CN106547079A - 实时三维激光荧光显微成像装置 - Google Patents

Abstract

一种实时三维激光荧光成像装置，该装置同时兼容传统明场照明显微成像工作模式。所述实时三维激光荧光成像装置根据功能主要分为激光激发模块、明场成像照明模块、数字探测模块、目镜观察模块，以及控制模块五个部分。利用空间光调制器加载角锥相位，从而在聚焦物镜后场产生高斯贝塞尔照明光场。在探测光路中，通过加入扭曲达曼光栅实现多物面同时成像，将从物镜收集的荧光通过多物面成像技术将多个轴向平面同时成像到电子增强CCD探测面上，从而实现了实时三维荧光成像。这种实时三维荧光成像技术在生物活体组织、活体细胞显微成像方面有重要的实用价值。

Description

实时三维激光荧光显微成像装置

技术领域

本发明涉及一种新型三维显微成像技术，特别是一种实时三维荧光显微成像装置。

背景技术

光学成像技术是一种非接触的无损成像技术，因而在生物活体或活体细胞等成像中有重要的应用。生物活体成像除了要求非接触无损探测之外，还要求能够得到实时动态的三维成像信息。目前，这种实时三维成像技术一般是基于振镜或压电陶瓷的空域扫描或者基于宽带光源的频域扫描实现的三维成像技术。这些动态三维成像技术都是基于扫描技术实现的动态成像，不是真正意义上的实时动态成像。1999年，英国科学家Blanchard等人【Appl.Opt.38,6692(1999)】提出了一种基于扭曲光栅的多个轴向物平面同时成像于一个像平面上的4D成像技术，该技术提供了一种真正意义上的实时三维成像技术，Blanchard等人把这种实时三维成像称为4D成像技术。然而，Blanchard等人提出的扭曲光栅最初是基于振幅型光栅设计的，因而，其主要衍射能量集中在零级，且整体能量效率非常低。随后，他们提出利用纯相位性光栅来提高整体衍射效率，同时可以改善衍射能量在0级和±1级之间的能量分布的均匀性。我们于2012年提出了扭曲达曼光栅的概念【先前技术CN201210106742】，可以实现几十个到上百个轴向物面同时成像到同一个像面上。本发明基于扭曲达曼光栅技术，提出一种实时三维激光荧光显微成像装置，该装置同时兼容传统明场照明显微成像工作模式。

发明内容

本发明基于扭曲达曼光栅多物面成像特性，提出一种实时三维激光荧光显微成像装置。通过倒置显微镜结构，从下面加入长焦深无衍射飞秒激光激发光，在荧光探测光路中加入扭曲达曼光栅实现多层物面同时成像于电子增强电荷耦合器件(EMCCD)相机的探测面上，从而实现了真正意义上的实时三维荧光显微成像。此外，通过一个可推进/退出式柱反射镜，可实现传统明场照明显微并通过目镜人眼观察和通过EMCCD探测的激光荧光显微两种工作模式的切换。

本发明的技术解决方案如下：

一种实时三维激光荧光显微成像装置，其特点在于该装置分为激光激发模块、明场成像照明模块、数字探测模块、目镜观察模块，以及控制模块五个部分：

所述的激光激发模块包括飞秒激光器，沿该飞秒激光器的激光输出的Y轴方向依次经过可调透过率的衰减片、物镜、小孔、消色差准直透镜，到达1：1分束镜，经过所述的1：1分束镜,其中50％激光经过90度反射，沿X轴负方向传播到达空间光调制器液晶面板；然后所述激光经过空间光调制器的液晶面板反射180度沿X轴方向传播，再次经所述1：1分束镜并且50％激光透过，然后依次经过偏振片、第一透镜、x方向扫描振镜、y方向扫描振镜、第二透镜、第三透镜、二向色性分光镜、平场消色差物镜、载物台，最终聚焦到样品上，所述的第一透镜和第二透镜组成共焦透镜组，第三透镜和平场消色差物镜组成另一组共焦透镜组，所述的载物台位于XYZ三维方向线型移动平台上；

所述的明场照明模块包括白光发光二极管，沿该白光发光二极管的输出光方向依次是消色差准直透镜、聚光镜和所述的样品，所述的白光发光二极管位于所述的消色差准直透镜焦点处；

所述的数字探测模块包括反射镜，在该反射镜焦点位置是一个可推进/退出的柱反射镜，当所述推进/退出的柱反射镜退出时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为荧光探测模式，此时所述的激发模块的激光照射到样品上经过二次谐波效应产生荧光，所述的荧光依次经过平场消色差物镜、二向色性分光镜，到达反射镜，所述荧光经过反射镜反射90度沿X轴方向传播，依次经过第四透镜、6位置滤光片轮组、第五透镜、可变光阑、扭曲达曼光栅，最后成像在电子增强电荷耦合元件相机的探测面上，所述的第四透镜和第五透镜组成共焦透镜组，所述的平场消色差物镜的主平面位于所述的第五透镜的前焦面上，所述的扭曲达曼光栅位于所述的第五透镜的后焦面上；

所述的目镜观察模块包括可推进/退出的柱反射镜，当可推进/退出柱反射镜推进时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为目镜观察模式，此时明场照明模块中照射到样品上的照明光经过样品依次经过平场消色差物镜、二向色性分光镜、反射镜，然后经过所述的柱反射镜反射90度沿Z轴方向传播依次经过第六透镜、转向反射棱镜和目镜，所述的可推进/退出柱反射镜的反射镜面中心位于所述的第六透镜的前焦面上；此时所述的可推进/退出柱反射镜的反射镜面的中心位于所述的第四透镜的后焦点和第五透镜(404)的前焦点上；此时所述的第四透镜和所述的第六透镜也组成一对共焦透镜组；

所述的控制模块包括工业控制计算机、空间光调制器控制器、移动平台控制器和XYZ三维方向线型移动平台，所述的工业控制计算机的输出端分别与所述的空间光调制器控制器、移动平台控制器和电子增强电荷耦合元件相机的输入端相连，所述的空间光调制器控制器的输出端与空间光调制器的液晶面板相连，所述的移动平台控制器的输出端与所述的XYZ三维方向线型移动平台的控制端相连。

所述的空间光调制器液晶面板上加载的相位分布满足角锥相位分布，即其中为空间光调制器液晶面上的极坐标，坐标原点为液晶面中心；mod(f,2π)表示对函数f取除以2π的余数；k＝2π/λ为波数；λ为工作波长；α表示经过角锥相位发散角。

所述的平场消色差聚焦物镜处产生的高斯-贝塞尔激发光束的工作距离d_w的关系式满足其中，f₃和f₄分别为第三透镜和平场消色差物镜的焦距，f₁和f₂分别为第一透镜和第二透镜的焦距，D₀为空间光调制器液晶面板上角锥相位的最大孔径；激发光所激发的荧光视场半径约为k＝2π/λ为波数，λ为工作波长；轴向焦深范围可以表示为其中τ为经过平场消色差物镜之后的光锥发散角，可以表示为此外，加载到空间光调制器上的角锥相位发散角α满足，其中D_obj为平场消色差物镜的通光孔径。

所述的飞秒激光器的中心波长在范围690～1020纳米内可调谐，且通过物镜和准直透镜之后入射到空间光调制器液晶面板上的光束为高斯分布。

所述的6位置滤光片轮组包含6个波段的荧光滤光片，中心波长分别对应450纳米、480纳米、510纳米、530纳米、570纳米，和610纳米，带宽均为正负10纳米。

所述的载物台装载在一个XYZ三个方向可移动的三维移动平台上，且XYZ三维线型移动平台在三个维度上都装有绝对式光栅尺，可以实现由多个子视场拼接成一幅大视场图像。

所述的转向反射棱镜的第一反射面是镀有一层银镜反射膜，第二反射面即入射面和出射面都镀有400～760宽带减反膜，且偏转角度θ满足关系式其中θ_th＝arcsin(1/n)，n为转向反射棱镜材料折射率。

本发明的技术效果如下：

本发明实时三维激光荧光显微成像装置，可实现生物样品的三维实时荧光显微成像。同时，该成像装置还兼容传统明场照明成像工作模式。

附图说明

图1是本发明实时三维激光荧光显微成像装置的原理示意图：

101—飞秒激光器；102—可调透过率的衰减片；103—物镜；104—小孔；105—消色差准直透镜；106—1：1分束镜；107—空间光调制器液晶面板；108—偏振片；109—第一透镜；110—x方向扫描振镜；111—y方向扫描振镜；112—第二透镜；113—第三透镜；114—二向色性分光镜；115—平场消色差物镜；116—载物台；117—样品；201—白光发光二极管；202—消色差准直透镜；203—聚光镜；401—反射镜；402—第四透镜；403—6位置滤光片轮组；404—第五透镜；405—可变光阑；406—扭曲达曼光栅；407—电子增强电荷耦合元件相机(EMCCD)；301—可推进/退出柱反射镜；302—第六透镜；303—转向反射棱镜；304—目镜。

图2是高斯贝塞尔光束工作距离几何关系示意图。

图3是工作距离d_w随角锥相位发散角(单位度)的变换曲线。

图4是平场消色差物镜聚焦的激发光斑半径R随角锥相位发散角(单位度)的变换曲线。

图5是激发光斑的焦深DOF随角锥相位发散角(单位度)的变换曲线。

具体实施方式

请参阅图1，图1是本发明实时三维激光荧光显微成像装置的原理示意图，由图可见，本发明实时三维激光荧光显微装置主要分为激光激发模块、明场成像照明模块、数字探测模块、目镜观察模块，以及控制模块五个模块：

所述的激光激发模块所采用的飞秒激光器101，包含光学参量振荡器，其输出中心波长在690～1020纳米范围可调谐。时间脉冲宽度约为100飞秒，重复频率76MHz。所述的飞秒激光器输出的激光经过可调衰减片102，入射到由物镜103和准直透镜105构成的准直扩束系统，扩束之后经分光镜106反射到空间光调制器的液晶面板107上。所述的空间光调制器上加载的相位为角锥相位分布。所述的角锥相位透过率函数表示为：

其中，(x,y)为归一化入射光瞳平面上的直角坐标系，α为角锥相位的发散角，k＝2π/λ为波矢。设角锥相位衍射光场经过物镜115之后产生的贝塞尔光束的工作距离为d_w。请参阅图2，从角锥相位与贝塞尔光束工作距离的几何关系，我们可以推导出工作距离满足式(3)：

其中，f₁和f₂分别为为第一透镜109和第二透镜112的焦距；f₃和f₄分别为为第三透镜113和物镜115的焦距；D₀为空间光调制器液晶面板107上加载的角锥相位最大通光孔径，β满足其对应的激发光斑半径可以表示为：

其中，τ为角锥相位衍射光场经过平场消像差物镜115之后的发散角为所产生的高斯贝塞尔光场对应的焦深为：，

通过调节所加载的角锥相位的发散角α可以实现激发荧光视场与焦深的调节。所加载的角锥相位的发散角α需满足：

所述的角锥相位将入射的激光束衍射，经过共焦透镜组第一透镜109和第二透镜112成像在第三透镜113入射光瞳上，随后经第三透镜113和平场消像差物镜115，在所述的平场消像差物镜115的焦点区域形成了高斯贝塞尔激发光场。

所述的角锥相位产生的高斯贝塞尔光束在样品117中，通过双光子激发即可形成荧光信号。在探测光路中，采用扭曲达曼光栅406【参见先前技术CN 201210106742】实现多物面同时成像。通过在所述的平场消像差物镜115之后加入的透镜组(第四透镜402和第五透镜404)将物镜的出射光瞳成像到扭曲达曼光栅406所在的平面，然后在扭曲光栅406之后由所述的电子增强CCD(EMCCD)相机探测，即可实现三维荧光信号的并行探测。其中，成像像距为扭曲达曼光栅406到EMCCD相机407探测面的距离v。于是，系统的整体的成像放大倍率可以表示为

其中，f₅和f₆分别为第四和第五透镜的焦距；u为物镜主平面到成像点之间的距离，即为物距。在EMCCD相的机探测像面上，不同物面的横向间隔为：

其中，λ是所探测的荧光的中心波长，Λ₀为扭曲达曼光栅的周期。不同物面的轴向间隔则为Δz＝W₂₀，即扭曲达曼光栅的离焦度。

为了充分利用CCD探测器407的成像面积，我们可以将两个正交取向的一维扭曲达曼光栅1×M_x和1×M_y通过叠加形成一个二维的扭曲达曼光栅。并且，如果W_20,y/W_20,x＝M_x或者1/M_y，则相邻焦斑之间的轴向离焦量相同，即轴向间隔相等。这样，在EMCCD的探测面上可以形成按照规则矩形排布的M_x×M_y个物的平面像。

结合x方向扫描振镜110和y方向扫描振镜111的横向扫描和所述的移动平台004的z向扫描，即可完成视场的拓展。

实施例

以下针对NA＝0.85的聚焦透镜为例，提出一种实时三维激光荧光成像装置的具体实施方案。

所采用的激光器为波长690～1020纳米范围内可调谐的飞秒激光器(含参量振荡器实现波长调谐)，激光器为基模水平偏振输出，其束腰半径为1.5mm。所采用的空间光调制器为HoloEye，Plute VIS，工作波长400～1100纳米，像素数为1920×1080，单像素尺寸8微米。为叙述的简洁，我们只考虑荧光波长中心为480纳米，谱宽设为±30纳米，对应的激发光中心波长为960纳米。事实上，由于其激发波长可调谐特性，该装置可以实现常见荧光波段如中心波长450纳米、480纳米、510纳米、530纳米、570纳米，和610纳米。

激发光输出物镜(103)和消色差准直透镜(105)的焦距分别为30mm和120mm。所采用的滤波小孔104为25微米小孔。空间光调制器上加载的角锥相位发散角为0.1～1.9度可调，对应径向周期数约为39。第一透镜109和第二透镜112的焦距分别为300mm和150mm。第三透镜113的焦距为24mm，通光孔径为10mm；物镜115焦距为2.4mm，孔径为4mm。第四透镜402的焦距为150mm，第五透镜404和第六透镜302的焦距均为300mm。图3给出了工作距离d_w随角锥相位发散角的变化曲线。从中我们可以看出，在发散角0.1～1.9度之内，工作距离d_w均小于焦距f₄，这说明激发光的轴向范围覆盖了焦面区域，因而后续荧光成像完全可以实现大倍率放大成像。图4和图5分别给出了激发光斑半径和焦深随角锥相位发散角的变化曲线。激发半径在500微米以上，焦深在200mm以上，足以覆盖一般生物样品。

扭曲达曼光栅406采用7×7达曼光栅数据，轴向离焦量取为W_0z＝1微米，光栅周期设为32微米；成像物距设为u＝2.5mm，像距v＝60mm，对应成像倍率为M＝48。则不同物面之间的横向间隔为Δx＝900μm，于是，利用可变光阑405将视场约束在900微米，对应的实际视场大小为18.7微米，该物镜分辨率极限约为300纳米。7×7个物面同时成像，对于900微米的横向间隔，需要的探测面积6.3×6.3mm。采用EMCCD的像素为2048×2048，单像素3.2微米，其探测面最大为6.5×6.5mm，可满足要求。

以上所述实时三维激光荧光成像装置仅表达了本发明一种具体实施例，并不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明基本思想的前提下，还可以对本专利所提出的具体实施细节和代表性装置做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

综上所述，本发明实时三维激光荧光成像装置，可广泛应用于生物样品实时三维荧光成像。

Claims (7)

1.一种实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于该装置分为激光激发模块、明场成像照明模块、数字探测模块、目镜观察模块和控制模块五部分：

所述的激光激发模块包括飞秒激光器(101)，沿该飞秒激光器(101)的激光输出的Y轴方向依次经过可调透过率的衰减片(102)、物镜(103)、小孔(104)、消色差准直透镜(105)，到达1：1分束镜(106)，经过所述的1：1分束镜(106)其中50％激光经过90度反射，沿X轴负方向传播到达空间光调制器液晶面板(107)；然后所述激光经过空间光调制器的液晶面板反射180度沿X轴方向传播，再次经所述1：1分束镜(106)并且50％激光透过，然后依次经过偏振片(108)、第一透镜(109)、x方向扫描振镜(110)、y方向扫描振镜(111)、第二透镜(112)、第三透镜(113)、二向色性分光镜(114)、平场消色差物镜(115)、载物台(116)，最终聚焦到样品(117)上，所述的第一透镜(109)和第二透镜(112)组成共焦透镜组，第三透镜(113)和平场消色差物镜(115)组成另一组共焦透镜组，所述的载物台(116)位于XYZ三维方向线型移动平台(004)上；

所述的明场照明模块包括白光发光二极管(201)，沿该白光发光二极管(201)的输出光方向依次是消色差准直透镜(202)、聚光镜(203)和所述的样品(117)，所述的白光发光二极管(201)位于所述的消色差准直透镜(202)焦点处；

所述的数字探测模块包括反射镜(401)，在该反射镜(401)的焦点位置是一个可推进/退出的柱反射镜(301)，当所述推进/退出的柱反射镜(301)退出时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为荧光探测模式，此时所述的激发模块的激光照射到样品(117)上经过二次谐波效应产生荧光，所述的荧光依次经过平场消色差物镜(115)、二向色性分光镜(114)，到达反射镜(401)，所述荧光经过反射镜(401)反射90度沿X轴方向传播，依次经过第四透镜(402)、6位置滤光片轮组(403)、第五透镜(404)、可变光阑(405)、扭曲达曼光栅(406)，最后成像在电子增强电荷耦合元件相机(407)的探测面上，所述的第四透镜(402)和第五透镜(404)组成共焦透镜组，所述的平场消色差物镜(115)的主平面位于所述的第五透镜(402)的前焦面上，所述的扭曲达曼光栅(406)位于所述的第五透镜(404)的后焦面上；

所述的目镜观察模块包括可推进/退出的柱反射镜(301)，当可推进/退出柱反射镜(301)推进时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为目镜观察模式，此时明场照明模块中照射到样品(117)上的照明光经过样品依次经过平场消色差物镜(115)、二向色性分光镜(114)、反射镜(401)，然后经过所述的柱反射镜(301)反射90度沿Z轴方向传播依次经过第六透镜(302)、转向反射棱镜(303)和目镜(304)，所述的可推进/退出柱反射镜(301)的反射镜面中心位于所述的第六透镜(302)的前焦面上；此时所述的可推进/退出柱反射镜(301)的反射镜面的中心位于所述的第四透镜(402)的后焦点和第五透镜(404)的前焦点上；此时所述的第四透镜(402)和所述的第六透镜(302)也组成一对共焦透镜组；

所述的控制模块包括工业控制计算机(001)、空间光调制器控制器(002)、移动平台控制器(003)和XYZ三维方向线型移动平台(004)，所述的工业控制计算机(001)的输出端分别与所述的空间光调制器控制器(002)、移动平台控制器(003)和电子增强电荷耦合元件相机(407)的输入端相连，所述的空间光调制器控制器(002)的输出端与空间光调制器的液晶面板(107)相连，所述的移动平台控制器(003)的输出端与所述的XYZ三维方向线型移动平台(004)的控制端相连。

2.根据权利要求1所述的实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于所述的空间光调制器液晶面板(107)上加载的相位分布满足角锥相位分布，即其中为空间光调制器液晶面上的极坐标，坐标原点为液晶面板的中心；mod(f,2π)表示对函数f取除以2π的余数；k＝2π/λ为波数；λ为工作波长；α表示经过角锥相位发散角。

3.根据权利要求1所述的实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于所述的平场消色差聚焦物镜(115)处产生的高斯-贝塞尔激发光束的工作距离d_w的关系式满足其中，f₃和f₄分别为第三透镜(113)和平场消色差物镜(115)的焦距，f₁和f₂分别为第一透镜(109)和第二透镜(112)的焦距，D₀为空间光调制器液晶面板上的角锥相位的最大孔径；激发光所激发的荧光视场半径约为k＝2π/λ为波数，λ为工作波长；轴向焦深范围可以表示为其中τ为经过平场消色差物镜(115)之后的光锥发散角，可以表示为此外，加载到空间光调制器上的角锥相位发散角α满足，其中D_obj为平场消色差物镜(115)的通光孔径。

4.根据权利要求1所述的实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于所述的飞秒激光器(101)的中心波长在范围690～1020纳米内可调谐，且通过物镜(103)和准直透镜(105)之后入射到空间光调制器液晶面板(107)上的光束为高斯分布。

5.根据权利要求1所述的实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于所述的6位置滤光片轮组(403)包含6个波段的荧光滤光片，中心波长分别对应450纳米、480纳米、510纳米、530纳米、570纳米，和610纳米，带宽均为正负10纳米。

6.根据权利要求1所述的实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于所述的载物台(116)装载在一个XYZ三个方向可移动的三维移动平台(004)上，且XYZ三维线型移动平台(004)在Z方向装配有绝对式光栅尺，可以实现由多个子视场拼接成一幅大视场图像。

7.根据权利要求1至6任一项所述的实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于所述的转向反射棱镜(303)的第一反射面是镀有一层银镜反射膜，第二反射面即入射面和出射面都镀有400～760宽带减反膜，且偏转角度θ满足关系式其中θ_th＝arcsin(1/n)，n为转向反射棱镜材料折射率。