CN111381355B - 光学成像装置和方法 - Google Patents
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Abstract
一种光学成像装置和方法。光学成像装置包括:光学显微镜,包含载物平台、光源模块以及物镜,载物平台能够在XY平面内移动,光源模块包含光源,物镜能够在Z轴方向上移动;三维电动样品台,固定于载物平台上,用于承载一待测样品并能够带动其相对于载物平台在三维方向上移动;以及微球体,固定于透明基片上,物镜、微球体、及待测样品是沿Z轴方向依次排列;其中,透明基片连同微球体能够被移动至第一位置并在Z轴方向上相对于载物平台保持不动;三维电动样品台能够将待测样品相对于微球体调节至与XY平面相平行的成像平面内并通过微球体形成第一像;物镜能够被调节至第二位置以使物镜对第一像进行二次成像,形成第二像。
Description
技术领域
本发明涉及一种光学成像装置和方法,特别是涉及一种无标记、宽场、远场、分辨率超过光学衍射极限的超分辨光学成像装置和方法。
背景技术
光学显微镜是人类历史上最重要的科学成就之一,对生命科学发展具有划时代意义,同时极大地推动了相关科学领域的发展,已成为现代科学研究不可缺少的重要工具。然而,传统的光学显微镜受光学衍射极限(约200nm)的限制,无法分辨样品(如细胞)内部的精细结构。因此,超过光学衍射极限(即超分辨)的光学成像已成为生命科学研究,以及高密度信息存储、超高密度集成芯片检测、高分辨光刻等相关光学领域迫切需要解决的重要问题。尽管各种电子显微镜和扫描探针显微镜,例如,近场扫描光学显微镜(Near FieldScanning Optical Microscopy,NSOM)、原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)都具有纳米分辨本领,但都对样品有一定限制,特别是不适用于液态环境下的生命活体样本观察。目前,光学显微镜仍然是生命科学最有力研究工具。
近年发展的荧光超分辨显微术使生物光学成像技术发生了革命性变化,并由此获得2014年诺贝尔奖,足见超分辨光学成像技术的重要意义。然而,上述荧光超分辨显微术仍存在一定局限和不足。譬如,所有的荧光超分辨显微术均需要事先对样品进行特殊的荧光标记并用特定波长的光源激发,且荧光标记对样品有干扰,有些样品甚至无法进行荧光标记成像。此外,上述所有荧光超分辨显微术的成像均是对荧光点重构得到的图像(mapping),并非直接真实物体的光学成像(imaging),且成像速度受到限制。因此,发展突破光学衍射极限的、无标记的、真实宽场的、超分辨光学成像技术显得尤为重要,已成为当今科学技术领域的迫切需要解决的问题。
最新研究表明,放置于样品表面的微米尺度的透明介质小球(或被称为“微球体”)具有“光子纳米喷流效应(photonic nanojet effect)”,即它能将携有样品表面精细结构信息的渐逝波(evanescence wave)投射到远处,被置于远处(即远场,样品与物镜间的距离远大于光波波长)的光学透镜所接收,从而实现突破光学衍射极限的远场超分辨光学成像,其原理如图1所示。现有研究实验证明,使用微球体的成像的分辨本领可达100nm以下。然而,现有研究中所采用的微球体一般是原位自组装形成或事先制备好的微球,微球是“随机”沉降在样品表面,无法精确定位在样品的任意感兴趣区(Region of Interest,ROI),并且每个微球(几微米-几十微米)的覆盖面积很小,可观察的视场(Field of View,FOV)非常有限,无法观察整个样品。此外,微球体距样品的纵向距离也无法控制,难以达到最佳成像效果。目前,超分辨成像技术只能作为原理演示,还不能实际应用。可见,要达到实际应用必须做到有效地操控微球体,使其能定位到样品的任意感兴趣区(ROI),并且样品与微球体能相对移动。
目前,现有的微球操纵方法主要包括(1)AFM针尖,(2)毛细管,(3)PDMS微球阵列薄膜,(4)微流池,(5)磁引导等多种方法。具体来讲,(1)、(2)两种操纵方法是微悬臂梁针尖或毛细管与微球直接刚性链接,微球与样品接触,在移动过程中极易造成样品或微球体的损伤和针尖折断。此外,由于高倍显微物镜工作距离很小,在样品与显微物镜之间加入微操控器并三维扫描移动,实际操作是非常困难的,且系统的稳定性和重复性难以保证,即存在“微球操纵与显微成像”难以兼顾的困难。第(3)种操纵方法是将微球阵列制备成PDMS薄膜,将其类似于盖玻片使用,用多个微球同时成像,等效地扩大了成像的感兴趣区(ROI),但该方法不可避免的存在图像“马赛克效应”,且薄膜厚度已事先确定,无法根据不同的样品实际情况进行实时调节(对焦)。第4种操纵方法是借助微流环境通过光诱导双向电泳操纵微球在微流器件中移动,虽然实现了较大面积的超分辨成像,该方法必须依赖微流环境,操纵复杂,应用范围受到很大限制。第5种操纵方法是将包被磁性材料的微球体通过局部催化化学反应能和磁引导驱动微球在样品表面移动(swimming microrobot optical nanoscopy,SMON),从而进行较大面积超分辨扫描成像,该方法虽然成功地得到了较大面积超分辨图像,但微球体制备和操纵复杂,样品中还必须包括化学燃料,实际应用受到很大限制。可见,当前尚缺乏一种简单、通用有效地操控微球体的方法。
发明内容
本发明的一目的是为了提供一种光学成像装置及方法,可解决现有技术中的一或多个缺陷,例如微球体无法操控的问题,给出了一种普遍适用、简单、方便的微球体操控方法。
本发明的另一目的是提供一种光学成像装置及方法,可解决现有技术中无法对样品任意感兴趣区进行成像以及单个微球体视场太小的问题,给出了在普通光学显微上直接实现大视野、宽视场、无标记、分辨率超过光学衍射极限(超分辨)的简单、快速方便的光学成像方法及其装置制造方案。
为了实现上述目的,本发明提供一种光学成像装置,其特点在于,包括:
光学显微镜,其包含有载物平台、光源模块以及物镜,其中该载物平台能够在XY平面内移动,该光源模块包含为光学成像提供照明光的光源,该物镜能够在垂直于该XY平面的Z轴方向上移动;
三维电动样品台,固定于该载物平台上,用于承载一待测样品并能够带动该待测样品相对于该载物平台在三维方向上移动;以及
微球体,固定于透明基片上,其中该物镜、该微球体、以及该待测样品是沿该Z轴方向依次排列;
其中,该透明基片连同其上的该微球体能够被移动至第一位置并在该Z轴方向上相对于该载物平台保持不动;该三维电动样品台能够将该待测样品相对于该微球体调节至与该XY平面相平行的成像平面内并通过该微球体形成第一像;该物镜能够被调节至第二位置以使该物镜对该第一像进行二次成像,形成第二像。
在本发明的一或多个实施例中,该物镜、该微球体、以及该待测样品是沿该Z轴方向自上而下依次排列;该光学成像装置还包括:
电子控制单元,与该三维电动样品台相连接,用于控制该三维电动样品台三维移动,使该待测样品接近该微球体并在该成像平面内按照预定轨迹依次横向平移,使该微球体对该待测样品的多个待测区域依次进行扫描和成像;以及
图像记录单元,安装在该光学显微镜上,用于采集对应于所述多个待测区域的多个区域图像。
在本发明的一或多个实施例中,该光学成像装置还包括计算机,与该电子控制单元及该图像记录单元相连接,用于提供操作界面、控制该电子控制单元使该三维电动样品台与该图像记录单元同步、图像储存、以及图像显示,并用于将所述多个区域图像进行无缝拼接以形成该待测样品的整体图像。
在本发明的一或多个实施例中,该三维电动样品台包括固定基座及移动基座,该固定基座是固定于该载物平台上,该固定基座形成有一安装槽且该安装槽的底部具有第一通孔;该移动基座是安装于该安装槽内并能够在三维方向上移动,该移动基座形成有与该第一通孔相对应的第二通孔。
在本发明的一或多个实施例中,该三维电动样品台还包括适配器,该适配器形成有与该第二通孔相对应的第三通孔,该待测样品是加载于该适配器的顶面。
在本发明的一或多个实施例中,该透明基片是直接搭载于该固定基座的顶面上,且该微球体为一个且是固定于该透明基片的下表面并朝下安装;
及/或,该光源包括透射的白光光源及/或反射的荧光激发光源,其中该荧光激发光源所发出的入射光是经由半透半反镜分光后入射至该待测样品;
及/或,所形成的该第二像是反射成像或透射成像;
及/或,该微球体为高折射率透明介质球体,其折射率≥1.5,其直径为10~100微米;
及/或,该物镜的孔径≥0.6,其放大倍率为40~100倍;
及/或,该待测样品为无标记的样品;
及/或,该待测样品在该成像平面内时与该微球体之间的距离≤100nm。
为了实现上述目的,本发明还提供了一种光学成像方法,其特点在于,包括:
配置如上所述的光学成像装置;
移动透明基片连同其上的微球体至第一位置,并使之在Z轴方向上相对于该光学成像装置的载物平台保持不动;
通过三维电动样品台将待测样品相对于该微球体调节至与XY平面相平行的成像平面内并通过该微球体形成第一像;以及
调节该物镜至第二位置,以使该物镜对该第一像进行二次成像,形成第二像。
在本发明的一或多个实施例中,所述的光学成像方法还包括:
通过电子控制单元控制该三维电动样品台三维移动,使该待测样品接近该微球体并在该成像平面内按照预定轨迹依次横向平移,使该微球体对该待测样品的多个待测区域依次进行扫描和成像;以及
通过图像记录单元采集对应于所述多个待测区域的多个区域图像。
在本发明的一或多个实施例中,所述的光学成像方法还包括:
通过计算机将所述多个区域图像进行无缝拼接以形成该待测样品的整体图像。
在本发明的一或多个实施例中,在进行无缝拼接时是以该微球体的视场中心的二分之一的矩形区域作为成像的视场。
本发明的光学成像装置可以利用普通的荧光光学显微镜进行改造而成,并通过使微球体在成像时保持不动以及利用三维电动样品台来带动待测样品相对该微球体移动的方法,提供了一种可实际应用的、简单的、方便的微球操控方法,且本发明的设备简单、成本低、操纵方便、成像速度快。
利用本发明,不仅分辨率超过光学衍射极限,也无需对样品进行任何标记,不会对样品造成干扰,可原位无损地观察样品,特别适合液态生理环境下对生物活体标本的精细结构观察。并且,本发明可工作在透射或反射模式,可适用于任意(透明或不透明)样品成像。
利用本发明,还可实现微球体在样品表面任意位置精确定位,通过三维电动样品台带动待测样品相对于该微球体移动,还可对样品的任意感兴趣区(ROI)进行大范围扫描成像,且所得图像可为人们习惯接受的直接的宽场光学成像(image),而非点重构图像(mapping)。
以下将以实施方式对上述的说明作详细的描述,并对本发明的技术方案提供更进一步的解释。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂,所附附图的说明如下:
图1是利用微球体成像的原理示意图;
图2为本发明一较佳实施例的光学成像装置的仪器结构框图;
图3为本发明一较佳实施例的光学成像装置的系统结构图;
图4A为本发明的三维电动样品台的结构示意图,其中待测样品是通过适配器放置于该三维电动样品台的移动基座上;
图4B示出了图4A中的该三维电动样品台带动该待测样品移动至成像平面内以实现光学成像的状态示意图;
图5为本发明的光学成像方法的示意图;
图6A为一待测样品(光刻微米英文字母)的示意图;
图6B为使用本发明的光学成像装置实现样品相对于微球体的移动的成像效果示意图,其中是将图6A中的样品由右向左移动(A→F);
图7A为浸没在水中的钛酸钡微球(d=23μm)对蓝光碟(条纹周期300nm,条纹间隔130nm)使用电镜成像方法所得到条纹;
图7B为浸没在水中的钛酸钡微球(d=23μm)对蓝光碟(条纹周期300nm,条纹间隔130nm)使用本发明的微球体成像方法所得到条纹。
具体实施方式
为了使本发明的叙述更佳详尽与完备,可参照所附的附图及以下所述各种实施例,附图中相同的号码代表相同或相似的组件。另一方面,众所周知的组件与步骤并未描述于实施例中,以避免对本发明造成不必要的限制。此外,为简化附图起见,一些已知惯用的结构与元件在附图中将以简单示意的方式绘示。
如图2所示,本发明一较佳的实施例的光学成像装置包括光学显微镜10、三维电动样品台20、微球体30、待测样品40、图像记录单元50、电子控制单元60以及计算机70等。
结合图3所示,本发明的光学成像装置可通过对一荧光光学显微镜进行改造而成。该光学显微镜10可为普通正置荧光光学显微镜,其例如可包含有机体11、载物平台12、光源模块13(131、132)、物镜14、目镜15、聚光镜16等。其中,该载物平台12能够在XY平面内移动,例如可通过调节杆121进行调节。该物镜14是位于该载物平台12的上方,并能够在垂直于该XY平面的Z轴方向上移动实现待测样品的对焦成像,例如可通过一手动对焦旋钮141来进行手动对焦,或者也可以通过一Z-马达来控制物镜的移动和自动对焦。该物镜14可采用普通高倍长工作距离物镜。该物镜14的孔径可为0.7~1.4,放大倍率可为40~100倍,譬如可采用40×/0.8的物镜,优选可采用60×/0.95的物镜。该目镜15可用以观察所成的像。该光源模块包含为光学成像提供照明光的光源,该光源可包括白光光源131及/或荧光激发光源132。该白光光源131例如可为卤素灯或LED灯,其可设置在该机体11的一侧,且其发出的光可通过聚光镜16会聚射出,射出的光线可穿透透明的待测样品,即透射至该物镜14,从而实现透射成像。该荧光激发光源132例如可为荧光激发汞灯,其可设置在该机体11的一侧,且其所激发出的光线可经由一半透半反镜17分光后入射至不透明的待测样品,经该待测样品反射后成像,从而实现反射成像。当然,在本发明的其它实施例中,还可以在光路上放置适当的滤光片和衰减片,用以更好地实现透射成像或发射成像,这些并不作为对本发明的限制。
结合参考图4A,在本发明中,该三维电动样品台20是固定于该载物平台12上,用于承载一待测样品30,并能够带动该待测样品30相对于该载物平12在三维方向上移动,例如可沿X轴、Y轴、Z轴三个方向移动,用于待测样品的位置移动的精细控制,其例如可采用纳米精度的三维压电陶瓷平移样品台(PZT)或高精度的步进马达样品台。该三维电动样品台20还可以随该载物平台12一起通过调节杆121手动水平方向调节,实现样品的大范围移动。
较佳的,该三维电动样品台20包括固定基座21及移动基座22,该固定基座21是固定于该载物平台12上,该固定基座21形成有一安装槽211,且该安装槽211的底部具有第一通孔210;该移动基座22是安装于该安装槽211内并能够在三维方向上移动,该移动基座22形成有与该第一通孔210相对应的第二通孔220。更佳的,该三维电动样品台20还可包括有适配器23,该适配器23形成有与该第二通孔220相对应的第三通孔230,即形成中空圆环。在本实施例中,该三维电动样品台20是采用商品化的纳米精度三维压电陶瓷(Piezoe-lectric Transducer)平移样品台(或简称为PZT台),其运动速度和轨迹可由计算机70软件控制,且一般设定其是按zig-zag方式进行扫描。
在本实施例中,该微球体40可为一个,并固定于一透明基片41上,例如可通过粘胶固定。该微球体40可为BaTiCO3透明介质球体,其折射率例如可为1.9~2.1,其直径例如可为10~30微米。并且,该物镜14、该微球体40、以及该待测样品30是沿该Z轴方向自上而下依次排列。当然,可以理解的是,在其它实施例中,当该光学显微镜10使用倒置显微物镜时,该物镜、该微球体、以及该待测样品是做相反次序排列,即沿该Z轴方向自下而上依次排列。并且,在其它实施例中,该微球体40的数量并不局限于一个,且固定的方式也不局限于粘接,其材质也并不局限于BaTiCO3,这些并不作为对本发明的限制。在本实施例中,该微球体40采用折射率为1.9的BaTiCO3透明介质小球,其直径d=23μm。
该电子控制单元60是与该三维电动样品台20相连接,用于控制该三维电动样品台20在一成像平面内按照预定轨迹依次横向平移该待测样品30,使该微球体40可对该待测样品30的多个待测区域依次进行扫描和成像。在本实施例中,该电子控制单元60为该三维电动样品台20提供高精度PZT驱动电源,并负责与该计算机70通讯。在本实施例中,该电子控制单元60可为PZT台、物镜自动对焦操控模块(例如Z-马达)提供高稳定驱动电源,同时可通过运动控制卡与该计算机70通讯,从而实现各光学部件的全自动操控。其中,运动控制卡是商品化产品,譬如NI 7344,具有多路模拟输入/输出(I/O)、数字输入/输出(I/O)、及时钟。
该图像记录单元50是安装在该光学显微镜上,用于采集图像,包括但不限于对应于所述多个待测区域的多个区域图像的同时采集。在本实施中,该图像记录单元50可采用高分辨率数字CCD相机,其曝光时间和成像视场(FOV)可通过计算机70的软件控制,可实现图像的实时采集。并且,图像采集与样品移动可交替进行,用以实现对样品进行分区图像采集。
该计算机70是与该电子控制单元60及该图像记录单元50相连接,用于提供操作界面(例如参数设置等)、控制该电子控制单元60使三维电动样品台与该图像记录单元50同步、图像储存、以及图像显示等,以及用于将所述多个区域图像进行无缝拼接以形成该待测样品30的整体图像。在本实施例中,该计算机70内置有一应用软件,用以实现对各种硬件设备(包括但不限于PZT台和CCD相机)的操控,及对CCD相机所采集的图像进行储存、图像拼接和显示等。具体而言,该应用软件可采用LabVIEW开发,并具有以下基本功能:(1)提供PZT台操控及CCD相机的图像采集的参数设置窗口和图像实时显示窗口;(2)控制PZT台与CCD相机同步,及由CCD相机的图像识别反馈,控制PZT台进行自动调焦功能;(3)图像储存功能、图像拼接功能、和图像显示功能。
如图4A所示,在本发明中,该待测样品30可通过载玻片31加载于该适配器23的顶面。该透明基片41可直接搭载于该三维电动样品台20的固定基座21的顶面上,且该微球体40可为一个且是粘接于该透明基片41的下表面并朝下安装。其中,该透明基片41连同其上的该微球体40能够被移动至第一位置,例如图4A所示的位于物镜14的正下方的位置,并在该Z轴方向上相对于该载物平台12(如图3所示)保持不动。而该三维电动样品台20能够将该待测样品30相对于该微球体40调节至与XY平面(即X轴和Y轴所组成的平面)相平行的成像平面内并通过该微球体形成第一像,例如该待测样品30可被从如图4A所示的位置向上移动一距离h至如图4B所示的位置成像。较佳的,该待测样品30在该成像平面内时与该微球体之间的距离≤100nm。而该物镜14能够被调节至第二位置以使该物镜14对该第一像进行二次成像,即形成第二像。图4A和图4B虽然仅示出了该待测样品30在Z轴方向上的移动,但可以理解的是,通过该三维电动样品台20可以在三维方向上移动该待测样品30,在此不再赘述。
相对应地,本发明提供了一种光学成像方法,如图5所示,其例如可包括:
501,配置光学成像装置;
502,移动透明基片连同其上的微球体至第一位置,并使之在Z轴方向上相对于该光学成像装置的载物平台保持不动;
503,通过三维电动样品台将待测样品相对于该微球体调节至与XY平面相平行的成像平面内并通过该微球体形成第一像;以及
504,调节该物镜至第二位置,以使该物镜对该第一像进行二次成像,形成第二像。
在本发明的一或多个实施例中,所述的光学成像方法还可包括:
505,通过电子控制单元控制该三维电动样品台三维移动,使该待测样品接近该微球体并在该成像平面内按照预定轨迹依次横向平移,使该微球体对该待测样品的多个待测区域依次进行扫描和成像;以及
506,通过图像记录单元采集对应于所述多个待测区域的多个区域图像。
在本发明的一或多个实施例中,所述的光学成像方法还可进一步包括:
507,通过计算机将所述多个区域图像进行无缝拼接以形成该待测样品的整体图像。
下面将结合图3~图4B,详细说明本发明的光学成像装置的操作步骤,其主要包括:
步骤1:将高折射率(n=1.9~2.1)透明介质微球(直径为10~30μm)粘接到厚度为约0.15mm透明基片中央。
步骤2:待测样品(如细胞、蓝光碟片)置于标准载玻片上,该载玻片事先固定在适配器上,适配器放置在中空的三维电动样品台的中央,即放置在移动基座上。其中,加载待测样品后的适配器的高度略低于三维电动样品台的固定基座的上表面。三维电动样品台是固定在光学显微镜的载物平台上。
步骤3:操纵载物平台的手动把柄,将待测样品调节到光学显微镜的物镜下方显微镜视场中央。
步骤4:将粘有微球体的透明基片倒扣在三维电动样品台的固定基座的上表面,调节透明基片使微球体处于物镜的正下方,并在Z轴上相对于载物平台固定不动(同时也是相对于三维电动样品台的固定基座保持不动)。
步骤5:手动操纵载物平台的调节杆及手动对焦旋钮,使微球体处于视场中央,直至在目镜(或CCD相机的屏幕)中可看清微球体。
步骤6:操纵三维电动样品台在XY平面移动,将待测样品的感兴趣区(ROI)移至视场中央的微球体的正下方。
步骤7:调节三维电动样品台的Z-轴,使待测样品与微球体逐渐接近,直至微球体与样品相距≤100nm(但不接触)。此时待测样品S通过微球体成一虚像S’,该虚像S’是位于待测样品的下方。
步骤8:精细调节物镜的手动对焦旋钮,使物镜对虚像S’(作为物镜的虚物)进行二次成像,直至在目镜(或CCD相机的屏幕)上观察到待测样品的清晰的实像S”。
步骤9:用安装在光学显微镜上的高分辨率的CCD相机拍摄并记录物镜所成的实像S”。其中CCD相机在图像采集前设定微球体的视场中心的适当大小(小于微球体的直径)的矩形区域为图像采集的视场(FOV)。
步骤10:通过应用软件操纵三维电动样品台按Zig-Zag路径,精确步进平移样品,使微球体对待测样品的表面的多个感兴趣区进行逐片横向二维微区扫描、成像。
步骤11:在对各微区扫描、成像过程中,必要时可通过光学反馈系统进行自动对焦,使每一微区均清晰成像。
步骤12:扫描过程中各微区所成的区域图像由CCD相机同步实时记录,并保存在计算机中。
步骤13:将各个微区的区域图像用计算机软件进行无缝拼接,最后构成一幅大视野的超分辨图像。为了消除“微球体”成像产生的枕形畸变,每幅小图像(例如区域图像)在拼接时只取微球体的视场中央约1/2的范围作为成像的视场(FOV),同时采集图像时三维电动样品台的移动步长相应减少一半。
本发明的光学成像装置提供了一种简单、方便的微球操控方法,解决了微球体在样品表面任意位置的精确定位,并通过使样品相对微球体移动,从而可对样品的任意感兴趣区(ROI)进行大范围的扫描成像,解决了现有技术中微球体无法在样品表面任意感兴趣区精确定位的关键技术难题。
本发明进一步提出了一种新型“近场与远场相结合”的三透镜(微球体+物镜+目镜)的光学显微成像方案,进而构造出实用的无标记、宽场、快速超分辨光学显微镜。具体而言,可由微球体、物镜和图像记录单元(一般为CCD相机)三个光学元件共同构成超分辨光学成像系统,且物镜、微球体及待测样品是由上至下依次排列,构成“三明治”结构。其中,微球体固定在透明基片下表面相对光学显微镜的机身(例如载物平台)固定不动,而待测样品可固定在三维电动样品台上,该三维电动样品台又固定在载物平台上。通过三维电动样品台的移动可实现样品相对于微球体的三维移动。而物镜在微球体的上方,可沿纵向(Z-轴)自由移动对焦。本发明的光学成像装置可适用于任意(透明或不透明)样品成像,也即,既能对透明物体(如细胞)进行透射成像,同时又能对不透明物体进行反射成像。本发明的光学成像装置无需对待测样品进行标记,即可实现光学成像。
本发明所构造的无标记超分辨光学成像装置的空间分辨率可达到λ/7,横向放大率可达5.4倍,突破了传统的光学衍射极限,实现了“无标记”的光学超分辨显微成像。本发明者用微球体(n=1.9)在待测样品(光刻微米英文字母)上的成功地实现了样品与微球体的相对移动,其中待测样品S如图6A所示,其上有光刻的“Dan Fog”字样,将图6A中的待测样品S由右向左移动(例如图6B中由A→F),其成像效果如图6B所示,其中待测样品S在移动过程中在微球体下可观察到放大的“D”(如图6B中A位置的成像效果中的“W1”所示)、“F”(如图6B中C位置的成像效果中的“W2”所示)、“O”(如图6B中D位置的成像效果中的“W3”所示)等清晰字样。本发明者还通过浸没在水中的钛酸钡微球(d=23μm)对蓝光碟(条纹周期300nm,条纹间接130nm)反射成像,证实了本发明的光学成像装置的微球体确实可实现超分辨成像,例如,图7A即示出了使用电镜成像方法所得到的条纹S1,图7B即示出了使用本发明的微球体成像方法所得到条纹S2,对比图7A和图7B可见,本发明确实可实现超分辨成像。
本发明的“超分辨光学成像”与现有技术的“近场扫描显微镜(NSOM)”在成像方式和性质上存在本质不同,前者属于“宽场”直接光学成像(imaging),后者是“点扫描”重构图像(mapping)。本发明的“无标记超分辨光学成像”与现有技术的“荧光超分辨成像”也有实质区别,前者不需要任何标记,属于白光照明透射(或反射)宽场光学成像(imaging),而后者必须事先对样品进行荧光标记,并使用特定波长激发光照明,最后还需通过“点重构”获得图像(mapping)。
本发明的“无标记超分辨光学成像”是对“荧光标记超分辨显微成像术”的发展和补充,它将对生命科学和微纳米材料等领域发挥重要的经济和社会效益。
按照本发明构造的“无标记远场超分辨光学显微镜”将在生命科学、医院检验、纳米科技、微纳电子学等领域的样品检测等方面发挥独特而重要的作用,其具有以下优点:(1)超分辨:分辨率超过光学衍射极限。(2)非标记:样品不需要做任何标记、不会对样品造成干扰,可原位无损地观察样品,特别适合液态生理环境下对生物活体标本的精细结构观察。(3)宽场成像:所得图像为人们习惯接受的直接光学宽场成像(image),而非点重构图像(mapping)。(4)快速成像:操纵方便,成像速度快。(5)设备简单,成本低。
虽然本发明已以数个较佳实施例说明如上,然其并非用以限定本发明,任何所属技术领域中具有通常知识者,在不脱离本发明的精神和范围内,当可作任意的更动与润饰,因此本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (10)
1.一种光学成像装置,其特征在于,包括:
光学显微镜,其包含有载物平台、光源模块以及物镜,其中该载物平台能够在XY平面内移动,该光源模块包含为光学成像提供照明光的光源,该光源包括透射的白光光源及/或反射的荧光激发光源,该物镜能够在垂直于该XY平面的Z轴方向上移动;
三维电动样品台,固定于该载物平台上,用于承载一待测样品并能够带动该待测样品相对于该载物平台在三维方向上移动;
一个微球体,固定于透明基片上,该透明基片搭载于所述三维电动样品台上,其中该物镜、该一个微球体、以及该待测样品是沿该Z轴方向依次排列;以及
图像记录单元,用于采集所述待测样品的图像;
其中,所述光学成像装置能够进行如下操作:
该透明基片连同其上的所述一个微球体被移动至第一位置并在该Z轴方向上相对于该载物平台保持不动;
通过在所述XY平面内移动所述载物平台并且对所述物镜进行对焦,来使所述一个微球体处于所述光学显微镜的视场中央,直至在所述光学显微镜的目镜或者所述图像记录单元的屏幕中看清所述一个微球体;
通过操作所述三维电动样品台来将所述待测样品的感兴趣区域移动到所述一个微球体的正上方或正下方;
通过所述三维电动样品台将该待测样品相对于所述一个微球体调节至与该XY平面相平行的成像平面内并通过所述一个微球体形成第一像;
将所述物镜调节至第二位置以使该物镜对该第一像进行二次成像,形成第二像;以及
所述图像记录单元采集所述第二像并将其作为所述待测样品的感兴趣区域的图像进行记录。
2.根据权利要求1所述的光学成像装置,其特征在于,该物镜、所述一个微球体、以及该待测样品是沿该Z轴方向自上而下依次排列;该光学成像装置还包括:
电子控制单元,与该三维电动样品台相连接,用于控制该三维电动样品台三维移动,使该待测样品接近所述一个微球体,并在该成像平面内按照预定轨迹依次横向平移,使所述一个微球体对该待测样品的多个待测区域依次进行扫描和成像;以及
所述图像记录单元安装在该光学显微镜上,用于采集对应于所述多个待测区域的多个区域图像。
3.根据权利要求2所述的光学成像装置,其特征在于,还包括:
计算机,与该电子控制单元及该图像记录单元相连接,用于提供操作界面、控制该电子控制单元使该三维电动样品台与该图像记录单元同步、图像储存、以及图像显示,并用于将所述多个区域图像进行无缝拼接以形成该待测样品的整体图像。
4.根据权利要求1或2或3所述的光学成像装置,其特征在于,该三维电动样品台包括固定基座及移动基座,该固定基座是固定于该载物平台上,该固定基座形成有一安装槽且该安装槽的底部具有第一通孔;该移动基座是安装于该安装槽内并能够在三维方向上移动,该移动基座形成有与该第一通孔相对应的第二通孔。
5.根据权利要求4所述的光学成像装置,其特征在于,该三维电动样品台还包括适配器,该适配器形成有与该第二通孔相对应的第三通孔,该待测样品是加载于该适配器的顶面。
6.根据权利要求5所述的光学成像装置,其特征在于,该透明基片是直接搭载于该固定基座的顶面上,且所述一个微球体是固定于该透明基片的下表面并朝下安装;
及/或,该荧光激发光源所发出的入射光是经由半透半反镜分光后入射至该待测样品;
及/或,所形成的该第二像是反射成像或透射成像;
及/或,所述一个微球体为高折射率透明介质球体,其折射率≥1.5,其直径为10~100微米;
及/或,该物镜的孔径≥0.6,其放大倍率为40~100倍;
及/或,该待测样品为无标记的样品;
及/或,该待测样品在该成像平面内时与所述一个微球体之间的距离≤100nm。
7.一种光学成像方法,其特征在于,包括:
配置如权利要求1~6任一权利要求所述的光学成像装置;
移动透明基片连同其上的所述一个微球体至第一位置,并使之在Z轴方向上相对于该光学成像装置的载物平台保持不动;
通过在所述XY平面内移动所述载物平台并且对所述物镜进行对焦,来使所述一个微球体处于所述光学显微镜的视场中央,直至在所述光学显微镜的目镜或者所述图像记录单元的屏幕中看清所述一个微球体;
通过操作所述三维电动样品台来将所述待测样品的感兴趣区域移动到所述一个微球体的正上方或正下方;
通过三维电动样品台将待测样品相对于所述一个微球体调节至与XY平面相平行的成像平面内并通过所述一个微球体形成第一像;
调节该物镜至第二位置,以使该物镜对该第一像进行二次成像,形成第二像;以及
通过所述图像记录单元采集所述第二像并将其作为所述待测样品的感兴趣区域的图像进行记录。
8.根据权利要求7所述的光学成像方法,其特征在于,还包括:
通过电子控制单元控制该三维电动样品台三维移动,使该待测样品接近所述一个微球体并在该成像平面内按照预定轨迹依次横向平移,使所述一个微球体对该待测样品的多个待测区域依次进行扫描和成像;以及
通过图像记录单元采集对应于所述多个待测区域的多个区域图像。
9.根据权利要求8所述的光学成像方法,其特征在于,还包括:
通过计算机将所述多个区域图像进行无缝拼接以形成该待测样品的整体图像。
10.根据权利要求9所述的光学成像方法,其特征在于,在进行无缝拼接时是以所述一个微球体的视场中心的二分之一的矩形区域作为成像的视场。
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