CN106707484B - 基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，在现有暗场光学显微镜的基础上，利用微粒的散射光作为显微镜的照明光源，被散射光照明的区域可以获得超越衍射极限的空间分辨率，实现了空间超分辨成像。相比于普通的明场或暗场显微镜，本发明具有更高的空间分辨率。相比于近场扫描光学显微镜，通过微米颗粒在样品表面的扫描，可以获得整个样品表面的超分辨图像，本发明具有更快的成像速度，不需要在样品表面逐点扫描，每次成像范围可以达到10μm2。
Description
技术领域
本发明涉及一种光学显微成像技术，特别涉及一种基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法。
背景技术
远场光学受限于光学衍射极限，其成像系统的空间分辨率取决于入射波长和显微物镜的数值孔径，通常不会小于入射光波长的一半。为突破衍射极限，最常用的技术为近场扫描光学显微镜。该技术利用有孔或者无孔探针，位于样品表面上方数百纳米的范围内，收集样品表面倏逝波的强度，由此获取样品的轮廓信息。其分辨率理论上由探针尺寸决定，目前可以达到20至50纳米的空间分辨率。然而该技术最大的缺陷就是成像速度慢，通常需要几秒甚至几十秒来完成一幅图，因此无法应用于实时的成像测量。
在成像过程中，如果使用的显微物镜具有相同的数值孔径，明场和暗场显微镜的分辨率相同。由于采用了边缘光束照明技术，相比于明场显微镜，暗场显微镜抑制了背景光线的影响，具有更好的信噪比和图像对比度，更加适合物体边界和轮廓的观测。
发明内容
本发明是针对现在近场扫描光学显微镜成像速度受限的问题，提出了一种基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，相比于逐点扫描的近场扫描光学显微镜，本方案具有更快的成像速度，同样可以获得超越衍射极限的空间分辨率。
本发明的技术方案为：一种基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，包括如下步骤：
1）在现有的暗场光学显微镜的基础上增加三维移动设备，三维移动设备控制微米级的微粒移动；
2）将待测样品置于显微物镜的焦平面上；
3）将微粒移动接近待测样品表面，距离待测样品不超过1微米；
4）入射光从侧面入射，暗场光学显微镜对微粒周围被散射光照亮的区域进行成像，并完成图像采集；
5）利用三维移动设备控制微粒在样品表面逐步按次序移动，并控制微粒距离待测样品表面的间隔不超过1微米，每移动一步，用暗场光学显微镜采集一次图像，直至完成待测样品表面的图像采集；
6）将所有采集图像按次序拼接，实现待测样品表面超分辨图像。
所述微粒大小为1至50微米，用来散射显微镜的入射光。
所述三维移动设备包括三维位移平台和微粒支架，微粒支架一端为尖端结构，尖端结构端吸附或者粘贴微粒，另一端连接至三维位移平台，三维位移平台通过微粒支架控制微粒在三维空间内自由移动。
本发明的有益效果在于：本发明基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，利用微粒的散射光作为显微镜的照明光源，实现了空间超分辨成像。相比于普通的明场或暗场显微镜，本发明具有更高的空间分辨率。相比于近场扫描光学显微镜，本发明具有更快的成像速度，不需要在样品表面逐点扫描，每次成像范围可以达到10 μm2。
附图说明
图1为本发明基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像示意图；
图2为本发明成像样品的扫描电子显微镜图；
图3为本发明三种显微镜模式下对同一样品的成像效果比较图。
具体实施方式
一种基于散射光近场照明的超分辨显微镜，利用大小为微米级的微粒来散射入射光，再用散射光作为显微镜的照明光源。由于微粒距离样品表面很近，散射光中高频分量经过样品表面的调制后，将有倏逝波转化成传播波，再有显微物镜收集，成像与像平面上。由于更高空间频率的倏逝波参与成像过程，本发明能够突破衍射极限，获得更高的空间分辨率。
如图1为基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像示意图，该图为实现微粒散射光照明的超分辨显微镜的一种例证，首先将样品2置于显微物镜1的焦平面上，利用三维位移平台6来控制微粒支架的移动，微粒支架5端口的微粒4也随之移动，使得微粒非常接近样品表面，通常两者距离不超过一微米。由于微粒4对入射光的散射， 使得微粒4附近的区域3被散射光照亮，其他区域仅有入射光照明。在暗场显微镜下，入射光从侧面入射，反射时不被显微物镜1收集，因此只有微粒4散射光照亮的区域3能清晰成像。再通过三维位移平台6移动来控制微粒4来扫描整个样品表面，即可获得大面积超分辨图像。微粒支架5具有尖端结构，可以吸附或者粘贴微粒，另一端连接至三维位移平台6，控制微粒4在三维空间内自由移动。微粒用来散射显微镜的入射光，其大小为1至50微米，材料不限，形状不限。
如图2为成像样品的扫描电子显微镜图。本样品为蓝光光盘，其表面材料为非金属高分子聚合物。此样品的表面结构为线状结构，其中线宽为180纳米，相邻两条线之间的间隔为120纳米。
如图3为三种显微镜模式下对同一样品的成像效果比较，所用样品如附图2所示。将样品放置于普通明场显微镜下，并使用数值孔径为0.8的100×显微物镜观察位移焦平面上的样品，获得的图像如图3（a）所示，除了个别杂质外，样品表面的线状结构并不可见；换成暗场模式，线状结构依然不可见，如图3（b）所示；当使用本发明提到的散射光照明模式，其结果如图3（c）所示，其中白色圆形物体为本发明中使用的微粒4，其直径大约为7微米，在微粒旁边有两块区域，见虚线框，散射光光强最大，样品被成像到像平面，线条结构清晰可见，但成像范围较小。为说明本发明可应用于不同数值孔径的显微物镜，又采用了数值孔径0.9的150×显微物镜来重复上述三种成像模式，其中图3（d）为明场照明，图3（e）为暗场照明，图3（f）为微粒的散射光照明。在明场和暗场条件下，样品表面的线条结构无法分辨，而在微粒的散射光照明下，结构清晰可见。图3（f）中微粒直径为4微米，相比于图3（c）中7微米的微粒，具有更大的成像区域。所有以上结果中照明光源均为溴钨灯，其光谱范围包括整个可见光波段，中心波长为550纳米。
在本发明中，采用暗场显微镜为基础，用来降低入射光的影响，只接收散射光信号。不同于普通的暗场显微镜的传播波照明，本技术采用样品表面附近的微粒的散射光照明技术，即入射光照射在微粒上之后产生的散射光来照明样品表面，从而获得更高的空间分辨率。
Claims (2)
1.一种基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)在现有的暗场光学显微镜的基础上增加三维移动设备，三维移动设备控制微米级的微粒移动；
2)将待测样品置于显微物镜的焦平面上；
3)将微粒移动接近待测样品表面，距离待测样品不超过1微米；
4)入射光从侧面入射，微粒对入射光散射，使得微粒附近的区域被散射光照亮，在微粒的散射光照明下，暗场光学显微镜对微粒周围被散射光照亮的待测样品表面区域进行成像，完成待测样品表面部分图像采集；
5)利用三维移动设备控制微粒在样品表面逐步按次序移动，并控制微粒距离待测样品表面的间隔不超过1微米，每移动一步，用暗场光学显微镜采集一次图像，直至完成待测样品表面的图像采集；
6)将所有采集图像按次序拼接，实现待测样品表面超分辨图像。
2.根据权利要求1所述基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，其特征在于，所述微粒大小为1至50微米，用来散射显微镜的入射光，散射光作为显微镜的照明光源，散射光中高频分量经过样品表面的调制后，将有倏逝波转化成传播波，再由显微物镜收集，成像与像平面上。
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