CN109188669A - 基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统及方法 - Google Patents

基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统及方法，其包括无衍射超分辨光束照明模块、样品二维扫描模块、显微光学模块、超分辨成像模块。其照明光源采用无衍射超分辨光束，具有工作距离大、照明光束传播距离远、照明光束穿透性强、光束的横向半高全宽小于衍射极限；并采用共聚焦模式，实现一种无需标记的远场超分辨成像系统和方法；并可以实现对透明样品的三维层析成像，横向分辨率小于衍射极限，分辨率优于λ/5。可应用于生物样品的非标记超分辨显微成像、也可以应用于工业相关超分辨显微检测等领域。

Description

基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统及 方法
技术领域
本发明属于可见光显微技术领域，特别是涉及一种基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统及方法，该系统能实现三维透明样品的非标记、超分辨分辨率、层析成像，可应用于生物样品的检测应用等。
背景技术
现有显微技术大致可分为近场显微与远场显微两大类，近场显微包括微球体辅助成像、近场扫描显微等方法。近场显微方法能实现了超分辨显微成像，但其工作距离小于工作波长，极大的限制了其实际应用；远场超分辨技术，工作距离大，可以克服近场显微技术的不足。现有的远场超分辨显微技术包括受激发射损耗显微、局部激活显微、随机光重构光学显微等，然而，这些技术都需要对被检测样品进行荧光分子标记。非标记的远场超分辨显微技术，具有工作距离大、无需对样品进行标记，使用方便，因此成为超分辨光学显微镜的技术的重要发展趋势。近年来，基于超衍射器件的非标记远场超分辨显微已有少数实验报道，然而，现有非标记远场超分辨显微的照明光束的焦深较短、难以穿透样品玻璃载片、也难以穿透较厚的样品实现超分辨照明，极大地限制了其实际应用；同时，现有非标记远场超分辨显微的照明光束的焦深较短、难以穿透样品玻璃载片，也使得无法使用大数值孔径、高放大倍率的显微物镜，无法减小物镜点扩散函数半高全宽，因此难以进一步提升系统整体分辨率。
技术背景参考文献：
[1]Edward T.F.Rogers,Jari Lindberg,Tapashree Roy,Salvatore Savo,JohnE.Chad,MarkR.Dennis and NikolayI.Zheludev.“A super-oscillatory lens opticalmicroscope for subwavelength imaging,”Nature Materials,Vol.11,pp.432-435(2012).
[2]Edward T F Rogers and Nikolay I Zheludev.“Optical super-oscillations:sub-wavelength light focusing and super-resolution imaging,”Journal of Optics,Vol.15,pp.094008(2013).
[3]Y Yan,L Li,C Feng,W Guo,S Lee,M Hong.“Microsphere-Coupled ScanningLaser Confocal Nanoscope for Sub-Diffraction-Limited Imaging at 25nm LateralResolution in the Visible Spectrum,”ACS Nano,Vol.8,pp.1809-1816(2014).
[4]Fei Qin,Kun Huang,Jianfeng Wu,Jinghua Teng,Cheng-Wei Qiu,andMinghui Hong.“A Supercritical Lens Optical Label-Free Microscopy:Sub-Diffraction Resolution and Ultra-Long Working Distance,”Advanced Materials,Vol.28,1602721(2017)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统及方法。其照明光源采用无衍射超分辨光束，具有工作距离大、照明光束传播距离远、照明光束穿透性强、光束的横向半高全宽小于衍射极限；并采用共聚焦模式，实现一种无需标记的远场超分辨成像系统和方法；并可以实现对透明样品的三维层析成像，横向分辨率小于衍射极限，分辨率优于λ/5。
本发明通过以下技术方案来加以实现：
一种基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统，其包括无衍射超分辨光束照明模块、样品二维扫描模块、传统显微光学模块、超分辨成像模块。
所述无衍射超分辨光束照明模块用于产生无衍射超分辨光束，其包括激光器、光纤耦合器、光纤、光纤准直器、超衍射透镜、五维调节机构、一维纳米位移压电台、二维俯仰调节机构和三维调节机构。
激光器输出的波长为λ的激光，通过光纤耦合器耦合进入光纤，并由光纤输出端的光纤准直器进行准直输出；所输出的准直激光束，同轴垂直入射超衍射透镜底部，透射光在超衍射透镜顶部输出，在其后的空间形成无衍射超分辨光束。超衍射器件工作距离大于200λ，所产生的无衍射超分辨光束长度大于100λ，该光束可以从厚度大于300λ的玻璃载片底部入射，并穿玻璃载片和玻璃载片顶部的测试样品，并能在样品内部形成超分辨照明(光束的半高全宽小于衍射极限0.5λ/NA，NA为超衍射透镜的数值孔径)。
光纤耦合器和光纤准直器分别与光纤两端连接；光纤准直器固定于五维调节机构；五维调节机构控制光纤准直器X、Y、Z方向水平移动和围绕X、Y轴的转动，以控制准直光束的相对于超衍射器件的入射角度、相对三维空间位置。
超衍射透镜固定在一维纳米位移压电台上；一维纳米位移压电台固定在二维俯仰调节机构上；通过一维纳米位移压电台的Z轴方向移动，控制超衍射透镜所产生的无衍射超分辨光束在Z轴方向的位置；通过二维俯仰调节机构控制无衍射超分辨光束的传播方向，以确保无衍射超分辨光束与Z轴同轴。
五维调节机构和二维俯仰调节机构固定在三维调节机构上，五维调节机构和二维俯仰调节机构依次沿Z轴方向分布；通过调节三维调节机构，控制无衍射超分辨光束在X、Y和Z轴方向的空间位置。
所述样品二维扫描模块，用于在扫描成像过程中对样品在XY平面内位置进行控制。其包括二维压电扫描台、玻璃载片；样品被安装在玻璃载片上，玻璃载片安装在二维压电扫描台上。
所述显微光学模块，用于获取光束的无衍射超分辨光束光强分布、样品的光学显微图像和无衍射超分辨光束与样品的相对位置。其包括显微物镜、一维纳米位移压电台、分束器、筒镜和数字相机，构成一个衍射受限的传统无限远光学显微镜；显微物镜固定在一维纳米位移压电台上，两者沿Z轴方向放置、并与Z轴同轴；筒镜光轴沿Y方向；分束器用于将传统无限远光学显微镜的光轴由Z方向转换到Y方向。
所述超分辨成像模块，用于收集超分辨光学信号，并结合样品二维扫描模块，实现给定Z轴位置Zf处XY平面内的二维超分辨显微扫描成像，实现三维扫描层析成像。其包括显微物镜、一维纳米位移压电台、分束器、筒镜、针孔、三维调节机构、准直透镜、光电倍增管、数据采集卡、一维位移调节机构和计算机。显微物镜、一维纳米位移压电台、分束器、筒镜、针孔、三维调节机构、准直透镜、光电倍增管依次沿Z轴放置，且同轴。显微物镜固定在一维纳米位移压电台上。通过一维纳米位移压电台，控制显微物镜焦点与样品在Z轴方向的相对位置，结合样品二维扫描模块，实现对样品的三维扫描层析成像；针孔位于筒镜的焦点位置。针孔固定在三维调节机构上，通过调节三维调节机构确保针孔位于筒镜的焦点位置；准直透镜用于收集通过针孔的光能量，并将其送入光电倍增管，由光电倍增管输出的反应光强度的电压信号，通过数据采集卡输入计算机。
通过一维纳米位移压电台，控制无衍射超分辨光束在Z轴方向的位置，并在Z轴方向上，使得无衍射超分辨光束横向半高全宽小于衍射极限的部分(Zb1,Zb2)，涵盖所需三维层析成像的样品Z轴方向的范围(Zo1,Zo2)；通过一维纳米位移压电台2控制安装在其上的显微物镜焦距位置，使其在Z轴上位置Zf处，并使Zf位于(Zo1,Zo2)范围内；然后，通过样品二维扫描模块中的二维压电扫描台带动样品在Z＝Zf的XY平面内，进行逐点二维扫描；在每个扫描点位置处，通过超分辨成像模块中的数据采集卡，读取光电倍增管输出的光强度信号；将光电倍增管输出的光强度信号，和与之对应的扫描点坐标一起，绘制成二维光强度分布图，即为样品在Z＝Zf所在XY面内的二维超分辨图像；通过获取不同Z＝Zf的位置XY面内的二维超分辨图像，便可以获得三维层析显微图像，其在XY面的分辨率小于衍射极限。
采用上述无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微，其照明光源采用无衍射超分辨光束，具有工作距离大、照明光束传播距离远、照明光束穿透性强、光束的横向半高全宽小于衍射极限；并采用共聚焦模式，实现一种无需标记的远场超分辨成像系统和方法；并可以实现对透明样品的三维层析成像，横向分辨率小于衍射极限，分辨率优于λ/5。可应用于生物样品的非标记超分辨显微成像、也可以应用于工业相关超分辨显微检测等领域
附图说明
图1基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统示意图；
图2光路对准示意图；
图3超衍射透镜产生无衍射超分辨光束示意图；
图4超衍射透镜在空气中产生的无衍射超分辨光束的理论仿真结果和实验结果图；
图5超衍射透镜产生无衍射超分辨光束穿过样品后示意图；
图6相干光照明情况下物镜和照明透镜的半高全宽与系统分辨率的关系图
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案作进一步描述。
如图1所示，本发明提出的基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统，其包括无衍射超分辨光束照明模块、样品二维扫描模块、传统显微光学模块、超分辨成像模块。其具体结构如下：
所述无衍射超分辨光束照明模块用于产生无衍射超分辨光束，其包括激光器1、光纤耦合器2、光纤3、光纤准直器4、超衍射透镜5、五维调节机构6、一维纳米位移压电台7、二维俯仰调节机构8和三维调节机构9。
光纤耦合器2和光纤准直器4分别与光纤3两端连接，激光器1输出波长为λ的激光束，通过光纤耦合器2耦合进入光纤3，并由光纤3输出端的光纤准直器4进行准直输出；所输出的准直激光束，同轴垂直入射超衍射透镜5底部，透射光在超衍射透镜5顶部输出，在其后的空间形成无衍射超分辨光束。超衍射器件工作距离大于200λ，所产生的无衍射超分辨光束长度大于100λ，该光束可以从厚度大于300λ的玻璃载片底部入射，并穿玻璃载片和玻璃载片顶部的测试样品，并能在样品内部形成超分辨照明(光束的半高全款小于衍射极限0.5λ/NA，NA为超衍射透镜的数值孔径)。
光纤准直器4固定于五维调节机构6；五维调节机构6控制光纤准直器4的X、Y和Z水平移动及围绕X轴和Y轴转动，以控制准直光束的相对于超衍射器件的入射角度、相对三维空间位置；超衍射透镜5固定在一维纳米位移压电台7上；一维纳米位移压电台7固定在二维俯仰调节机构8上；通过一维纳米位移压电台7的Z轴方向移动，控制超衍射透镜5所产生的无衍射超分辨光束在Z轴方向的位置；通过二维俯仰调节机构8控制无衍射超分辨光束的传播方向，以确保无衍射超分辨光束与Z轴同轴；五维调节机构6和二维俯仰调节机构8固定在三维调节机构9上，五维调节机构6和二维俯仰调节机构8依次沿Z轴方向分布；通过调节三维调节机构9，控制无衍射超分辨光束在X、Y和Z轴方向的空间位置。
所述样品二维扫描模块，用于在扫描成像过程中对样品在XY平面内位置进行控制。其包括二维压电扫描台10、玻璃载片11；样品12被安装在玻璃载片11上，玻璃载片11安装在二维压电扫描台10上。
所述显微光学模块，用于获取光束的无衍射超分辨光束光强分布、样品的光学显微图像和无衍射超分辨光束与样品的相对位置。其包括显微物镜13、一维纳米位移压电台14、分束器15、筒镜16和数字相机17，构成一个衍射受限的传统无限远光学显微镜；显微物镜13固定在一维纳米位移压电台14上，两者沿Z轴方向放置、并与Z轴同轴；筒镜16光轴沿X方向；分束器15用于将传统无限远光学显微镜的光轴由Z方向转换到X方向。
所述超分辨成像模块，用于收集超分辨光学信号，并结合样品二维扫描模块，实现给定Z轴位置的平面内的二维超分辨显微扫描成像；并实现三维扫描层析成像。其包括显微物镜13、一维纳米位移压电台14、分束器15、筒镜18、针孔19、三维调节机构20、准直透镜21、光电倍增管22、数据采集卡23、一维位移调节机构24、和计算机25；显微物镜13、一维纳米位移压电台14、分束器15、筒镜18、针孔19、三维调准直透镜21、光电倍增管22依次沿Z轴放置，且同轴。显微物镜13固定在一维纳米位移压电台14上。通过一维纳米位移压电台14，控制显微物镜13焦点与样品在Z轴方向的相对位置，结合样品二维扫描模块，实现对样品的三维扫描层析成像；针孔19位于筒镜18的焦点位置。针孔19固定在三维调节机构20上，通过调节三维调节机构20确保针孔19位于筒镜18的焦点位置；准直透镜21用于收集通过针孔19的光能量，并将其送入光电倍增管22，由光电倍增管22输出的光强度信号，通过数据采集卡23输入计算机25。
通过二维俯仰调节机构8控制无衍射超分辨光束的传播方向，使得无衍射超分辨光束与Z轴同轴；通过一维纳米位移压电台7，控制无衍射超分辨光束在Z轴方向的位置，并在Z轴方向上，使得无衍射超分辨光束横向半高全宽小于衍射极限的部分(Zb1,Zb2)，涵盖所需三维层析成像的样品Z轴方向的范围(Zo1,Zo2)；通过二维压电扫描台10控制样品与无衍射超分辨光束的横向相对位置；利用传统显微光学模块，对样品12与无衍射超分辨光束的相对位置进行监测；在无样品的时候，仅放置玻璃载片，调节三维调节机构20，使得超衍射光束的显微成像通过针孔19；然后，通过样品二维扫描模块中的二维压电扫描台10带动样品12在Z＝Zf的XY平面内，进行逐点二维扫描。并在每个扫描点位置处，通过超分辨成像模块中的数据采集卡23，读取光电倍增管22输出的光强度信号；采用计算机25，将光电倍增管22输出的光强度信号，与之对应的扫描点坐标，绘制成二维光强度分布图，即为样品在Z＝Zf所在XY面内的二维超分辨图像；通过一维纳米位移压电台14改变显微物镜13焦点所在样品中的位置Z＝Zf，获取不同Z＝Zf位置处XY面内的二维超分辨图像，便可以获得三维层析显微图像，其在XY面的分辨率小于衍射极限。
如图2所示，给出了光路对准的示意图，显示了系统实现超分辨显微的方法。超衍射透镜5、显微物镜13、筒镜18、针孔19、准直透镜21和光电倍增管同轴，其相对位置如图2所示，其中ft、fo和fc分别为显微物镜13、筒镜18、针孔19和准直透镜21的焦距。准直激光束同轴垂直入射超衍射透镜5底部，透射光在超衍射透镜5顶部输出，在其后的空间形成无衍射超分辨光束，该光束从玻璃载片底部入射，并穿玻璃载片和玻璃载片顶部的测试样品，在样品内部形成超分辨照明(光束的半高全款小于衍射极限0.5λ/NA，NA为超衍射透镜的数值孔径)；使无衍射超分辨光束与Z轴同轴，并使无衍射超分辨光束横向半高全宽小于衍射极限的部分(Zb1,Zb2)，涵盖所需三维层析成像的样品Z轴方向的范围(Zo1,Zo2)；显微物镜焦点位于范围(Zo1,Zo2)内Z＝Zf的XY面内(二维成像扫描面)；显微物镜13收集光轴(即Z轴)上Z＝Zf位置处的光强，并通过筒镜18放大后成像于其焦点位置；针孔19位于筒镜18焦点位置，针孔直径应小于Z＝Zf位置处光束横向半高全宽FWHM的ft/fo倍；通过针孔的发散光倍准直透镜21收集，并导入光电倍增管22。
然后，通过对样品12在Z＝Zf的XY平面内，进行逐点二维扫描。并在每个扫描点位置处，通过超分辨成像模块中的数据采集卡23，读取光电倍增管22输出的光强度信号；采用计算机25，将光电倍增管22输出的光强度信号，与之对应的扫描点坐标，绘制成二维光强度分布图，即为样品在Z＝Zf所在XY面内的二维超分辨图像；通过一维纳米位移压电台14改变显微物镜13焦点所在样品中的位置Z＝Zf，获取不同Z＝Zf位置处XY面内的二维超分辨图像，便可以获得三维层析显微图像，其在XY面的分辨率小于衍射极限。
图3所示为超衍射透镜产生无衍射超分辨光束的示意图。无衍射超分辨光束产生是由超衍射透镜完成，这种超衍射透镜采用角谱压缩方法进行设计(如以下具体流程，详细参见Optics Express Vol.25,Issue 22,pp.27104-27118(2017))。
(1)设定目标参数：工作波长λ、透镜半径R、透镜焦距fs、无衍射超分辨光束长度Zb、焦斑尺寸半高全宽FWHM(实心焦斑对应的为峰值半高全宽)小于衍射极限0.5λ/NA；设定设计变量，包括辅助设计波长λ’、辅助设计焦距f’；
(2)利用目标参数，根据公式(1)、公式(2)、公式(3)，在透镜半径范围内0<r<R，通过扫描方式，改变f’和λ’，使得F(λ)＝fs，且F(R)＝fs+Zb，求解辅助设计波长λ’、辅助设计焦距f’；
d(r)＝λ0/sinθ′(r), (2)
θ′(r)＝atan(r/f′). (3)
其中，r为极坐标中的径向坐标，d为等效局域光栅，λ为工作波长；
(3)根据已获得的λ’、辅助设计焦距f’，采用最优化算法，对于入射波长为λ’、半径为R、焦距为f’的点聚焦透镜进行优化设计，对该透镜振幅分布A(r)和相位分布ψ(r)进行优化，实现焦斑尺寸为FWHM0的点聚焦，且FWHM0(0.5λ/NA)小于衍射极限；并通过采用小于辅助设计波长λ’的工作波长λ，实现对透镜透射函数傅里叶频谱相对于光场远场传播截止频率1/λ的压缩，使得原本在辅助设计波长λ’汇聚成实心焦斑的聚焦透镜，在工作波长λ下，能量沿传播光轴重新分布，形成无衍射超分辨光束，且焦斑尺寸为FWHM小于衍射极限0.5λ/NA。
如图4所示，为超衍射透镜在空气中产生的无衍射超分辨光束的理论仿真结果和实验结果，在高斯光束(圆偏振光或线偏振光)从透镜底部照明，并在透镜顶部出射端一侧焦距为f处，产生无衍射超分辨光束。图中从上往下三副图的纵坐标依次为归一化后光强度、半高全宽(单位为波长)和旁瓣比(最大旁瓣峰值与主瓣峰值强度之比)，横坐标均为以透镜出射端表面为零点、沿传播方向Z轴位置(单位为波长λ)，其中理论仿真结果用点线表示，实验结果用实线表示；两者的所示的工作距离均为220λ，传播长度大于120λ，其中光束横向半高全宽小于超衍射判据(0.5λ/NA)的长度为100λ、小于超振荡判据(0.38λ/NA)的长度为70λ；以上两种情形下，对应的旁瓣均小于0.3。
如图5所示，是超衍射透镜所产生的无衍射超分辨光束在穿透玻璃载片(厚度为175μm)后，产生的产生无衍射超分辨光束。图中从上往下三副图的纵坐标依次为归一化后光强度、半高全宽(单位为波长)和旁瓣比(最大旁瓣峰值与主瓣峰值强度之比)，横坐标均为以玻璃载片出射端表面为零点、沿传播方向Z轴位置(单位为波长λ)。传播长度大于160λ，其中光束横向半高全宽小于超衍射判据(0.5λ/NA)的长度为120λ、小于超振荡判据(0.38λ/NA)的长度为60λ；以上两种情形下，对应的旁瓣均小于0.4。由图中可以看出，与图4相比，经过玻璃载片后光束长度增长，超衍射长度达120λ，超振荡长度达到60λ，而且光针超振荡区域的强度明显增加，半高全宽值仍较为稳定。综上所述，本发明所述的无衍射超分辨光束焦深长、穿透性强，可为显微系统提供稳定照明。
如图6所示，是相干光照明情况下物镜和照明透镜的半高全宽与系统分辨率的关系图。图中纵坐标为物镜点扩散函数的半高全宽，单位为波长λ，横坐标为照明用超衍射透镜产生的无衍射超分辨光束横向半高全宽，单位为波长λ，等高线为系统分辨率(即系统可分辨的振幅型光栅最小线宽，成像条纹对比度优于11％)，单位为波长λ。如：当物镜点扩散函数半高全宽为0.6λ和无衍射超分辨光束横向(对样品照明的部分)的半高全宽均为0.38λ时，系统分辨率的可以达到0.25～0.26λ；当物镜(可以采用单点聚焦超衍射透镜)点扩散函数半高全宽和无衍射超分辨光束横向(对样品照明的部分)的半高全宽均为0.35λ时，系统分辨率的可以由于λ/5。
本发明在传统的显微系统的基础上，使用超衍射透镜产生无衍射超分辨光束，利用无衍射超分辨光束的超强穿透性，透过玻璃载片，对放在玻璃载片的样品进行超分辨照明，通过二维扫描实现非标记远场超分辨二维显微成像；并通过对不同轴向位置的物面进行非标记远场超分辨二维显微成像，获取样品不同横截面的超分辨二维显微成像，进而实现三维层析。由于无衍射超分辨光束的超强穿透性，可以透过玻璃载片，从而无需从样品一侧进行照明(从玻璃载片出射)，因此，显微物镜可以采用工作距离较短的大数值孔径、高放大倍率显微物镜，从而极大压缩显微物镜点扩散函数半高全宽，进而提高系统的整体分辨率。

Claims (6)

1.一种基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统，其包括沿光路布置的无衍射超分辨光束照明模块、样品二维扫描模块、显微光学模块、超分辨成像模块；其特征在于：
所述无衍射超分辨光束照明模块用于产生无衍射超分辨光束，其包括激光器（1）、光纤耦合器（2）、光纤（3）、光纤准直器（4）、超衍射透镜（5）；光纤耦合器（2）和光纤准直器（4）分别与光纤（3）两端连接，激光器（1）输出波长为λ的激光束，通过光纤耦合器（2）耦合进入光纤（3），并由光纤（3）输出端的光纤准直器（4）进行准直输出；所输出的准直激光束，同轴垂直入射超衍射透镜（5）底部，透射光在超衍射透镜（5）顶部输出，在其后的空间形成无衍射超分辨光束；
所述样品二维扫描模块，用于在扫描成像过程中对样品在XY平面内位置进行控制；其包括二维压电扫描台（10）、玻璃载片（11）；玻璃载片（11）用于安放样品（12），玻璃载片（11）安装在二维压电扫描台（10）上；
所述显微光学模块，用于获取光束的无衍射超分辨光束光强分布、样品的光学显微图像和无衍射超分辨光束与样品的相对位置；其包括显微物镜（13）、一维纳米位移压电台2（14）、分束器（15）、筒镜1（16）和数字相机（17），构成一个衍射受限的传统无限远光学显微镜；所述显微物镜（13）固定在一维纳米位移压电台2（14）上，两者沿Z轴方向放置，并与Z轴同轴；筒镜1（16）光轴沿Y方向；分束器（15） 用于将传统无限远光学显微镜的光轴由Z方向转换到Y方向；
所述超分辨成像模块，用于收集超分辨光学信号，并结合样品二维扫描模块，实现给定Z轴位置的平面内的二维超分辨显微扫描成像，并实现三维扫描层析成像；其包括所述显微物镜（13）、所述一维纳米位移压电台2（14）、所述分束器（15）、筒镜2（18）、针孔（19）、三维调节机构（20）、准直透镜（21）、光电倍增管（22）、数据采集卡（23）、一维位移调节机构（24）和计算机（25）；显微物镜（13）、一维纳米位移压电台2（14）、分束器（15）、筒镜2（18）、针孔（19）、三维调节机构（20）、准直透镜（21）、光电倍增管（22）依次沿Z轴同轴放置；所述显微物镜（13）固定在一维纳米位移压电台2（14）上，通过一维纳米位移压电台2（14），控制显微物镜（13）焦点与样品在Z轴方向的相对位置，结合样品二维扫描模块，实现对样品的三维扫描层析成像；针孔（19）位于筒镜2（18）的焦点位置，并固定在三维调节机构（20）上，通过调节三维调节机构（20）确保针孔（19）位于筒镜2（18）的焦点位置；准直透镜（21）用于收集通过针孔（19）的光能量，并将其送入光电倍增管（22），由光电倍增管（22）输出的光强度信号，通过数据采集卡（23）输入计算机（25）；传统显微光学模块和超分辨成像模块作为一个整体，安装在一维位移调节机构（24）上，由此来控制显微物镜（13）与样品二维扫描模块中样品（12）在Z方向的相对位置。
2.根据权利要求1所述的基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述超衍射透镜工作距离大于200λ，所产生的无衍射超分辨光束长度大于100λ，该光束可以从厚度大于300λ的玻璃载片底部入射，并穿玻璃载片和玻璃载片顶部的测试样品，并能在样品内部形成超分辨照明，所述光束的半高全宽小于衍射极限0.5λ/NA，其中λ为照明光的波长，NA为超衍射透镜的数值孔径。
3.根据权利要求1或2所述的基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述无衍射超分辨光束照明模块还包括五维调节机构（6）、一维纳米位移压电台1（7）、二维俯仰调节机构（8）和三维调节机构（9）；
光纤准直器（4）固定于五维调节机构（6）上；五维调节机构（6）控制光纤准直器（4）X、Y和Z水平移动及围绕X轴和Y轴的转动，以控制准直光束相对于超衍射器件的入射角度、相对三维空间位置；
超衍射透镜（5）固定在一维纳米位移压电台1（7）上；一维纳米位移压电台1（7）固定在二维俯仰调节机构（8）上；通过一维纳米位移压电台1（7）的Z轴方向移动，控制超衍射透镜（5）所产生的无衍射超分辨光束在Z轴方向的位置；通过二维俯仰调节机构（8）控制无衍射超分辨光束的传播方向，以确保无衍射超分辨光束与Z轴同轴；
五维调节机构（6）和二维俯仰调节机构（8）固定在三维调节机构（9）上，五维调节机构（6）和二维俯仰调节机构（8）依次沿Z轴方向分布；通过调节三维调节机构（9），控制无衍射超分辨光束在X、Y和Z轴方向的空间位置。
4.根据权利要求3所述的基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述显微物镜（13）包括不同放大倍数与数值孔径的显微物镜，可使用传统显微物镜或超衍射透镜。
5.根据权利要求3所述的基于无衍射超分辨光束照明的非标记远场超分辨显微系统，其特征在于，所述显微光学模块和超分辨成像模块共用显微物镜（13）、一维纳米位移压电台2（14）、分束器（15）。
6.利用权利要求1-5所述系统实现超分辨显微的方法，其特征在于，
所述方法通过激光器（1）输出波长为λ的激光束，通过光纤耦合器（2）耦合进入光纤（3），并由光纤（3）输出端的光纤准直器（4）进行准直输出；所输出的准直激光束，同轴垂直入射超衍射透镜（5）底部，透射光在超衍射透镜（5）顶部输出，在其后的空间形成无衍射超分辨光束；
无衍射超分辨光束从玻璃载片底部入射，穿过玻璃载片和玻璃载片顶部的测试样品（12），在样品内部形成超分辨照明；样品二维扫描模块在扫描成像过程中对样品在XY平面内位置进行控制，通过二维俯仰调节机构（8）控制无衍射超分辨光束的传播方向，使得无衍射超分辨光束与Z轴同轴；通过一维纳米位移压电台（7），控制无衍射超分辨光束在Z轴方向的位置，并在Z轴方向上，使得无衍射超分辨光束横向半高全宽小于衍射极限的部分（Zb1,Zb2），涵盖所需三维层析成像的样品Z轴方向的范围（Zo1,Zo2）；通过二维压电扫描台（10）控制样品与无衍射超分辨光束的横向相对位置；利用传统显微光学模块，对样品（12）与无衍射超分辨光束的相对位置进行监测；在无样品的时候，仅放置玻璃载片，调节三维调节机构（20），使得超衍射光束的显微成像通过针孔（19）；然后，通过样品二维扫描模块中的二维压电扫描台（10）带动样品（12）在Z=Z f 的XY平面内，进行逐点二维扫描；并在每个扫描点位置处，通过超分辨成像模块中的数据采集卡（23），读取光电倍增管（22）输出的光强度信号；采用计算机（25）将光电倍增管（22）输出的光强度信号，与之对应的扫描点坐标，绘制成二维光强度分布图，即为样品在Z=Z f 所在XY面内的二维超分辨图像；通过一维纳米位移压电台（14）改变显微物镜（13）焦点所在样品中的位置Z=Z f ，获取不同Z=Z f 位置处XY面内的二维超分辨图像，便可以获得三维层析显微图像，其在XY面的分辨率小于衍射极限。
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