的荧光不会在光电感应器件上形成串扰，可以很好地被区分出来。
由于一般系统中所用激光光源的功率有限，在多点并行成像时，分到每个损耗暗斑单元上的光强将更为有限。因此，本发明中引入了时间门控STED技术，通过延时探测荧光，来提高损耗光强的利用率，实现在较低光强下的STED超分辨成像。
在本发明中，二维扫描是通过纳米水平位移台控制样品相对损耗暗斑阵列进行平移来是实现的。此时，暗斑阵列相对光电感应器件的位置是固定的，各暗斑中心位置所对应的光电感应器件上的像素单元也是固定的。根据STED显微术的成像原理，损耗暗斑的中心位置决定了荧光的发光位置，因此，每次成像时只需记录特定像素单元接收到的光强信息，并将其作为对应扫描点位置的像素值即可。在后续恢复图像时，将各幅图像按照各自扫描位置和顺序进行平移，再进行光强叠加便能得到待测样品的超分辨显微图像。
相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
1、成像速度快；
2、能量利用率高。
附图说明
图1为本发明时间门控宽场受激辐射超分辨显微装置的示意图。
图2为本发明中所生成的损耗暗斑阵列状光斑示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
如图1所示，一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微装置，包括：第一透镜1，光束调制模块2，第二透镜3，第一二色镜4，第二二色镜5，显微物镜6，纳米水平位移台7，场镜8和光电感应器件9。
其中，第一透镜1位于激发光光路上，用于将平行入射的激发光束进行聚焦。
光束调制模块2位于损耗光光路上，用于对平行入射的损耗光进行调制，使其在待测样品上形成暗斑阵列状照明光斑；一般可采用两个渥拉斯顿棱镜使两对寻常光与非寻常光发生相干或是采用空间光调制器对损耗光束进行位相编码来实现。
第二透镜3，位于损耗光光路上，用于将调制后的损耗光束聚焦。
第一二色镜4，用于使激发光束反射，同时使样品发出的荧光透射。
第二二色镜5，用于使激发光束透射，使损耗光束反射，同时使样品发出的荧光透射。
显微物镜6，用于将激发光和损耗光投射到待测样品之上，同时用于收集待测样品所发出的荧光。
纳米水平位移台7，用于放置待测样品，并进行水平移动，实现对于样品的二维扫描。
场镜8，用于将荧光光束投射到光电感应器件上。
光电感应器件9，用于收集荧光，得到相应的荧光图像。
其中，所述光电感应器件9选用ICCD，其成像应可以通过时间门控进行探测延时，即当待测样品被激发产生荧光时，并不立即对其成像，而是延后一定时间，才开始收集荧光。
其中，所述光束调制模块选用空间光调制器。
采用图1所示的装置实现时间门控宽场受激辐射超分辨显微过程如下：
平行入射的激发光通首先过第一透镜1聚焦，之后由第一二色镜4反射；由第一二色镜反射4的激发光，透过第二二色镜5，之后经过显微物镜6投射在位于纳米水平位移台7的待测样品之上，对其进行宽场激发；
平行入射的损耗光，通过空间光调制器进行调制后，由第二透镜3聚焦，之后由第二二色镜5反射；由第二二色镜5反射的损耗光，经过显微物镜6投射在位于纳米水平位移台7的待测样品之上，形成暗斑阵列状照明光斑，对待测样品进行受激辐射损耗；
由待测样品发出的荧光由显微物镜6收集，之后依次透过第二二色镜5和第一二色镜4，并经场镜8聚焦，投射在ICCD9之上，得到待测样品的荧光图像；
移动纳米水平位移台7，实现对于待测样品的水平二维扫描，并得到与各扫描位置相对应的荧光图像；
对所得到的各幅荧光图像进行平移，叠加处理，最终恢复出待测样品的二维超分辨图像。
在上述方法中，利用空间光调制器对损耗光束进行位相编码，使其在待测样品上形成如图2所示的暗斑阵列状照明光斑；
ICCD9的成像通过时间门控进行探测延时，即当待测样品被激发产生荧光时，并不立即对其成像，而是延后一定时间，才开始收集荧光。通过这种方法来降低所需的损耗光强。
Claims (7)
1.一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)激发光经显微物镜投射在位于纳米水平位移台的待测样品之上，对所述的待测样品进行宽场激发发出荧光；
2)损耗光通过光束调制模块进行调制后，同样经所述的显微物镜投射到所述的待测样品上，形成暗斑阵列状照明光斑，对宽场激发区域进行受激辐射损耗；
3)所述待测样品在受激辐射损耗后发出的荧光由显微物镜收集，并通过聚焦投射到光电感应器件上，得到待测样品的荧光图像；
在步骤3)中，在采集所述荧光图像时，对光电感应器件的成像设置时间门控进行探测延时；所述的光电感应器件为ICCD；
4)移动所述的纳米水平位移台，并重复步骤1)～3)，对待测样品进行水平二维扫描，得到与各扫描位置相对应的荧光图像；
5)对所得到的各幅荧光图像进行平移、叠加处理，最终恢复出待测样品的二维超分辨图像。
2.如权利要求1所述的时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法，其特征在于，所述的光束调制模块为依次布置的损耗光光路上的两个渥拉斯顿棱镜。
3.如权利要求1所述的时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法，其特征在于，所述的光束调制模块为用于对所述损耗光进行位相编码的空间光调制器。
4.一种时间门控宽场受激辐射超分辨显微装置，其特征在于，包括：
布置在激发光光路上的第一透镜，
沿损耗光光路依次布置的光束调制模块和第二透镜，
用于承载荧光样品的纳米水平位移台，
用于将所述激发光光路和损耗光光路的光线投射至待测样品的投射装置，
以及检测所述待测样品发光的探测成像系统；
所述的探测成像系统包括场镜和光电感应器件；场镜用于将荧光光束投射到光电感应器件上；所述光电感应器件为ICCD，用于收集荧光并得到相应的荧光图像；所述光电感应器件的成像通过时间门控进行探测延时，即当待测样品被激发产生荧光时，并不立即对其成像，而是延后一定时间，才开始收集荧光。
5.如权利要求4所述的时间门控宽场受激辐射超分辨显微装置，其特征在于，所述的光束调制模块为依次布置的损耗光光路上的两个渥拉斯顿棱镜。
6.如权利要求4所述的时间门控宽场受激辐射超分辨显微装置，其特征在于，所述的光束调制模块为用于对损耗光进行位相编码的空间光调制器。
7.如权利要求4所述的时间门控宽场受激辐射超分辨显微装置，其特征在于，所述的投射装置包括第一二色镜、第二二色镜和显微物镜；
第一二色镜用于使激发光反射，同时使待测样品发出的荧光透射；
第二二色镜用于使激发光透射，使损耗光束反射，同时使待测样品发出的荧光透射；
显微物镜用于将激发光和损耗光投射到待测样品之上，同时用于收集待测样品所发出的荧光。
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