CN204389528U - 基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及基于微透镜修饰扫描探针的光学动态成像系统，包括扫描探针显微镜和微透镜；所述扫描探针显微镜的探针上设有微透镜，扫描探针显微镜的纳米定位机构上设有样品台，扫描探针显微镜的光学显微镜位于探针以及样品台上方。本实用新型能够实现光学超分辨率动态观测成像，并且有效解决扫描探针类显微镜在扫描成像初期对纳米物体进行视觉观测定位问题，以及纳米操作时的实时视觉反馈问题，从而提高纳米观测和纳米操作的效率。

Description

基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统

技术领域

本实用新型涉及一种基于微透镜的超分辨率光学显微和扫描探针显微融合技术的系统，具体地说是利用微透镜和带有扫描探针反馈控制机制的显微镜实现超分辨率动态光学显微观测成像，并可以实现宏、微、纳无缝观测，以及具有实时视觉反馈的纳米操作。主要用于需要纳米级超分辨率实时动态观测和操作领域，包括材料、生命科学等各个领域。

背景技术

19世纪末，德国科学家恩斯特·阿贝对光学显微镜的分辨率做出了界定，认为是光波长的一半，即约为0.2微米，这就是著名的光学衍射极限。20世纪的绝大多数时间里，科学家们都相信光学显微成像技术将永远无法突破衍射极限的限制。但是随着科学研究的深入，特别是在生物科学领域，人们早已开始了对细胞内部结构的研究，因此需要对细胞内部的组织结构进行活体观测。电子显微镜只能观测细胞干燥的死亡细胞表面，不能观测活体细胞内部结构。近些年来，基于不同原理的光学超分辨率显微镜被提出，常见的包括：4pi显微镜，I⁵M显微镜，受激发射损耗显微镜和扫描近场光学显微镜，但是这些显微镜在使用过程中具有一些共同的限制：1)逐点扫描，效率低；2)不能实时成像；3)大多只能用于荧光成像；4)有些需要复杂的后续图像处理等。

基于扫描探针类显微镜(原子力显微镜，扫描隧道显微镜，扫描离子电导显微镜)自诞生以来因其纳米级分辨率就获得了广泛的关注和发展，但是因其扫描范围小和成像速度慢，并且在观测之前无法对纳米尺度物体进行视觉定位，在纳米操作过程中无法进行视觉反馈，因此在一定程度上限制了其更广泛的应用。

实用新型内容

针对现有技术的上述不足之处，本实用新型的目的是提供基于微透镜的光学超分辨率动态成像系统，从而实现超高分辨率动态光学显微成像；解决扫描探针类显微镜的视觉定位观测和对纳米操作目标进行操作时实时视觉反馈问题。

本实用新型为实现上述目的所采用的技术方案是：基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，包括扫描探针显微镜和微透镜；所述扫描探针显微镜的探针上设有微透镜，扫描探针显微镜的纳米定位机构上设有样品台，扫描探针显微镜的光学显微镜位于探针以及样品台上方。

所述微透镜设置于探针末端。

所述微透镜最底端位置低于探针针尖位置，或者高于探针针尖位置的距离小于1微米。

所述扫描探针显微镜中光学显微镜的物镜放大倍数大于等于20倍。

所述扫描探针显微镜采用原子力显微镜，原子力显微镜中光学显微镜的物镜和镜筒间设有光路结构。

所述光路结构为反射镜或分束器。

所述光路结构还包括偏振分束器、四分之一波片；所述偏振分束器、四分之一波片依次设于反射镜或分束器与激光器之间。

所述光路结构还包括凸透镜，凸透镜设置于偏振分束器与四象限光电传感器之间。

本实用新型具有以下有益效果及优点：

1、本实用新型采用微透镜打破了光学衍射极限，在自然光照条件下，利用普通光学显微镜就能实现纳米级的分辨率，为实现活体细胞内部纳米结构的观测研究提供了有效技术手段，并且将扫描探针技术和微透镜显微技术相融合还能实现超分辨率动态光学显微成像，为扫描探针显微镜提供视觉定位观测和实时视觉反馈纳米操作，拓展扫描探针显微镜的纳米观测成像及纳米操作能力。

2、构建基于光学显微镜成像、基于微透镜的超分辨率成像和扫描探针类显微镜成像的宏、微、纳无缝观测。针对待观测的纳米尺度目标，可以先利用光学显微镜锁定待观测目标的大致位置，再利用微透镜进行超分辨率动态观测成像，实现观测目标的初步定位，最后利用扫描探针类显微镜探针进行精细扫描观测成像，从而实现宏、微、纳无缝定位观测。

3、本实用新型可以有效解决扫描探针类显微镜在扫描成像初期对纳米物体进行视觉观测定位问题，以及纳米操作时的实时视觉反馈问题，提高纳米观测和纳米操作的效率和成功率。

4、在对纳米操作对象进行实时成像时无需额外对样品进行修饰，因而不局限于荧光成像，成像范围不受待观测物体的自身属性限制。

附图说明

图1为本实用新型的系统结构原理示意图；

图2为基于原子力显微镜的微球超分辨率光学成像系统结构原理图；

图3为微透镜远离样品时在光学显微镜下的图像；

图4为栅格(宽150nm，间距150nm，高度为15nm)超分辨率光学图像；

其中1是扫描探针显微镜，2是探针，3是微透镜，4是光学显微镜，5是样品台，6是纳米定位机构，7是微动机构；8是激光器，9是激光，10是偏振分束器，11是四分之一波片，12是反射镜或分束器，13是物镜，14是镜筒，15是相机，16是凸透镜，17是四象限光电传感器，18是控制器，19是计算机，20是光路结构。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本实用新型做进一步的详细说明。

本实用新型将微透镜超分辨率显微镜技术与扫描探针类显微镜技术进行有效融合，实现新的纳米观测成像系统，其实现方法如下。

首先利用微透镜对扫描探针类显微镜的探针(如原子力显微镜的探针、扫描离子电导显微镜的毛细管以及扫描隧道显微镜)进行修饰，即将微透镜固定于探针的合适位置。其次，根据扫描探针显微镜技术和微透镜显微成像技术构建微球超分辨率光学成像系统。然后将微透镜修饰后的探针固定于超分辨率观测系统上进行扫描，根据扫描探针显微镜的反馈控制机理实现探针与样品的距离控制，并对样品表面进行动态扫描。最后利用扫描探针类显微镜自带的光学显微镜相机对微透镜显示的超分辨率图像进行实时数据采集成像，就可以获得动态的超分辨率视觉图像。

系统结构设计如图1～2所示。主要包括探针2，微透镜3，样品台5，纳米定位机构6，微动机构7，激光器8，激光9，偏振分束器10，四分之一波片11，反射镜或分束器12，物镜13，镜筒14，相机15，凸透镜16，四象限光电传感器17，控制器18，计算机19。

其中纳米定位机构6可以是纳米定位平台，也可以是具有纳米定位能力的压电陶瓷管，以及其它具有纳米定位能力的运动机构。纳米定位机构6至少要有竖直方向(Z方向)的位置定位能力。

其中微动机构7是具有微米或亚微米定位能力的大范围运动平台，运动范围一般在10mm以上。根据系统的设计结构，微动机构7可以是一个三维的微动机构；微动机构7也可以是一个二维(X、Y方向)的运动机构，第三维(Z方向)用于固定光学显微镜。

其中带扫描的样品要置于样品台上，样品台5置于三维纳米运动机构6上，三维纳米运动机构6置于微动机构7上。这样的机构保证了在动态扫描成像时，光学显微镜物镜和探针的相对位置固定不变，实现微透镜超分辨率稳定成像。原子力显微镜一个重要的组成部分就是光路系统的设计。相对于传统原子力显微镜所要求的10倍或20倍物镜，微透镜成像要求40倍以上的高倍物镜，因此光学显微镜工作距离短，并且还要满足一定的光杠杆放大倍数。考虑到这些要求，本实用新型设计了一套有效的激光光路，如图2所示框图20内所示的部分。在原子力显微镜中光学显微镜4的物镜13和镜筒14间设有光路结构。光路结构包括偏振分束器10、四分之一波片11、反射镜或分束器12、凸透镜16；激光器8、偏振分束器10、四分之一波片11、反射镜或分束器12依次设置，反射镜或分束器12设于物镜13和镜筒14之间；偏振分束器10的竖直方向上依次设有凸透镜16、四象限光电传感器17，四象限光电传感器17与控制器18连接。偏振分束器10内的分束面和反射镜或分束器12镜面平行。反射镜或分束器12的输出光路的光轴垂直于样品台平面。

其中激光器8是红光激光器，激光器所发射的激光9经过偏振分束器10后只剩平行偏振激光，平行偏振光经过四分之一波片11后转换成圆偏振光，此后圆偏振光依次经过反射镜或分束器12和物镜13聚焦到探针2的悬臂梁反射面上后反射的激光依次经过物镜13和反射镜或分束器12，再次经过四分之一波片11后转换成了垂直偏振光，这时垂直偏振光经过偏振分束器10的反射后经过凸透镜16投射到四象限光电传感器17上。镜筒14采用无限共轭镜筒，相机15采集到微透镜所呈现的光学图像。反射镜12采用红光反射镜。

扫描探针显微镜1的控制器18功能和传统原子力显微镜一样，用于四象限光电传感器17的信号处理、系统控制、纳米定位机构6和微动机构7的运动控制等，计算机19用于系统监控、相机15的视觉图像显示及探针扫描数据的图形显示等功能。

本系统的微透镜与普通光学显微镜组合能够打破光学衍射极限，实现超分辨率光学成像。将微透镜超分辨率光学显微技术与扫描探针显微镜技术实现有效融合，利用微透镜对扫描探针类显微镜的探针(如原子力显微镜的探针、扫描离子电导显微镜的毛细管)进行修饰，通过扫描探针类显微镜的反馈控制机制实现微透镜与样品的距离控制，通过控制扫描探针类显微镜的扫描机制使微透镜与样品产生相对运动，实现动态观测成像。另外，微透镜超分辨率光学显微技术与扫描探针显微镜技术实现有效融合，将实现宏、微、纳无缝观测，及具有实时视觉反馈的纳米操作。

超分辨率成像是指打破光学衍射极限，所使用的微透镜具有超分辨能力。

微透镜对扫描探针类显微镜的探针进行修饰是指将微透镜固定于扫描探针类显微镜探针合适位置上。

微透镜与样品的距离控制是指微透镜能够跟踪样品表面形貌的高低起伏，使微透镜与样品表面始终保持固定距离。具体可采用扫描探针类显微镜探针与样品的距离反馈控制原理来实现。

动态观测成像是指在扫描探针类显微镜在扫描过程中，可利用微透镜光学超分辨能力，实现实时视觉观测与成像。

纳米操作时的实时视觉反馈，是指在利用扫描探针对纳米尺度物体进行操作的同时，利用微透镜对纳米操作的结果进行实时观测成像，以随时判断操作的结果是否正确。

本实用新型具体实现方法为：

(1)以扫描探针类显微镜(如原子力显微镜、扫描隧道显微镜和扫描离子电导显微镜)技术为核心构建微透镜超分辨率光学成像系统。并充分考虑到微透镜超分辨率成像的特殊要求，例如，系统中的光学显微镜部分要求应用高放大倍率(如20倍，40倍，50倍，100倍等)物镜；另外，在动态观测成像时，微透镜和物镜的相对位置要固定不变。

(2)所使用微透镜的材料、尺寸和形状与观测环境相关，比如在空气中时，可采用2微米至9微米二氧化硅微透镜或30微米至300微米聚苯乙烯微透镜等；在液体中时，可采用2微米至300微米，折射率为1.8～2.2的微透镜，如钛酸钡玻璃微透镜等能够实现超分辨率观测的微透镜。

(3)制备微透镜修饰的扫描探针类显微镜探针(包括原子力显微镜的扫描探针、扫描隧道显微镜探针和扫描离子电导显微镜毛细管探针)，可利用特定的方法(如粘结剂)将微透镜固定在扫描探针类显微镜探针上靠近探针针尖处，完成微透镜修饰探针制备。另外也可以通过制备满足特定扫描探针类显微镜功能要求的一体式微透镜探针来实现超分辨率动态观测成像。

(4)微透镜光学超分辨率图像获取方法。调整微透镜和探针位置到光学显微镜的视野内，并调整到最清晰的位置，如图3所示；将样品置于样品台上，利用扫描探针显微镜使探针接触样品表面，再通过扫描探针类显微镜的间距反馈控制机制使微透镜与样品轻微接触或保持间距在纳米至微米尺度。最后从相机获取的视觉图像观察微透镜内是否有清晰的纳米尺度形貌图像，如果没有，则需要对显微镜进行重新调节，将光学显微镜的工作平面聚焦到微透镜的像平面，从而获得清晰图像。图4是利用上述方法获得的栅格(宽150nm，间距150nm，高度为15nm)超分辨率光学图像。

(5)实时动态成像，即实现高速超分辨率扫描显微术。此过程建立在(4)所描述的基础之上，并通过利用扫描探针类显微镜的位置调控方法在扫描过程中对微透镜的空间位置进行有效的控制，从而保证在扫描过程中微透镜的超分辨率动态成像。

(6)宏、微、纳无缝观测方法:针对待观测的纳米尺度目标，可以先利用光学显微镜锁定待观测目标的大致位置，进而利用微透镜进行大范围的超分辨率动态观测成像，实现观测目标的初步定位，最后利用扫描探针类显微镜探针进行精细扫描观测成像，实现宏、微、纳无缝定位观测。

(7)纳米操作过程中的实时视觉反馈，此过程建立在(4)和(5)的基础之上，利用扫描探针类显微镜对纳米尺度目标进行操作，通过微透镜的实时成像实现基于扫描探针类显微镜的实时视觉反馈操作。

实施例一

以微透镜显微技术和原子力显微镜技术相结合构建超分辨率光学成像系统为例说明具体实现过程。

微透镜修饰探针方法：

1)利用程控激光拉制仪(例如P2000/G，Sutter Instrument公司)制备具有锥形尖端的毛细玻璃管，尖端直径约8微米。毛细玻璃管通过软管与注射器相连，并固定于微纳XYZ三维移动平台。

2)用固定好的毛细管吸取微量紫外固化胶NOA63，通过三维移动平台控制毛细管尖端移动到固定在探针夹上的原子力显微镜探针悬臂梁前端，并释放少量NOA63至悬臂梁前端。

3)取适量70微米左右钛酸钡玻璃微透镜并均匀分散在洁净的基底表面。控制沾有NOA63的毛细管尖端移动到微透镜附近，并粘取单个微透镜于毛细管尖端。通过控制毛细管的移动，将该微透镜移动到沾有NOA63的探针悬臂梁上，使微透镜接触悬臂梁前端带有NOA63区域。快速移动毛细管远离悬臂梁，从而使微透镜固定在悬臂梁前端，固定的位置要保证微透镜不挡住激光光路。另外，探针的针尖位置可以高于微透镜最底端位置，但是不能低于微透镜最底端一个光波长距离，以保证微球最低端与样品表面保持一个波长的距离范围内。

4)取一功率为100W的卤素灯至于带有微透镜的原子力扫描显微镜探针上方约1米处，进行照射。照射时间为20分钟。然后将探针翻转再照射20分钟，实现NOA63的完全固化，将微透镜固定在探针前端，从而实现微透镜修饰的原子力扫描显微镜探针的制备，如图3所示。

微透镜光学超分辨率图像获取方法：调整微透镜和探针位置到光学显微镜的视野内，并调整到最清晰的位置，如图3所示。将样品置于样品台上，利用普通原子力显微镜的探针，通过相继调整微动机构7和纳米定位机构6的Z向位置，使得样品逐渐逼近探针，并通过原子力显微镜的探针和样品的间距反馈控制机制使微透镜与样品轻微接触或保持间距在纳米至微米尺度，这时通过相机15观测微透镜内是否有清晰的纳米尺度形貌图像，如果没有，则需要对显微镜进行重新调节，将光学显微镜的工作平面聚焦到微透镜的像平面，从而获得清晰图像。具体为实时监视PSD信号和微透镜的中心区域；当PSD信号发生明显变化或微透镜中心区域出现清晰图像时，表示微透镜与样品表面已相互接触或距离已减小到微米或纳米尺度；如果在PSD信号发生明显变化但是微透镜中心区域无图像或者图像不清晰时，重新调节显微镜，将显微镜的共组平面聚焦到微透镜的像平面，从而实现实时清晰成像。图4是利用上述方法获得的栅格(宽150nm，间距150nm，高度为15nm)超分辨率光学图像。

超分辨率动态成像方法：利用原子力显微镜的反馈控制机制实现微透镜与样品的距离控制，具体是通过反馈调节纳米定位机构6的Z向位置来实现。通过控制纳米定位机构6的X、Y方向或者控制微动机构7的X、Y方向运动轨迹，来实现运动轨迹线上样品表面形貌的超分辨率实时动态观测。

宏、微、纳无缝观测方法:针对待观测的纳米尺度目标，可以先利用光学显微镜锁定待观测目标的大致位置，进而利用微透镜进行大范围的超分辨率动态观测成像，实现观测目标的初步定位，最后利用扫描探针类显微镜探针进行精细扫描观测成像，实现宏、微、纳无缝定位观测。

实时视觉反馈纳米操作方法:在传统原子力显微镜下，利用探针针尖可以对纳米尺度物体进行推、拉、刻、划、搬运等纳米操作，由于没有实时视觉反馈，操作过程不可见，因而操作结果不可控，效率低。通过本实用新型，在利用针尖操作后，可以利用微透镜实时观测探针针尖操作结果，提高了操作效率和可靠性。

Claims (8)

1.基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，其特征在于：包括扫描探针显微镜(1)和微透镜(3)；所述扫描探针显微镜(1)的探针(2)上设有微透镜(3)，扫描探针显微镜(1)的纳米定位机构(6)上设有样品台(5)，扫描探针显微镜(1)的光学显微镜(4)位于探针(2)以及样品台上方。

2.根据权利要求1所述的基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，其特征在于所述微透镜(3)设置于探针(2)末端。

3.根据权利要求1所述的基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，其特征在于所述微透镜(3)最底端位置低于探针针尖位置，或者高于探针针尖位置的距离小于1微米。

4.根据权利要求1所述的基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，其特征在于所述扫描探针显微镜(1)中光学显微镜(4)的物镜放大倍数大于等于20倍。

5.根据权利要求1所述的基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，其特征在于所述扫描探针显微镜(1)采用原子力显微镜，原子力显微镜中光学显微镜(4)的物镜(13)和镜筒(14)间设有光路结构。

6.根据权利要求5所述的基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，其特征在于所述光路结构为反射镜或分束器(12)。

7.根据权利要求6所述的基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，其特征在于所述光路结构还包括偏振分束器(10)、四分之一波片(11)；所述偏振分束器(10)、四分之一波片(11)依次设于反射镜或分束器(12)与激光器(8)之间。

8.根据权利要求7所述的基于微透镜修饰探针的光学超分辨率动态成像系统，其特征在于所述光路结构还包括凸透镜(16)，凸透镜(16)设置于偏振分束器(10)与四象限光电传感器(17)之间。