CN113701666B - 基于光子芯片的超分辨显微成像系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是基于光子芯片的超分辨显微成像系统。其特征是:该系统由成像光源1、捕获光源2、光纤耦合器3、光功率与相位控制模块4、光子芯片5和显微成像系统6组成,其中光子芯片5由基底501、掩埋式成像光波导502和非嵌入式捕获光波导503构成。本发明将超分辨显微成像与光镊、光学输运技术集成到了一块光子芯片当中,实现了对微纳粒子在超分辨显微观测下的捕获与操纵,使细胞观测的更加清晰,使操纵变得更加准确。本发明相对于传统的超分辨显微成像器件更加集成化、微小化、稳定化,具有广泛的应用前景与实用性。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是基于光子芯片的超分辨显微成像系统,主要涉及光子学与超分辨显微技术领域,更具体地,涉及一种可以实现对微纳粒子等在超分辨显微成像下的光学输运及捕获的方法与装置。
(二)背景技术
自大约400年前胡克发现细胞以来,光学显微镜一直是生物学发现的终极工具。然而,在传统的宽场显微镜中能够光学分辨的最小尺寸受到衍射极限的限制,仅能达到半个波长量级左右。在过去的20年中发展起来的超分辨显微技术,突破了衍射极限以更加惊人的细节揭示了生命的过程。近20年来发展的一些突破分辨率衍射极限的超分辨成像技术,如结构光照明显微镜(structured illum ination microscopy,SIM)、受激发射损耗显微(STED)技术、光激活定位显微术(PALM)、随机光学重构显微镜(stochastic opticalreconstruction microscopy,ST ORM)等。
其中SIM是一种超分辨率显微镜技术,以其独特的活体成像能力在生物研究中获得了广泛的应用,例如参见文献(中国光学,2018,11(3):307-328)。其超分辨原理是通过在结构化照明条纹图案的空间频率和荧光标记的样本结构的空间频率之间的频率混合(莫尔干涉效应)来扩展分辨率。太高而无法被显微镜物镜捕获的空间频率(超过衍射极限)被向下转换为可以被物镜捕获的较低频率(莫尔条纹)。SIM将分辨率的提高,使我们能够将活细胞和组织中的生物结构可视化到100nm以内。
2000年,Gustafasson教授等人(Journal of microscopy,2000,198(2):82-87.)提出的经典二维SIM技术仍然延续至今,该超分辨显微成像技术可以提高进两倍的横向分辨率。虽然该技术拥有良好的分辨率,但是由于现有的SIM普遍采用条纹结构光,基于条纹结构光照明的SIM在成像过程中不仅需要对条纹进行平移、旋转,还需要在切换过程中对光束的偏振态进行快速、精密的控制,从而大大增加了系统的搭建成本,系统也相对比较复杂,例如专利(CN102096180B)提出了一种由复杂的空间光学系统搭建而成的超分辨率显微镜。
自1986年A,Ashkin等人发现单独一束强聚焦的激光束形成的光学势阱可以吸引微粒将其局限在焦点附近以来,光镊由此诞生,由于使用光镊来捕获操纵微纳粒子具有非接触性、无机械损伤等优点,这使得光镊在生物学领域表现出了突出的优势。由于传统显微镜受到衍射极限的限制,光镊操纵的可视化微纳粒子尺寸受到限制。将SIM技术与光镊技术进行结合,使得光镊的优势进一步得到提升,让这只镊子操纵更加准确,为现代生物医学提供了强有力的工具。但在传统SIM显微镜中,照明和收集光路是耦合的,这限制了分辨率,并妨碍了低数值孔径物镜用于大面积成像。另外,通常使用自由空间光学元件生成驻波干涉条纹,元件用于控制和维持图案的方向、相位和偏振状态。因此产生的SIM显微镜体积庞大、价格昂贵、容易错位、并且需要高素质的人员进行维护,又进一步增加了维护成本。参照集成电路可以将复杂的电子元件集成到很小的一块电子芯片中,能否构造一个光子芯片,让复杂的SIM系统集成到上面,可以很好的解决传统SIM系统存在的一系列问题,例如有研究者提出了一种基于光子芯片的二维SIM方法(Nature Photonics,2020,14(7):431-438.)。如果将SIM系统与光镊系统集成到一块简易光子芯片上,这不仅可以降低成本而且还可以减小体积以便于在更小的环境下对微纳粒子进行操纵,这将有助于我们在生物医学领域的研究。
(三)发明内容
针对当前技术的缺陷,本发明的目的在于提供一种基于光子芯片的超分辨显微成像系统。该装置主要是由两个部分组成,SIM系统与光镊系统,前者主要是为整个装置提供超分辨显微成像的结构化照明条纹再通过显微成像系统将分辨率提高的像呈现出来,后者在超分辨成像的环境下对微纳粒子的更微小部分进行捕获操控,以实现对更微小的微纳粒子的分析。由于二者集成在了一个芯片上,装置的稳定性得以提升并且降低了成本,使整个装置更加微型化和集成化。
本发明的目的是这样实现的:
基于光子芯片的超分辨显微成像系统是由一个成像光源1、一个捕获光源2、两个光纤耦合器3、四个光功率与相位控制模块4、一个光子芯片5和一个显微成像系统6组成,其中光子芯片5由一个基底501、一个掩埋式成像光波导502和一个非嵌入式捕获光波导503构成,而非嵌入式捕获光波导503被一个空气间隙504分割成两部分。
成像光源1和捕获光源2输出的光波被光纤耦合器3分路后分别注入到掩埋式成像光波导502和非嵌入式捕获光波导503的两端,从而在这两个波导中分别形成相向传输光波7和8;一方面,微纳粒子9会被掩埋式成像光波导502表面的倏逝场二维光捕获,通过光功率与相位控制模块4的调节,实现微纳粒子9沿着掩埋式成像光波导502表面输运,当微纳粒子9输运到空气间隙504时,由于非嵌入式捕获光波导503传输的相向传输光波8输出到空气间隙504中形成相向捕获光场10,相向捕获光场10可实现对微纳粒子9的三维光捕获,因此微纳粒子9被稳定的俘获在空气间隙504中;另一方面,在掩埋式成像光波导502中传输的相向传输光波7因光波干涉而形成超分辨成像的条纹结构照明光11,并且通过光功率与相位控制模块4的调节可实现条纹结构照明光11的移动,最终通过显微成像系统6实现对在空气间隙504中俘获的微纳粒子9的超分辨显微动态成像。
其中的掩埋式成像光波导502和非嵌入式捕获光波导503可以采用单个结构或者两个及两个以上的交叉结构,这样不仅可以使用多个分辨率进行观测,而且还可以对微纳粒子进行一个更多维度的捕获、操纵。掩埋式成像光波导502和非嵌入式捕获光波导503它们不仅仅是条形波导,还可以是脊型波导或者狭缝波导。此外,对于掩埋式成像光波导502的表面还可以增镀金属纳米膜或金属-介质复合纳米膜来激发表面等离子体波,以增强超分辨成像能力。
下面详细阐述一下该发明装置中的超分辨显微成像以及双光势阱对微纳粒子的空间捕获。
本发明在传统SIM显微镜体积庞大、价格昂贵、容易错位、维护成本高昂等这些缺点之下,提出了一个集超分辨显微成像与光镊一体的光子芯片装置,使装置的稳定性得以提升并且降低了成本,更加微型化和集成化。但究其原理与传统SIM显微镜的原理一致,主要是通过在结构化照明条纹图案的空间频率和荧光标记的样本结构的空间频率之间的频率混合(莫尔干涉效应)来扩展分辨率。
在成像光波导502中产生的干涉条纹11的周期为fs,其关系式如下所示:
其中λex是成像激光波长,nf是波导的有效折射率,θ是干涉角。另外,其分辨率Δxy由以下关系式给出:
其中NA是显微成像系统6中的成像物镜的数值孔径。由此可见,在干涉角θ取不同的值时可以获得不同的分辨率Δxy,当干涉角θ取π时可以使分辨率Δxy达到最大,因此该发明装置两路成像光成相对的方向耦合进入成像光波导502时的分辨率最大,然后再选择较大有效折射率nf的波导结构即可突破衍射极限实现超分辨显微成像,使分辨率提高几倍。
该发明装置的光镊系统采用的是两个对置的捕获光波导503,将单模光纤耦合进入的捕获激光聚焦形成两个功率可调控的捕获光场10,可以在空气间隙504处对微纳粒子9实现空间捕获与操控。其原理主要是由于光与物质相互作用的过程中具有动量的传递,并且会对物质产生表现为推力的散射力与表现为拉力的梯度力。当会聚光场作用于折射率大于周围介质的透明介质微粒时,在折射的作用下使对微粒输入与输出的动量发生变化,因为微粒满足动量守恒,从而微粒本身产生了一个动量,然后使微粒产生了一个指向光场焦点的梯度力,再加上由于微粒反射或吸收光所产生的散射力,二者共同作用于微粒,使微粒被稳定在焦点附近被捕获,相当于一个无形的镊子将微粒夹住。如果两个会聚光场共同作用于微粒,则相当于微粒被两个镊子共同夹住,由于这两个会聚光场可以根据光功率与相位控制模块4进行功率调节,所以可以看做两个力度可调的镊子对微粒进行作用,当观测的微粒在溶液中做布朗运动是即可实现对微粒在空间中的空间捕获操控。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
(1)相对于传统的SIM超分辨显微成像器件,本发明将光纤激光器输出的激光一分为二输入两根光纤,其中一路引入光纤移相器,然后两路激光一块耦合进入一个镶嵌在一块芯片基底上的简单矩形波导结构来实现SIM超分辨显微成像。不仅大大降低了成本,而且光纤的引入使光路可以任意弯折,灵活度大,光束在光纤中传输,可以有效避免外界干扰,提升了系统的稳定性,为SIM超分辨成像提供了一种全新的思路及一种简单易于实现的装置。
(2)本发明方案所采用主体器件全部为光纤以及波导器件,各器件小巧、紧凑且易于加工,极大的提高了系统集成度,降低了系统的复杂度和成本。
(3)本发明在成像波导中输运光的引入,再结合微流体通道,实现了微纳粒子由输运到捕获再到超分辨显微成像观测的一体化功能,使芯片的可实用性大大增强。
(4)本发明将SIM超分辨显微成像系统与光镊系统集成在一块光子芯片上,使装置更加集成化、微小化、稳定化,超分辨显微成像与光镊相结合,使可操纵的微纳粒子更加微小、清晰,在生物医学、微观物理等需要超分辨成像与微纳粒子研究的领域具有广泛的应用前景,并且具有较高的实用性。
(四)附图说明
图1是基于光子芯片的超分辨显微成像系统。由一个成像光源1、一个捕获光源2、两个光纤耦合器3、四个光功率与相位控制模块4、一个光子芯片5和一个显微成像系统6组成,其中光子芯片5由一个基底501、一个掩埋式成像光波导502和一个非嵌入式捕获光波导503构成,而非嵌入式捕获光波导503被一个空气间隙504分割成两部分。
图2是超分辨显成像系统的光子芯片的制备设备——纳米级三维激光直写设备示意图。由飞秒激光器201、透镜组202、振镜203、半透半反镜204、成像透镜205、CCD206、物镜207、置于三维位移台上的载玻片208、工作区域209、二维平面中不同位置的聚焦光场210、光刻胶211、LED照明灯212组成。
图3是当掩埋式成像光波导为三个交叉波导以及非嵌入式捕获光波导为单个波导时的基于光子芯片的超分辨显微成像系统。由一个用于超分辨显微成像成像的光纤激光器101、一个为光镊系统提供捕获光的光纤激光器102、一个为微纳粒子输运提供输运光的光纤激光器103、三个1×2光纤耦合器2、3与3’、两个光功率控制模块401与402、一个光纤移相器5、一个矩形基底6、三个用于产生结构化照明条纹的矩形波导701、702以及703、一个包含CCD10、成像物镜9以及透镜组的显微成像系统、两个用于产生光势阱的矩形波导1101与1102和空气间隔区域1103、一个对光功率进行调节、对光开关进行控制以及采集CCD图像的计算机12、一个光开关13、一个微流注射器14、一个微流通道15、一个微流入射管道16、一个微流出射管道17、以及多根单模光纤组成。
图4是光子芯片制备过程的示意图。图4(a)是使用纳米级三维激光直写设备在光刻胶中写出的一个矩形基底的结构示意图。图4(b)是图4(a)的基础上在同一种光刻胶中写出的预留出成像矩形波导位置的结构示意图。图4(c)是在图5(b)的基础上,在预留出成像矩形波导的位置处,在另一种光刻胶中写出成像矩形波导的结构示意图。图4(d)是使用纳米级三维激光直写设备在图4(c)结构的垂直于波导502线上,使用不同于前面两种的光刻胶写出捕获光波导503的结构示意图。
图5是不同数量和结构的掩埋式成像光波导502和非嵌入式捕获光波导503的组合结构示意图。图5(a)是由单个掩埋式成像光波导502与三个交叉非嵌入式捕获光波导503组成的结构示意图。图5(b)是由两个交叉掩埋式成像光波导502与两个交叉非嵌入式捕获光波导503组成的结构示意图。图5(c)是由三个交叉掩埋式成像光波导502与一个交叉非嵌入式捕获光波导503组成的结构示意图。
图6是不同波导类型的掩埋式成像光波导502的结构示意图。图6(a)是条型波导。图6(b)是脊型波导。图6(c)是狭缝波导。
图7是不同波导类型的非嵌入式捕获光波导503的结构示意图。图7(a)是条型波导。图7(b)是脊型波导。图7(c)是狭缝波导。
图8是不同波导类型的掩埋式成像光波导502分别在镀有金属纳米膜和金属-介质复合纳米膜的结构示意图。图8(a)是镀有金属纳米膜的条型波导。图8(b)是镀有金属纳米膜的脊型波导。图8(c)是镀有金属纳米膜的狭缝波导。图8(d)是镀有金属-介质复合纳米膜的条型波导。图8(e)是镀有金属-介质复合纳米膜的脊型波导。图8(f)是镀有金属-介质复合纳米膜的狭缝波导。
(五)具体实施方式
下面结合附图举例来进一步阐述本发明。
如图3所示,由三个交叉掩埋式成像光波导和一个非嵌入式捕获光波导构成的一个该发明的案例结构示意图。该案例结构由一个用于超分辨显微成像成像的光纤激光器101、一个为光镊系统提供捕获光的光纤激光器102、一个为微粒输运提供输运光的光纤激光器103、三个1×2光纤耦合器2、3与3’、两个光功率控制模块401与402、一个光纤移相器5、一个矩形基底6、三个用于产生结构化照明条纹的矩形波导701、702以及703、一个包含CCD10、成像物镜9以及透镜组的显微成像系统、两个用于产生光势阱的矩形波导1101与1102、一个对光功率进行调节、对光开关进行控制以及采集CCD图像的计算机12、一个光开关13、一个微流注射器14、一个微流通道15、一个微流入射管道16、一个微流出射管道17、以及多根单模光纤组成。
激光器101输出的成像光经过1×2光纤耦合器3分为成像光301和成像光302,其中成像光302中插入了一个光纤移相器5,它的作用是控制这条光路成像光的相移进而使与成像光301产生的干涉条纹801进行移动,然后在观测的物体处实现超分辨显微成像。成像光302经过光纤移相器5相位调制后进入光开关13,这里的光开关13可由计算机12控制成像光302与光纤1301、1302以及1303中的其中一路相通。作为公共成像光的成像光301由单模光纤耦合进矩形波导701当中,然后成像光302由光开关13选择输入光纤1301、1302以及1303中的其中一路,进而再耦合进矩形波导701、702以及703中对应的波导。由于这两路成像光来自同一个激光器,因此在矩形波导中会产生驻波干涉条纹,为空气间隔区域8处提供超分辨成像的条纹结构光。由于成像光的干涉角有所不同,所以当成像光302通入不同的矩形波导时,可以使在空气间隔区域8处所观测到不同的分辨率。
微流注射器14可以将含有微纳粒子的溶液通过微流入射管道16注射进微流通道15中,在微流的作用下微纳粒子会在溶液中向前流动直至到缓冲区18处,这时再由光纤激光器103输出的输运光303经过1×2光纤耦合器3’进入单模光纤最后再耦合进矩形波导701,在矩形波导的上表面形成倏逝光场进而实现对微纳粒子沿矩形波导701从左至右方向的输运,这样在缓冲区18处的微纳粒子就可以沿着矩形波导701输运到空气间隔区域8处进行捕获研究了,未被捕获以及在缓冲区18处未被输运的微纳粒子将会沿着微流出射管道17收集起来再使用。激光器102发射出的捕获光在1×2光纤耦合器2的作用下将捕获光一分为二,捕获光201与捕获光202分别经过光功率控制模块401与402,光功率控制模块401与402由计算机12直接进行调控,根据实际操纵需求来调节每个光功率控制模块使捕获光201、202达到理想的捕获功率。经过功率调控的两路捕获光经单模光纤再耦合进入矩形波导1101与1102,然后在空气间隔区域8中产生捕获微纳粒子802的光势阱803,在这里采用两路功率可调控的捕获光可以对微纳粒子进行更多维度以及姿态的控制。该装置的矩形波导701、702、703与矩形波导1101与1102是直接集成在一矩形基底6上的,只是与矩形基底6的折射率有所差别,它们一块构成集超分辨显微成像与光镊一体的光子芯片。
结合图2,简述一下纳米级三维激光直写设备的工作原理。首先飞秒激光器201输出一束可使光刻胶固化的激光,经过透镜组202进行光束整形后再入射到振镜203上,振镜通过计算机控制使其进行三维偏转进而使反射的激光绕中心进行一定角度的偏转向前继续传输,经过振镜反射的激光再经过一个半透半反镜204进入物镜207,在物镜的焦平面上形成焦点,在焦点位置处即可实现对光刻胶的固化,通过计算机对振镜进行一个规则的调制时,即可在物镜焦平面处固化形成预设的面,再将光刻胶进行一个z轴的位移即可实现三维结构的构造。另外该设备中的成像透镜205、CCD206、半透半反镜204、LED照明灯212是该设备的照明、采集系统。
基于光子芯片的超分辨显微成像系统,以图1中的超分辨显成像光子芯片为例,制备过程可分为以下三个步骤(见图4):
步骤1、光子芯片基底的制备(见图4(a)-(b))。使用纳米级三维激光直写设备在第一种光刻胶中先写出一个矩形基底的结构,如图4(a)所示,接着在其上表面再写出掩埋式成像光波导沟槽的结构,如图4(b)所示,这两个结构共同构成光子芯片的基底501;
步骤2、掩埋式成像光波导502的制备(见图4(c))。依然使用纳米级三维激光直写设备在光子芯片基底的预留沟槽位置使用第二种光刻胶光固化形成掩埋式成像光波导502,如图4(c)所示;
步骤3、非嵌入式捕获光波导503的制备(见图4(d))。将写好的掩埋式成像光波导502的光子芯片基底再放入第三种光刻胶中,在基底的上表面的中心位置处直接写入非嵌入式捕获光波导503,如图4(d)所示。
可选的,掩埋式成像光波导502和非嵌入式捕获光波导503可以是单个结构或者两个及两个以上的交叉结构,例如,由一个成像光波导502与三个交叉非嵌入式捕获光波导503组成的结构、由两个交叉掩埋式成像光波导502与两个交叉非嵌入式捕获光波导503组成的结构以及由三个交叉掩埋式成像光波导502与一个交叉非嵌入式捕获光波导503组成的结构,如图5(a)-(c)所示。
可选的,掩埋式成像光波导502可以是条形波导、脊型波导或者狭缝波导,如图6(a)-(c)所示。
可选的,非嵌入式捕获光波导503可以是条形波导、脊型波导或者狭缝波导,如图7(a)-(c)所示。
可选的,掩埋式成像光波导502的表面还可以增镀金属纳米膜12或金属-介质复合纳米膜13来激发表面等离子体波,增强超分辨成像能力,如图8(a)-(c)为在不同波导结构的掩埋式成像光波导502的表面上增镀金属纳米膜12的示意图,图8(d)-(f)为在不同波导结构的掩埋式成像光波导502的表面上增镀金属-介质复合纳米膜13的示意图。
Claims (6)
1.基于光子芯片的超分辨显微成像系统,其特征是:该系统由成像光源(1)、捕获光源(2)、光纤耦合器(3)、光功率与相位控制模块(4)、光子芯片(5)和显微成像系统(6)组成,其中光子芯片(5)由基底(501)、掩埋式成像光波导(502)和非嵌入式捕获光波导(503)构成,而非嵌入式捕获光波导(503)被空气间隙(504)分割成两部分;成像光源(1)和捕获光源(2)输出的光波被光纤耦合器(3)分路后分别注入到掩埋式成像光波导(502)和非嵌入式捕获光波导(503)的两端,从而在这两个波导中分别形成相向传输光波(7)和(8);一方面,微纳粒子(9)会被掩埋式成像光波导(502)表面的倏逝场二维光捕获,通过光功率与相位控制模块(4)的调节,实现微纳粒子(9)沿着掩埋式成像光波导(502)表面输运,当微纳粒子(9)输运到空气间隙(504)时,由于非嵌入式捕获光波导(503)传输的相向传输光波(8)输出到空气间隙(504)中形成相向捕获光场(10),相向捕获光场(10)可实现对微纳粒子(9)的三维光捕获,因此微纳粒子(9)被稳定的俘获在空气间隙(504)中;另一方面,在掩埋式成像光波导(502)中传输的相向传输光波(7)因光波干涉而形成超分辨成像的条纹结构照明光(11),并且通过光功率与相位控制模块(4)的调节可实现条纹结构照明光(11)的移动,最终通过显微成像系统(6)实现对在空气间隙(504)中俘获的微纳粒子(9)的超分辨显微动态成像。
2.根据权利要求1所述的基于光子芯片的超分辨显微成像系统,其特征是:所述的掩埋式成像光波导是单个结构或者两个及两个以上的交叉结构。
3.根据权利要求1所述的基于光子芯片的超分辨显微成像系统,其特征是:所述的非嵌入式捕获光波导是单个结构或者两个及两个以上的交叉结构。
4.根据权利要求1所述的基于光子芯片的超分辨显微成像系统,其特征是:所述的掩埋式成像光波导可以是条形波导、脊型波导或者狭缝波导的一种。
5.根据权利要求1所述的基于光子芯片的超分辨显微成像系统,其特征是:所述的非嵌入式捕获光波导可以是条形波导、脊型波导或者狭缝波导的一种。
6.根据权利要求1所述的基于光子芯片的超分辨显微成像系统,其特征是:所述的掩埋式成像光波导的表面还可以增镀金属纳米膜或金属-介质复合纳米膜来激发表面等离子体波,增强超分辨成像能力。
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