CN109709666A - 基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统及方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统及方法，在反射工作模式下，其包括光源模块、超分辨平场扫描物镜模块、样品二维扫描模块、非标记显微探测模块、相衬模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块；在透射工作模式下，其光源模块、超分辨光束透射照明模块、超分辨平场扫描物镜模块、样品二维扫描模块、非标记显微探测模块、相衬模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块。其采用超分辨平场扫描物镜、超分辨照明透镜，在共聚焦模式下，实现三维样品的非标记超分辨分辨率显微图像快速获取，横向分辨率小于衍射极限。
Description
技术领域
本发明属于可见光显微技术领域，特别是涉及远场超分辨显微技术，应用于生物样品、材料样品等的检测。
背景技术
现有显微技术大致可分为近场显微与远场显微两大类，近场显微包括微球体辅助成像、近场扫描显微等方法。近场显微方法能实现了超分辨显微成像，但其工作距离小于工作波长，极大的限制了其实际应用；远场超分辨技术，工作距离大，可以克服近场显微技术的不足。现有的远场超分辨显微技术包括受激发射损耗显微、局部激活显微、随机光重构光学显微等，然而，这些技术都需要对被检测样品进行荧光分子标记。由于荧光标记多色标记难度大且标记过程复杂、荧光标记干扰、光毒性、漂白性等不足，难以满足生命科学研究对多亚细胞结构相互作用过程观测的需求。非标记的远场超分辨显微技术，具有工作距离大、无需对样品进行标记，使用方便，因此成为超分辨光学显微镜的技术的重要发展趋势。近年来，基于超衍射器件的非标记远场超分辨显微已有少数实验报道，然而这类系统仅仅是采用超衍射器件来实现超分辨照明，其收集透镜仍然是采用传统光学显微物镜，极大地制约了其分辨率的提升。
技术背景参考文献：
[1]Edward T.F.Rogers,Jari Lindberg,Tapashree Roy,Salvatore Savo,JohnE.Chad,Mark R.Dennis and Nikolay I.Zheludev.“A super-oscillatory lens opticalmicroscope for subwavelength imaging,”Nature Materials,Vol.11,pp.432-435(2012).
[2]Edward T F Rogers and Nikolay I Zheludev.“Optical super-oscillations:sub-wavelength light focusing and super-resolution imaging,”Journal of Optics,Vol.15,pp.094008(2013).
[3]Y Yan,L Li,C Feng,W Guo,S Lee,M Hong.“Microsphere-Coupled ScanningLaser Confocal Nanoscope for Sub-Diffraction-Limited Imaging at 25nm LateralResolution in the Visible Spectrum,”ACS Nano,Vol.8,pp.1809-1816(2014).
[4]Fei Qin,Kun Huang,Jianfeng Wu,Jinghua Teng,Cheng-Wei Qiu,andMinghui Hong.“A Supercritical Lens Optical Label-Free Microscopy:Sub-Diffraction Resolution and Ultra-Long Working Distance,”Advanced Materials,Vol.28,1602721(2017)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统及方法。该系统能实现三维样品非标记超分辨显微图像的快速获取，可应用于生物样品、材料样品等的检测。
本发明通过以下技术方案来加以实现：
一种基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，系统可以工作在反射工作模式和透射工作模式。
在反射工作模式下，其通过沿光路布置的光源模块、超分辨平场扫描物镜模块、样品二维扫描模块、非标记显微探测模块、相衬模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块配合工作实现。
在透射工作模式下，其通过沿光路布置的光源模块、超分辨光束透射照明模块、超分辨平场扫描物镜模块、样品二维扫描模块、非标记显微探测模块、相衬模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块配合实现。
本系统中，所述光源模块用于产生用于照明的准直激光光束，其包括激光器、光纤耦合器、光纤分束器、光纤准直器A和光纤准直器B。由激光器输出波长为λ0激光光束，经过光纤耦合器进入光纤分束器，由光纤分束器输出两路激光分别由两个光纤准直器A准直后，形成两路准直激光输出分别提供给反射和透射照明。
进一步，光纤分束器还输出一路激光由光纤准直器B准直后，形成一路准直激光输出提供给相衬模块。
本系统中，所述超分辨平场扫描物镜模块用于对样品的超分辨照明、信号光收集和快速扫描，其包括扫描振镜、超分辨平场扫描物镜和一维定位台。超分辨平场扫描物镜固定在一维定位台上，通过控制一维定位台控制超分辨平场扫描物镜焦平面在Z轴方向的位置。光源模块光纤准直器输出波长为λ0准直激光束，由扫描振镜反射至超分辨平场扫描物镜；超分辨平场扫描物镜形成的超分辨照明焦斑照在样品上，样品产生波长为λ0的散射光；散射光被超分辨平场扫描物镜收集、准直后，沿原光路返回至扫描振镜；并由扫描振镜反射回波长为λ0准直激光束的入射光路。
在反射工作模式下：通过控制扫描振镜实现光束的在XY平面的二维快速扫描，进而实现超分辨平场扫描物镜对其焦平面上的样品进行二维扫描超分辨照明和信号光(波长为λ0的散射光)的快速收集；通过控制一维定位台控制超分辨平场扫描物镜焦平面位置，并结合二维扫描可以实现三维层析显微；并可以结合二维定位台二维扫描，进一步扩大二维扫描显微范围。
在透射工作模式下，扫描振镜和超分辨平场扫描物镜不进行扫描。超分辨平场扫描物镜仅用于信号光收集，由超分辨光束透射照明模块对样品进行超分辨照明，并在样品中形成波长为λ0的信号光(透射光和散射光)；信号光被超分辨平场扫描物镜收集；通过一维纳米定位台控制超分辨平场扫描物镜焦平面位置、通过单轴纳米位移台控制透射照明焦斑的位置，保证其与超分辨平场扫描物镜Z轴上的焦点重合，并结合二维纳米定位台二维扫描，可以实现三维层析显微。
本系统的所述超分辨平场扫描物镜分为中心的区域A和外环的区域B，其中区域A和区域B为两个工作波长为λ0的超分辨透镜；两个区域对应的超分辨透镜均采用相位调控超表面结构，且两个区域对应的超分辨透镜焦距均为f。
所述超分辨平场扫描物镜区域A能对波长为λ0的离轴准直激光束实现超分辨聚焦，而区域B能够实现对波长为λ0的信号光(散射光或透射光)的超分辨收集；对于波长为λ0相干光，在入射角度θ<θmax的范围内，超分辨平场扫描物镜的区域A对应的超分辨透镜和区域B对应的超分辨透镜两者所形成的焦斑中心位置始终重合，焦斑中心位置偏移量与入射角度θ成正比；且区域A对应的超分辨透镜和区域B对应的超分辨透镜，两者的点扩散函数均为超分辨点扩散函数；在焦平面内对应的点扩散函数分别为h0(x,y,θ)和h1(x,y,θ)，且h0(x,y,θ)和h1(x,y,θ)的半高全宽均小于阿贝衍射极限0.5λ0/NA0和0.5λ0/NA1，其中NA0和NA1分为超分辨平场扫描物镜区域A对应的超分辨透镜和区域B对应的超分辨透镜的数值孔径。
本系统中，所述样品二维扫描模块用于样品的二维平面扫描移动，其包括载玻片和二维纳米定位台。样品放置在载玻片上，二载玻片被固定在二维定位台上，通过控制二维定位台实现对样品在XY面上的二维扫描移动。
本系统中，所述超分辨光束透射照明模块主要用于透射工作模式，用于产生超分辨透射照明光束，其包括五维调节机构、二轴倾斜调节机构、一维定位台、超分辨照明透镜和三维调节机构。光源模块的光纤准直器安装在五维调节机构上；通过调节五维调节机构控制准直光束的垂直入射超分辨照明透镜；超分辨照明透镜安装在一维定位台上，而一维定位台安装在二轴倾斜调节机构上，通过调节二轴倾斜调节结构控制超分辨照明透镜聚焦方向、通过一维定位台精密控制超分辨照明透镜焦平面在Z轴方向的位置；五维调节机构和二轴倾斜调节机构安装在三轴调节机构上，通过调节三轴调节机构调节整个超分辨光束透射照明模块的空间三维位置，以实现超分辨照明透镜焦平面与被检测样品的对准。所述超分辨照明透镜能对波长为λ0的正入射激光束实现超分辨聚焦，其在XY平面内对应的点扩散函数为h′0(x,y)，且h′0(x,y)的半高全宽阿贝衍射极限0.5λ0/NA′0，其中NA′0为超分辨照明透镜在波长为λ0下的数值孔径。
本系统中，所述非标记显微探测模块用于对样品光信号的探测，其包括分束器、管镜、针孔、三维调节机构、激光准直透镜、带通滤光片和光电倍增管。针孔安装在三维调节机构上。由超分辨平场扫描物镜模块中扫描振镜反射回的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)，由分束器反射进入非标记显微探测模块；由空间滤波器滤除超分辨平场扫描物镜区域A收集的信号光，仅让区域B收集的信号光通过；区域B收集的信号光被管镜汇聚在其焦平面上，通过调节三维调节机构使信号光(散射光或透射光)焦斑中心与针孔中心重合；信号光(散射光或透射光)通过针孔后，由准直透镜准直，并由带通滤光片进一步滤除环境光或可能的样品荧光，最后送入光电倍增管进行探测。
本系统中，所述高速信号采集模块，主要用于采集光电倍增管的光电信号。
本系统中，所述扫描控制模块，主要用于控制一维定位台、二维定位台的位移控制。
本系统中，显微监控模块主要用于观测样品和照明光斑，其包括分束器、管镜和光电探测器阵列；由超分辨平场扫描物镜收集的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)，通过分束器反射进入显微监控模块，并由管镜成像在光电探测器阵列，最后由计算机及软件模块读取对应的图像。
本系统中，计算机及软件模块主要用于样品位移和信号获取的同步控制，并生成显微图像。
进一步，本系统还具有相衬模块，所述相衬模块用于控制参考光的相位，其包括可以转动的相位调节片，通过旋转角度，改变光源模块的光纤准直器B输出准直光束透射光的光程，从而改变出射准直光束的相位，提供该光束作为波长为λ0的信号光(散射光或透射光)的参考光，该参考光透过分束器与由分束器反射的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)合束，并与之进行干涉，以实现对透明样品进行相衬显微成像。
进一步，本系统中的一维定位台、二维定位台、一维定位台均采用纳米级定位的定位台。
本发明的系统和方法通过上述基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，采用超分辨平场扫描物镜、超分辨照明透镜，在共聚焦模式下，能实现三维样品的标记超分辨显微图像快速获取，在空气中分辨率优于λ0/5(λ0为照明波长)。本发明的系统和方法具有反射和透射两种工作模式，其可应用于生物样品、材料样品等的检测应用等，也可以应用于工业相关超分辨显微检测等领域。
附图说明
图1基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统示意图；
图2A超分辨平场扫描物镜示意图；
图2B是图2A的俯视图；
图3超分辨平场扫描物镜结构对离轴光束聚焦示意图；
图4A超分辨照明透镜示意图；
图4B是图4A的俯视图；
图5超分辨照明透镜示聚焦意图；
图6超分辨平场扫描物镜区域A对应透镜的相位分布示例
图7超分辨平场扫描物镜区域A对应超分辨透镜，在0-1.5度范围内的主要聚焦参数
图8透射式光路对准示意图
图9相干光显微情况下照明透镜和收集透镜的强度点扩散函数半高全宽与系统分辨率的关系图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案作进一步描述。
如图1所示，本发明提出基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其包括光源模块、超分辨平场扫描物镜模块、超分辨光束透射照明模块、样品二维扫描模块、非标记显微探测模块、相衬模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块。系统可以工作在反射工作模式和透射工作模式，其具体结构如下：
在反射工作模式下，其包括沿光路布置的光源模块、超分辨平场扫描物镜模块、样品二维扫描模块、非标记显微探测模块、相衬模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块。
在透射工作模式下，其包括沿光路布置的光源模块、超分辨光束透射照明模块、超分辨平场扫描物镜模块、样品二维扫描模块、非标记显微探测模块、相衬模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块。
所述光源模块用于产生用于照明的准直激光光束，其包括激光器1、光纤耦合器2、光纤分束器3、光纤准直器A4和光纤准直器B5。由激光器输出波长为λ0激光光束，经过光纤耦合器进入光纤分束器3，由光纤分束器输出的两路激光分别由光纤准直器A4和光纤准直器B5准直后，形成两路准直激光输出。其中光纤准直器A4一路，提供照明光束；而光纤准直器B5一路，提供参考光束。
所述超分辨平场扫描物镜模块用于对样品9的超分辨照明、信号光(散射光)收集和扫描，其包括扫描振镜6、超分辨平场扫描物镜7和一维定位台8，本系统中采用一维纳米定位台。超分辨平场扫描物镜7固定在一维纳米定位台8上，通过控制一维纳米定位台8控制超分辨平场扫描物镜7焦平面在Z轴向的位置。光源模块光纤准直器4输出波长为λ0准直激光束，由扫描振镜6反射至超分辨平场扫描物镜7；超分辨平场扫描物镜7形成的超分辨照明焦斑照在样品9上，样品9产生波长为λ0的散射光；散射光被超分辨平场扫描物镜7收集准直后，沿原光路返回至扫描振镜6；并由扫描振镜6反射回波长为λ0准直激光束的入射光路。
所述超分辨平场扫描物镜7、扫描振镜6，通过两者的结合可以实现快速超分辨二维照明扫描，并实现对波长为λ0的信号光(散射光或透射光)的快速超分辨二维扫描收集。
在反射工作模式下：通过控制扫描振镜6实现光束的在XY平面的二维快速扫描，进而实现超分辨平场扫描物镜7对其焦平面上的样品9进行二维扫描超分辨照明和信号光(波长为λ0的散射光)的快速探测；通过控制一维纳米定位台8控制超分辨平场扫描物镜7焦平面位置，并结合二维扫描可以实现三维层析显微；并可以结合二维纳米定位台11二维扫描，进一步扩大二维扫描显微范围。
在透射工作模式下，扫描振镜6和超分辨平场扫描物镜7不进行扫描；超分辨平场扫描物镜7仅用于信号光收集，由超分辨光束透射照明模块对样品9进行超分辨照明，并在样品9中形成波长为λ0的信号光(透射光和散射光)；信号光被超分辨平场扫描物镜收集；通过一维纳米定位台8控制超分辨平场扫描物镜7焦平面位置，通过一维定位台14，即一个单轴纳米位移台控制透射照明焦斑的位置，保证其与超分辨平场扫描物镜7在Z轴上的焦点重合，并结合二维纳米定位台11二维扫描，可以实现三维层析显微。
所述样品二维扫描模块用于样品9的二维平面扫描移动，其包括样品9、载玻片10和二维纳米定位台11。样品9放置在载玻片10上，载玻片被固定在二维纳米定位台11上，通过控制二维纳米定位台11实现对样品9在XY面上的二维扫描移动。
所述超分辨光束透射照明模块主要用于透射工作模式，用于产生超分辨透射照明光束，其包括五维调节机构12、二轴倾斜调节机构13、一维纳米定位台14、超分辨照明透镜15和三维调节机构16。光源模块的光纤准直器4安装在五维调节机构12上；通过调节五维调节机构12控制准直光束的垂直入射超分辨照明透镜15；超分辨照明透镜15安装在一维纳米定位台14上，而一维纳米定位台14安装在二轴倾斜调节机构13上，通过调节二轴倾斜调节结构13控制超分辨照明透镜15聚焦方向、通过一维纳米定位台14精密控制超分辨照明透镜15焦平面在Z轴方向的位置；五维调节机构12和二轴倾斜调节机构13安装在三轴调节机构上12，通过调节三轴调节机构16调节整个超分辨光束透射照明模块的空间三维位置，以实现超分辨照明透镜15焦平面与被检测样品9的对准。
所述非标记显微探测模块用于对样品光信号(散射光或透射光)的探测，其包括分束器17、空间滤波器18、管镜19、针孔20、三维调节机构21、激光准直透镜22、带通滤光片23和光电倍增管24。针孔20安装在三维调节机构21上。由超分辨平场扫描物镜模块中扫描振镜6反射回的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)由分束器17反射进入非标记显微探测模块；由空间滤波器18滤除超分辨平场扫描物镜7区域A收集的信号光，仅让区域B收集的信号光通过；区域B收集的信号光被管镜19汇聚在其焦平面上，通过调节三维调节机构21使信号光(散射光或透射光)焦斑中心与针孔20中心重合；信号光(散射光或透射光)通过针孔20后，由准直透镜22准直，并由带通滤光片23进一步滤除环境光或可能的样品荧光，最后送入光电倍增管24进行探测。空间滤波器18为一个圆形平板玻璃片，其中心位置为一圆形挡光/吸光膜，该圆半径与超分辨平场扫描物镜7区域A一致。
所述相衬模块用于控制参考光的相位，其包括可以转动的相位调节片25，其为具有一定厚度的平板玻璃片(确保旋转大于1度时，光程变化为λ0)，通过旋转角度，控制光源模块光纤准直器B5输出准直光束透射光的光程，进而改变出射准直光束的相位。
所述高速信号采集模块26，主要用于采集光电倍增管24的光电信号。
所述扫描控制模块27，主要用于控制一维纳米定位台8、二维纳米定位台11和一维纳米定位台14的位移控制。
显微监控模块主要用于观测样品9和照明光斑，其包括分束器28、管镜29和光电探测器阵列30；由超分辨平场扫描物镜7收集的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)，通过分束器28反射进入显微监控模块，并由管镜29成像在光电探测器阵列30，最后由计算机及软件模块31读取对应的图像。
计算机及软件模块31主要用于一维纳米定位台8、二维纳米定位台11和一维纳米定位台14、样品9位移控制、高速信号采集模块26信号的同步获取，最后生成超分辨显微图像。
通过所述超分辨平场扫描物镜7、扫描振镜6的结合可以实现快速超分辨二维照明扫描，并实现对波长为λ0的信号光(散射光或透射光)快速超分辨二维扫描收集。
本系统中，五维调节机构12、二轴倾斜调节机构13、三维调节机构16、三维调节机构21均可以采用用手动调节，其中12和21一旦调节好后，就永久性锁定。
如图2A和图2B所示，给出了超分辨平场扫描物镜结构示意图。该超分辨平场扫描物镜分为两个区域，中心的区域A和外环的区域B，其中区域A和区域B均为工作波长为λ0的超分辨透镜；两个区域的超分辨透镜采用相位调控超表面结构(如：采用全介质几何相位调控超表面)，其焦距均为f。
如图3所示，给出了超分辨平场扫描物镜结构对离轴光束聚焦示意图，该物镜分为两个区域，其中区域A和区域B均为工作波长为λ0的超分辨透镜，两个区域的超分辨透镜具有相同的焦距f。波长为λ0的准直照明光束以θ角度入射区域A，被区域A聚焦成超分辨焦斑，并在样品中形成波长为λ0的散射光；该散射光被区域B对应的超分辨透镜收集、准直后沿原入射光路返回，其中虚线箭头表示光传播的方向。
如图4A和图4B所示，给出了超分辨照明透镜15示意图。超分辨照明透镜15采用相位调控超表面结构(如：采用全介质几何相位调控超表面)，超表面结构对波长λ0的透射率高(>0.8)。
如图5所示，给出了超分辨照明透镜示聚焦意图；波长为λ0的准直照明光束正入射，被超分辨照明透镜聚焦成超分辨焦斑，其中箭头表示光传播的方向。
如图6所示，给出了超分辨平场扫描物镜区域A对应透镜的相位分布示例，该透镜半径为120λ0，焦距为30λ0，数值孔径NA为0.97。采用32个相位(0-2π之间，32个等间隔相位)，并利用粒子群算法对区域A透镜相位分布优化设计，以实现超分辨聚焦；超分辨平场扫描物镜区域B的相位，可以采用类似方法实现进行优化，实现相应的信号光超分辨收集；类似地，图5中给出的超分辨照明透镜，可以采用类似的方法，实现相应的超分辨聚焦。
如图7所示，给出了图6中的超分辨平场扫描物镜区域A对应超分辨透镜，在0-1.5度范围内的主要聚焦参数。在上图中，实线、点划线、实心圆线、空心圆线分别为焦斑峰值强度、最大旁瓣比(最大旁瓣与峰值强度的比值)、焦斑X方向半高全宽、焦斑Y方向半高全宽等参数随扫描角度θ变化的关系；虚线和点线分别为瑞利衍射极限和超振荡判据；在下图中给出了焦斑中心位置偏移量随θ变化的关系。可以看出：在1.5度的偏转范围内，焦斑半高全宽小于0.43λ0(小于瑞利衍射极限)；最大旁瓣比小于0.2；焦斑中心位置偏移量与θ成线性关系，偏移量可以达到2λ0，因此在XY平面内可以通过快速扫描实现4λ0×4λ0的扫描显微范围。通过进一步增大透镜半径，焦斑半高全宽的尺寸可以压缩；同时，通过增大焦距，可以进一步增大焦斑中心位置偏移量，从而进一步增大扫描范围。
如图8所示，给出了透射式光路对准示意图，其中超分辨物镜与超分辨照明透镜在Z轴上的焦点重合。
如图9所示，给出了相干光显微情况下照明透镜和收集透镜的强度点扩散函数半高全宽与系统分辨率的关系图；图中横坐标和纵坐标分别给出了照明透镜和收集透镜点扩散函数半高全宽与系统分辨率的关系，其中等高线给出了对应的系统分辨率。当其中一个点扩散函数的半高全宽达到0.3λ0时，系统分辨率可达λ0/5。
Claims (10)
1.一种基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于所述系统包括：
光源模块，用于产生准直激光光束；
超分辨平场扫描物镜模块，用于对样品进行超分辨照明、信号光收集和扫描；包括扫描振镜(6)、超分辨平场扫描物镜(7)和一维定位台(8)；所述超分辨平场扫描物镜(7)固定在一维定位台(8)上，通过控制一维定位台(8)控制超分辨平场扫描物镜(7)焦平面在Z轴方向的位置；所述扫描振镜(6)将光源模块的光纤准直器A(4)输出的波长为λ0的准直激光束反射至超分辨平场扫描物镜(7)；超分辨平场扫描物镜(7)形成的超分辨照明焦斑照在样品(9)上，样品产生波长为λ0的散射光；散射光被超分辨平场扫描物镜(7)收集准直后，沿原光路返回至扫描振镜(6)，并由扫描振镜(6)反射回波长为λ0准直激光束的入射光路；
样品二维扫描模块，用于样品的二维平面扫描移动；包括载玻片(10)和二维定位台(11)；载玻片(10)被固定在二维定位台(11)上，用于放置样品(9)，通过控制二维定位台(11)实现对样品(9)在XY面上的二维扫描移动；
超分辨光束透射照明模块，用于在透射工作模式时产生超分辨透射照明光束；包括五维调节机构(12)、二轴倾斜调节机构(13)、一维定位台(14)、超分辨照明透镜(15)和三维调节机构(16)；光源模块的光纤准直器A(4)安装在五维调节机构(12)上，通过调节五维调节机构(12)控制准直光束垂直入射超分辨照明透镜(15)；超分辨照明透镜(15)安装在一维定位台(14)上，一维定位台(14)安装在二轴倾斜调节机构(13)上，通过调节二轴倾斜调节结构(13)控制超分辨照明透镜(15)聚焦方向，通过一维定位台(14)精密控制超分辨照明透镜(15)焦平面在Z轴方向的位置；五维调节机构(12)和二轴倾斜调节机构(13)安装在三轴调节机构上(12)，通过调节三轴调节机构(16)调节整个超分辨光束透射照明模块的空间三维位置，实现超分辨照明透镜(15)焦平面与被检测样品(9)的对准；
非标记显微探测模块，用于对样品信号光，即散射光或透射光的探测；
高速信号采集模块，用于采集非标记显微探测模块的光电信号；
扫描控制模块，用于控制一维定位台(8)、一维定位台(14)、二维定位台(11)的位移；
显微监控模块，用于观测样品和照明光斑，由计算机及软件模块读取对应的图像；
计算机及软件模块，用于样品位移和信号获取的同步控制并生成超分辨显微图像；
所述系统具有反射工作模式和透射工作模式；所述反射工作模式由光源模块、超分辨平场扫描物镜模块、样品二维扫描模块、非标记显微探测模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块配合实现；所述透射工作模式由光源模块、超分辨光束透射照明模块、超分辨平场扫描物镜模块、样品二维扫描模块非标记显微探测模块、高速信号采集模块、扫描控制模块、显微监控模块和计算机及软件模块配合实现。
2.根据权利要求1所述的基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述超分辨平场扫描物镜(7)分为中心的区域A和外环的区域B，其中区域A和区域B为两个工作波长为λ0的超分辨透镜；两个区域对应的超分辨透镜均采用相位调控超表面结构，且两个区域对应的超分辨透镜焦距均为f；
所述超分辨平场扫描物镜(7)区域A能对波长为λ0的离轴准直激光束实现超分辨聚焦，而区域B能够实现对波长为λ0的信号光(散射光或透射光)的超分辨收集；对于波长为λ0相干光，在入射角度θ<θmax的范围内，超分辨平场扫描物镜的区域A对应的超分辨透镜和区域B对应的超分辨透镜两者所形成的焦斑中心位置始终重合，焦斑中心位置偏移量与入射角度θ成正比；且区域A对应的超分辨透镜和区域B对应的超分辨透镜，两者的点扩散函数均为超分辨点扩散函数；在焦平面内对应的点扩散函数分别为h0(x,y,θ)和h1(x,y,θ)，且h0(x,y,θ)和h1(x,y,θ)的半高全宽均小于阿贝衍射极限0.5λ0/NA0和0.5λ0/NA1，其中NA0和NA1分为超分辨平场扫描物镜区域A对应的超分辨透镜和区域B对应的超分辨透镜的数值孔径。
3.根据权利要求1所述的基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述超分辨照明透镜(15)能对波长为λ0的正入射激光束实现超分辨聚焦，其在XY平面内对应的点扩散函数为h′0(x,y)，且h′0(x,y)的半高全宽阿贝衍射极限0.5λ0/NA′0，其中NA′0为超分辨照明透镜在波长为λ0下的数值孔径。
4.根据权利要求1、2、3或4所述的基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，在反射工作模式下，通过控制扫描振镜(6)实现光束的在XY平面的快速二维扫描，进而实现超分辨平场扫描物镜(7)对其焦平面上的样品(9)进行二维扫描超分辨照明和信号光(散射光或透射光)收集；通过控制一维定位台(8)控制超分辨平场扫描物镜(7)焦平面位置，并结合二维扫描可以实现三维层析显微；并可以结合二维定位台(11)二维扫描，进一步扩大二维扫描显微范围；
在透射工作模式下，所述扫描振镜(6)和超分辨平场扫描物镜(7)不进行扫描；超分辨平场扫描物镜(7)仅用于收集波长为λ0的信号光(散射光或透射光)；超分辨照明透镜(15)将波长为λ0的照明光束在样品(9)中实现超分辨聚焦，并在样品(9)中形成波长为λ0信号光(散射光或透射光)；通过一维定位台(8)控制超分辨平场扫描物镜(7)焦平面位置、通过单轴纳米位移台(14)控制透射照明焦斑的位置，保证其与超分辨平场扫描物镜(7)Z轴上的焦点重合，波长为λ0的信号光(散射光或透射光)由超分辨平场扫描物镜(7)收集、准直，并沿入射光路返回至扫描振镜(6)，并由扫描振镜(6)反射回入射光路，并结合二维定位台(11)二维扫描，可以实现三维层析显微。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述系统还具有相衬模块，用于提供与信号光相干的参考光，所述相衬模块包括可以转动的相位调节片(25)，其旋转大于1度时，光程变化为λ0,通过旋转角度，改变光源模块的光纤准直器B(5)输出准直光束透射光的光程，进而改变出射准直光束的相位，提供该光束作为信号光(散射光或透射光)的参考光，该参考光透过分束器(17)与由分束器(17)反射进入非标记显微探测模块的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)合束，并与之进行干涉，以实现对透明样品(9)进行相衬显微成像；所述光纤准直器B(5)是光纤分束器(3)另一个输出端口输出的波长为λ0的参考光束。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述光源模块包括激光器(1)、光纤耦合器(2)、光纤分束器(3)、光纤准直器(4)A；由激光器输出波长为λ0激光光束，经过光纤耦合器进入光纤分束器(3)，由光纤分束器(3)输出两路激光分别由两个光纤准直器A(4)准直后，形成两路准直激光输出分别提供给反射和透射照明；
进一步，光纤分束器(3)还输出一路激光由光纤准直器B(5)准直后，形成一路准直激光输出提供给相衬模块。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述非标记显微探测模块包括分束器(17)、空间滤波器(18)、管镜(19)、针孔(20)、三维调节机构(21)、激光准直透镜(22)、带通滤光片(23)和光电倍增管(24)；针孔(20)安装在三维调节机构(21)上；由超分辨平场扫描物镜模块中扫描振镜(6)反射回的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)，由分束器(17)反射进入非标记显微探测模块；由空间滤波器(18)滤除超分辨平场扫描物镜(7)区域A收集的信号光，仅让区域B收集的信号光通过；区域B收集的信号光被管镜(19)汇聚在其焦平面上，通过调节三维调节机构(21)使信号光(散射光或透射光)焦斑中心与针孔(20)中心重合；信号光(散射光或透射光)通过针孔(20)后，由准直透镜(22)准直，并由带通滤光片(23)进一步滤除环境光或可能的样品荧光，最后送入光电倍增管(24)进行探测。
8.根据权利要求1、2、3或4所述的基于超分辨透镜的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述显微监控模块包括分束器(28)、管镜(29)和光电探测器阵列(30)；由超分辨平场扫描物镜(7)收集的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)，通过分束器(28)反射进入显微监控模块，并由管镜(29)成像在光电探测器阵列(30)，最后由计算机及软件模块(31)读取对应的图像。
9.利用权利要求1-9之任一项所述系统实现非标记远场超分辨显微的方法，其特征在于，所述系统有两种工作模式反射工作模式和透射工作模式：
在反射工作模式下：
通过激光器(1)输出波长为λ0的激光束，通过光纤耦合器(2)耦合进入光纤分束器(3)，并由光纤分束器(3)的其中一个输出端输出，并由光纤准直器A(4)进行准直；该准直激光束透射过分束器(17)，由扫描振镜(6)反射，透过分束器(28)后，由安装在一维定位台(8)上的超分辨扫描物镜(7)聚焦，其焦斑小于阿贝衍射极限0.5λ0/NA0，NA0为超分辨扫描物镜的数值孔径；该焦斑照明样品(9)，并被样品(9)散射形成波长为λ0的散射光；波长为λ0的散射光被超分辨扫描物镜(7)收集、准直后，沿原光路返回；经过分束器(28)，分为两路光束；
其中一路直接透射过分束器(28)，由扫描振镜(6)反射回原光路；波长为λ0的散射光由分束器(17)反射；经过管镜(19)聚焦通过安装在三位调节机构(21)上的针孔(20)中心；由准直透镜(22)准直后，通过带通滤波器(23)进一步滤除环境光或可能的样品荧光；最后波长为λ0的散射光进入光电倍增管(24)进行检测。由光电倍增管(24)获得的波长为λ0的散射光信号，通过高速信号采集模块采集后，由计算机及软件模块(31)获取；通过扫描控制模块(27)控制扫描振镜(6)实现对超分辨平面扫描物镜焦平面上样品(9)的XY面扫描，获取超分辨显微图像；通过扫描控制模块(27)控制二维定位台(11)，可以进一步实现更大XY面扫描显微范围；通过扫描控制模块(27)控制一维定位台(14)，可以控制超分辨平面扫描物镜(7)焦平面与样品(9)Z轴方向的相对位置，并结合扫描振镜(6)和超分辨平面扫描物镜(7)，可实现样品(9)的三维层析显微成像；
另一路由分束器(28)反射，并由管镜(29)成像在光电阵列探测器(30)上，其图像通过计算机及软件模块(31)获取；
在透射工作模式下：
通过激光器(1)输出波长为λ0的激光束，通过光纤耦合器(2)耦合进入光纤分束器(3)，并由光纤分束器(3)的另一个输出端输出，并由光纤准直器B(4)进行准直；该准直器安装在五维调节机构(12)上，调节五维调节机构使该准直光束，同轴入射安装一维定位台(14)上的超分辨照明透镜(15)；一维定位台(14)安装在二轴倾斜调节机构(13)上；超分辨照明透镜(15)将入射光束聚焦在焦平面上，其焦斑小于阿贝衍射极限0.5λ0/NA2(NA2为超分辨照明透镜的数值孔径)；五维调节机构(12)和二轴倾斜调节机构(13)安装在三轴调节机构上(16)，通过调节三轴调节机构(16)调节整个超分辨光束透射照明模块的空间三维位置，以实现超分辨照明透镜(15)焦平面与被检测样品(9)的对准；通过一维定位台(14)，可以精确调节焦斑在Z轴方向的位置；该焦斑照明样品(9)，所形成的波长为λ0的透射光和散射光被超分辨扫描物镜(7)收集、准直后，经过分束器(28)，分为两路光束；
其中一路直接透射过分束器(28)，由扫描振镜(6)反射；波长为λ0的透射光和散射光由分束器(17)反射；经过管镜(19)聚焦通过安装在三位调节机构(21)上的针孔(20)中心；由准直透镜(22)准直后，通过带通滤波器(23)进一步滤除环境光或可能的样品荧光；最后波长为λ0的透射光和散射光进入光电倍增管(24)进行检测。由光电倍增管(24)获得的波长为λ0的透射光和散射光信号，通过高速信号采集模块采集后，并由计算机及软件模块获取；通过扫描控制模块(27)控制二维定位台(11)，实现XY面扫描显微成像；通过扫描控制模块(27)控制一维定位台，可以控制超分辨平面扫描物镜(7)焦平面与样品(9)Z轴方向的相对位置，并结合二维定位台(11)，可实现样品(9)的三维层析显微；
另一路由分束器(28)反射，并由管镜(29)成像在光电阵列探测器(30)上，其图像通过计算机及软件模块(31)获取。
10.根据权利要求9所述的实现非标记远场超分辨显微的方法，其特征在于，
在两种照明模式下，可以将光纤分束器(3)另一个输出端口输出的波长为λ0的激光，通过光纤准直器B(5)准直后作为参考光，通过相衬模块的相位调节片(25)调节其出射相位，并透过分束器(17)与由分束器(17)反射进入非标记显微探测模块的波长为λ0的信号光(散射光或透射光)合束，并进行干涉，以实现对透明样品(9)进行相衬显微成像。
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| WO2022252300A1 (zh) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | 西安交通大学 | 基于飞秒激光结合超分辨透镜的光纤探针制备装置及方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106547079A (zh) * | 2017-01-17 | 2017-03-29 | 中国科学院上海光学精密机械研究所 | 实时三维激光荧光显微成像装置 |
| CN106932916A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-07-07 | 鲁东大学 | 一种利用超材料透镜的双光束超分辨聚焦方法 |
| CN109188669A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-01-11 | 重庆大学 | 基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统及方法 |
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Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN106547079A (zh) * | 2017-01-17 | 2017-03-29 | 中国科学院上海光学精密机械研究所 | 实时三维激光荧光显微成像装置 |
| CN106932916A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-07-07 | 鲁东大学 | 一种利用超材料透镜的双光束超分辨聚焦方法 |
| CN109188669A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-01-11 | 重庆大学 | 基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统及方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022252300A1 (zh) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | 西安交通大学 | 基于飞秒激光结合超分辨透镜的光纤探针制备装置及方法 |
| CN114113020A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-01 | 哈尔滨工业大学 | 一种基于多重信号分类算法的激光扫描超分辨显微成像装置、方法、设备及存储介质 |
| CN114113020B (zh) * | 2021-11-30 | 2023-07-07 | 哈尔滨工业大学 | 一种基于多重信号分类算法的激光扫描超分辨显微成像装置、方法、设备及存储介质 |
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