CN111103273A - 光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针 - Google Patents

光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针 Download PDF

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Abstract

本发明提供的是一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，其特征是：它由同轴双波导光纤光镊系统和级联的两个介质微球透镜组成。其中同轴双波导光纤具有一个中间芯和一个环形芯，并在光纤的纤端具有对称的圆锥台结构，反射汇聚环形芯内传输的环形捕获光束，形成捕获势阱，捕获一个微球透镜；在光纤端面的中心处刻蚀有一个凹槽，另一个微球透镜粘附于凹槽内。两个微球透镜与光纤同轴分布，中间芯传输的荧光激发光束经过两个微球透镜两级压缩后，形成突破衍射极限的超分辨纳米光学射流，可实现纳米量级的超分辨荧光照明。本发明可用于单分子荧光照明及成像，结合非接触式光纤光镊，尤其适用于活体单细胞内的大分子的荧光照明与成像。

Description

光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针
(一)技术领域
本发明涉及的是一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，可将荧光激发光束压缩，生成纳米尺寸的光学射流，突破衍射极限，实现超分辨的荧光显微照明和探测，属于纳米光子学技术领域。
(二)背景技术
现代生物医学研究中为了更好地理解人体生命的作用过程和疾病的产生机理，需要观察细胞内细胞器、病毒、寄生虫等在三维细胞空间的精确定位和分布。另一方面，后基因组时代蛋白质科学的研究也要求阐明：蛋白质结构、定位与功能的关系以及蛋白质-蛋白质之间发生相互作用的时空顺序；生物大分子，主要是结构蛋白与RNA及其复合物，如何组成细胞的基本结构体系；重要的活性因子如何调节细胞的主要生命活动，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡与细胞信号传递等。反映这些体系性质的特征尺度都在纳米量级，远远超出了常规的光学显微镜的分辨极限。
在过去的几十年中，人们一直在尝试不同的方法去克服由于阿贝衍射极限导致在光学显微成像上的限制。包括扫描近场光学显微镜、受激发射损耗显微镜、超材料超透镜显微镜、固体浸没透镜显微镜和超振荡透镜显微镜等在内的几种超分辨率光学成像技术已经成功实现。尽管他们具有很好的性能，但是其价格昂贵，前期准备时间长，探测方法繁琐。
基于微球透镜的光学纳米射流技术是通过光束照射在一个介质微球上，在微球的一端光束被压缩到小于衍射极限的尺寸的一项技术。由于被压缩光斑的束腰直径在纳米量级，所以具有纳米量级的空间分辨率，并且具有很高的能量密度。因此其在超分辨率成像(KRIVITSKY,Leonid A.,et al.Locomotion of microspheres for super-resolutionimaging.Scientific reports,2013,3:3501.)、纳米荧光增强(LECLER,Sylvain,etal.Photonic jet driven non-linear optics:example of two-photon fluorescenceenhancement by dielectric microspheres.Optics express,2007,15.8:4935-4942.)、拉曼散射增强(US2013/0308127A1)等技术领域具有广泛的应用。
由于这类光学纳米射流技术通常使用的是微米量级的标准介质球，对用光镊系统来说，这类介质微球恰好是能够稳定捕获、操纵的尺寸范围。因此结合光镊和光学纳米射流这两项技术能够实现更丰富的应用场景，尤其是在超分辨荧光照明和成像上具有广阔的应用前景。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，可实现单分子超分辨荧光照明及成像功能。
本发明的目的是这样实现的：
一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，它由同轴双波导光纤光镊系统和级联的两个介质微球透镜组成。其中同轴双波导光纤具有一个中间芯和一个环形芯，并在光纤的纤端具有对称的圆锥台结构，反射汇聚环形芯内传输的环形捕获光束，形成光镊，捕获一个微球透镜；在光纤端面的中心处刻蚀有一个凹槽，另一个微球透镜粘附于凹槽内。两个微球透镜与光纤同轴分布，中间芯传输的荧光激发光束经过两个微球透镜两级压缩后，形成突破衍射极限的超分辨纳米光学射流，可实现纳米量级的超分辨荧光照明。
所述的圆锥台结构是通过在同轴双波导光纤端经过精密抛磨加工制备得到的对称反射圆锥台结构，也可以是优化的弧形反射圆锥台结构，优化的反射圆锥台结构可使捕获光束的聚焦效果更好，实现更高的空间分辨率，以便于更稳定地捕获更小的微球透镜。
所述的凹槽的位置位于光纤端面的正中心，可以采用飞秒激光刻蚀制备，大小为能恰好放下微球透镜为宜。槽内的微球透镜通过低折射率胶水粘附，其直径大于等于同轴双波导光纤中间芯直径，小于圆锥台端面直径，其折射率大于低折射率胶水的折射率。
同轴双波导光纤的环形芯内传输的光束经过圆锥台结构反射汇聚，形成捕获势阱，非接触式捕获住微球透镜，该微球透镜的折射率大于背景环境折射率，以背景环境为水为例，所捕获微球透镜的折射率应在1.33-1.8之间。
所述的被捕获的微球透镜可以是细胞外的介质微球，也可以是放置于细胞内的介质微球，如聚苯乙烯微球、球状油滴，还可以是细胞内自身的球状生物介质，如脂肪细胞内的脂肪颗粒。
与在先技术相比，本发明至少具有以下的显著的进步与优势：
(1)由于采用的是光纤作为传光介质，相比较于空间光的荧光照明系统，显然本发明具有结构小巧，操作灵活的巨大优势。
(2)采用的是两个微球透镜组合的形式，实现了对荧光激发光束的两级压缩，实现低能量密度的大直径光束向超分辨的高能量密度纳米射流的压缩，既能保证光纤内传输的荧光激发光的能量密度低，又能充分利用光束的能量。
(3)非接触式的微球透镜捕获能够实现活体细胞内的单分子荧光照明，即在不破坏细胞的情况下，在活体细胞的内部实现纳米光学射流的生成。
(四)附图说明
图1是同轴双波导光纤的端面结构示意图。
图2是光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针的制备方法与步骤。
图3是光纤端两种反射圆锥台结构，其中(a)为精细研磨形成的对称圆锥台结构，(b)为优化的弧形对称圆锥台结构。
图4是超分辨探针的纳米光学射流的生成原理图。
图5是同轴双波导光纤的环形芯内传输短的光束经过圆锥台结构反射汇聚，形成非接触式捕获势阱的仿真结果图，该图显示的是光纤端剖面的电场模强度分布。
图6是折射率为1.6的聚苯乙烯小球在光纤轴向上不同位置处收到的光力的大小，曲线与Fz＝0的交点位置为微球的稳定捕获点。
图7是荧光激发光束在两个级联的微球透镜的压缩下，生成纳米光学射流的仿真结果图。
图8是图7中纳米光子射流的能量密度最高值处的x轴方向上的能量分布。
图9是无捕获小球情况下，只有粘附于凹槽内的微球透镜作用下，荧光激发光的压缩仿真结果图。
图10是光纤端超分辨纳米荧光显微探针用于细胞内部单分子荧光照明及成像的原理示意图。
(五)具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：探针的制备方法。
首先介绍本发明所使用的同轴双波导光纤以及探针的制备方法。
如图1所示，本发明采用的同轴双波导光纤1具有一个中间芯1-1和一个同轴分布的环形芯1-2。其中环形芯1-2用来传输捕获光束，例如波长为980nm的近红外光束，中间芯1-1用来传输荧光激发光束，如波长为532nm的绿光光束。
以图2为例，详细说明本发明提出的光纤端超分辨纳米荧光显微探针的制备方法。
步骤1：取一根同轴双波导光纤1，剥除20-30mm的涂覆层，切平光纤端面，使用飞秒激光在光纤端面的中间位置处刻蚀一个10um×10um×10um的凹槽2。
步骤2：在凹槽2内放置一颗直径为10um,折射率为1.5的微球透镜3，使用折射率为1.4的胶水固化微球透镜3，使其中心位于光纤轴线上。
步骤3：对光纤进行端面研磨，去除多余的胶块4，使光纤端面平整。
步骤4：研磨光纤端面圆锥台结构5，使光纤端面形成锥台底角为69度的圆锥台，并精密抛光，使得圆锥台斜面光滑。
步骤5：向环形芯1-2内通入980nm的捕获光束，捕获一颗直径为2um，折射率为1.65的微球透镜6，再向中间芯内通入532nm的荧光激发光，生成纳米光学射流，完成超分辨荧光显微照明探针的制备。
其中步骤4中对光纤端面进行精密研磨，形成如图3(a)所示的对称的圆锥台反射结构5，也可以采用更精密复杂的研磨方法，使圆锥台的斜面变成弧形，如图3(b)所示，这样的弧形结构5-1能使环形光束反射后的汇聚效果更好，能够更稳定地捕获1-5um直径的微球透镜。
实施例2：超分辨纳米光学射流生成实例。
如图4所示的是超分辨探针的纳米光学射流的生成原理图。图4(a)为光纤端的三维示意图，图4(b)为光纤的轴剖图，图4(c)为纳米光学射流生成处的局部放大图。其中同轴双波导光纤1端面圆锥台结构5能够反射环形的捕获光束(980nm)7，在光纤端外汇聚，形成聚捕获点，能够稳定捕获住2um的微球透镜6。中间芯1-1内传输的荧光激发光束(532nm)8经过凹槽内的微球透镜3和捕获住的微球透镜6后被压缩，形成亚波长尺度的纳米光学射流9，该射流可用于超分辨的荧光激发照明。
图5所示的是同轴双波导光纤1的环形芯1-1内传输短的光束经过圆锥台结构反射汇聚，形成非接触式捕获势阱的仿真结果图，该图显示的是光纤端剖面的电场模强度分布。可以看出在锥台底角为69度的情况下，捕获点距离光纤端面的距离为16um左右，即可以实现非接触式的微球捕获。图6所示的是折射率为1.65的微球在光纤轴向上不同位置处收到的光力的大小，曲线与Fz＝0的交点位置为微球的稳定捕获点。
图7是荧光激发光束在两个级联的微球透镜的压缩下，生成纳米光学射流的仿真结果图。图中凹槽内的微球透镜的直径为12um，折射率为1.5，采用的胶水的折射率为1.4，背景为水，折射率为1.33，被捕获微球透镜的直径为2um，折射率为1.65。由局部放大图可以看出经过两个微球透镜的压缩，荧光激发光束的空间尺寸得到了极大的压缩，能量密度得到了增强。图8是图7中纳米光子射流的能量密度最高值处的x轴方向上的能量分布，可以得到压缩后的纳米光学射流的半最大值全宽度FWHM＝0.68λ，突破了衍射极限。
作为对比，图9是无捕获小球情况下，只有粘附于凹槽内的微球透镜作用下，荧光激发光的压缩仿真结果图，得到的压缩效果并不理想，光束的空间尺度大，并且能量密度低。因此，本发明提出的通过两个级联的微球透镜，实现了十分显著的光束压缩效果，使得荧光激发光束的尺寸压缩到亚波长水平，能够实现超分辨的荧光照明，尤其适用于单分子的荧光激发照明。
实施例3：光纤端超分辨纳米荧光显微探针用于细胞内部单分子荧光照明及成像。
为了突出本发明所采用的非接触式光纤光镊的显著进步，选取细胞内部单分子荧光照明为例，进行说明。如图10所示。由同轴双波导光纤1制备而成的探针经过微操作台操纵15，能够捕获放置于载物台14上单细胞12内的微球透镜6。该微球透镜6可以是细胞内本身就具备的球形物质，例如脂肪细胞的脂肪颗粒，也可以是通过改性后，由细胞的吞噬作用，放置于细胞内的微米介质球。捕获光束捕获住微球透镜后，移动光纤探针，将微球透镜6移至待测位置处，如某一DNA分子13处。中间芯1-1通入荧光激发光束8，经过两个微球透镜的两级压缩后，生成的纳米光学射流9能对DNA分子13实现超分辨荧光激发。荧光经过物镜11收集，由相机10成像，即可实现荧光探测和成像。由此，便实现了细胞内单分子的超分辨荧光显微照明的目的，整个过程对细胞无创。

Claims (5)

1.一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，其特征是：它由同轴双波导光纤光镊系统和级联的两个介质微球透镜组成。其中同轴双波导光纤具有一个中间芯和一个环形芯，并在光纤的纤端具有对称的圆锥台结构，反射汇聚环形芯内传输的环形捕获光束，形成光镊，捕获一个微球透镜；在光纤端面的中心处刻蚀有一个凹槽，另一个微球透镜粘附于凹槽内。两个微球透镜与光纤同轴分布，中间芯传输的荧光激发光束经过两个微球透镜两级压缩后，形成突破衍射极限的超分辨纳米光学射流，可实现纳米量级的超分辨荧光照明。
2.根据权利要求1所述的一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，其特征是：所述的圆锥台结构是通过在同轴双波导光纤端经过精密抛磨加工制备得到的对称反射圆锥台结构，也可以是弧形优化的反射圆锥台结构。
3.根据权利要求1所述的一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，其特征是：所述的凹槽内的微球透镜通过低折射率胶水粘附，其直径大于等于同轴双波导光纤中间芯直径，小于圆锥台端面直径，其折射率大于低折射率胶水的折射率。
4.根据权利要求1所述的一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，其特征是：同轴双波导光纤的环形芯内传输的光束经过圆锥台结构反射汇聚，形成光镊，非接触式捕获住微球透镜，该微球透镜的折射率大于背景环境折射率。
5.根据权利要求1和权利要求4所述的一种光纤端超分辨纳米荧光显微照明探针，其特征是：所述的被捕获的微球透镜可以是细胞外的介质微球，也可以是放置于细胞内的介质微球，还可以是细胞内自身含有的球状生物介质。
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