CN110132920B - 一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置及其方法。本发明采用近红外激光，通过高数值孔径的显微物镜，在样品附近形成一个光镊，将其作为一个无形的手，来无接触、无干扰地操控微球镜，实现微球镜在样品表面任意感兴趣区的精确定位、移动和精确聚焦功能，从而很好地解决了现有技术存在缺陷；可实现微球镜对样品整个感兴趣区的光学超分辨成像，将该成像方法从演示性实验变为新型实用技术和仪器装置，光学超分辨成像空间分辨率已达到λ/8，横向放大率5.4倍，突破了传统的光学衍射极限(λ/2)，实现了“无标记”的光学远场、宽场超分辨显微成像。

Description

一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置及其方法

技术领域

本发明涉及光学超分辨的显微成像技术，具体涉及一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置及其方法。

背景技术

光学显微镜的是人类历史上最重要的科学成就之一，对微观世界的认识，特别是对生命科学发展具有划时代意义，它的发明极大地推动了相关科学领域的发展，已成为现代科学研究不可缺少的重要工具。然而，传统光学显微镜受光学衍射极限的限制，其空间分辨率约为照明光的半个波长(λ/2)，无法分辨样品(如细胞内部)的精细结构。超过光学衍射极限(超分辨)光学成像已成为生命科学研究，高密度信息存储、高分辨光刻等相关光学领域迫切需要解决的重要问题。尽管各种电子显微镜和扫描探针显微镜(如，近场扫描光学显微镜NSOM，原子力显微镜AFM)都具有非常高的纳米分辨本领，但均受到观察环境的限制，且不适用于液态环境下的生命活体样本的观察。目前，光学显微镜仍然是生命科学研究的最有力工具。近年发展的荧光超分辨显微镜(如STED、STORM、PALM等)使生物光学成像技术发生了革命性变化，并由此获得2014年Nobel奖，显示出光学超分辨成像技术的重要价值。然而，上述“荧光超分辨”成像仍存在一定限制和不足。譬如，上述所有荧光超分辨成像均需要事先对样品进行特殊的荧光标记和特殊的激发光源，成像速度慢，技术复杂，成本高。而且荧光标记对样品有干扰，有些样品甚至无法标记。其次，上述所有成像均是通过“点扫描”后重构得到的荧光图像(maping),并非直接光学“宽场成像”(imaging)，而图像重构也会带进噪声等不足。因此，发展“无标记”、直接“宽场”光学超分辨显微成像技术显得尤为迫切，已成为当今科学研究急需解决的问题。

传统的光学显微镜属于远场成像范畴，其分辨本领受光学衍射极限的限制，一般无法分辨小于200nm的样品细节。但近场光学不受衍射极限的限制，因此，近年人们提出了用透明微球作为微球镜，放置在样品表面(近场)成像，再用一般的物镜对微球镜的像进行二次成像，从而得到超过衍射极限分辨的光学像。该原理已被理论和实验所证实[1-8]。但现有的研究存在两个主要问题：(1)微球镜是随机沉落在样品表面，它无法准确的定位在样品的感兴趣区(ROI)，(2)单个微球镜尺寸太小，成像视野(FOV)有限，无法观察样品的整个感兴趣区。为了解决单个微球镜视野有限的问题，有学者提出用埋没在PDMS薄膜中的微球阵列进行成像[9]，但该方法存在严重的“马赛克”效应，且小球无法纵向移动。

激光“光镊”是1986年美国科学家A.Ashkin发明的，该技术获得2018年Nobel物理学奖。光镊利用高度汇聚的激光束形成的三维稳定的光学势阱，可以束缚或囚禁几十纳米至数十微米大小的单个粒子。通过对激光束的操控可以方便地操纵光阱中的束缚粒子。从原理上讲，光镊是不均匀激光场对介质粒子产生激化，使其产生感生电偶矩，而该电偶矩矩在不均匀激光场中受到一指向电场强度最大处(激光焦点)的梯度力，从而将粒子束缚在激光焦点附近。目前，光镊一般由TEM00模的高斯光束经高数值孔径的显微镜物镜聚焦形成。但现有研究中所用的微球镜是“随机”沉积在样品表面，无法控制其在样品表面的精确位置，且每个微球的覆盖面积很小(直径约几个微米)，可观察的视野(FOV)非常有限，无法观察样品的整个感兴趣区(ROI)。此外，微球镜与样品的纵向距离(即物距)也无法控制精确对焦，成像质量难以保证。有人将微球镜浸没在PDMS或SU-8光刻胶中，通过改变胶的厚度来调节微球镜与样品间的距离，即物距[9]；也有研究者将微球镜阵列固定在PDMS薄膜中，制备出微球薄膜阵列[10]，此外，也有用AFM针尖操纵微球成像[11]，从而试图解决单个微球镜视野有限的问题。

虽然，微球镜薄膜阵列在一定程度上，扩大了成像视野，但由于微球镜是不连续阵列，对样品成像存在严重的“马赛克”效应，且微球镜与样品间的物镜无法根据样品实时调节，从而进行准确对焦，成像质量受到影响。而用SU-8光刻胶厚度来调焦物镜，在实际应用中也不适用，因为该胶厚度是事先确定的，它无法根据样品情况动态地实时改变物镜来精确调焦，同时该方法也不适合生物样品液态环境或大规模集成芯片及纳米器件的观察。用AFM针尖操控微球，原理上可行，但在针尖操纵，及针尖与显微成像耦合方面存在困难，一直没解决该问题，得出实用成像装置的方案。因此，由于存在无法有效操控微球以及操控与成像耦合问题，该超分辨成像技术目前仍停留在原理演示阶段，还不能达到实际应用程度。

发明内容

为了解决现有技术无法对样品任意感兴趣区进行成像和单个微球镜视场太小的技术难题，即微球镜无法操控的问题，本发明提出了一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置及其成像方法。

本发明的一个目的在于提出一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置。

本发明的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置，对于透明的样品，照明光采用透射式，对于不透明的样品，照明光采用反射式。

照明光采用透射式，本发明的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置包括：电子控制单元、激光器、激光操控单元、激光通道、光学显微镜、微球镜、二向色分光镜、三维电动样品台、手动二维样品移动台、成像装置、计算机和照明灯；其中，透明的样品放置在三维电动样品台上，三维电动样品台设置在手动二维样品移动台上；样品浸没在液体中，微球镜注入至液体中；电子控制单元分别连接至激光器、激光操控单元和三维电动样品台，电子控制单元与计算机互相连接；激光器连接至激光操控单元；激光操控单元通过激光通道连接至光学显微镜内部；光学显微镜内且位于显微物镜后瞳上方的光轴上设置二向色分光镜；光学显微镜的显微物镜正对样品；在光学显微镜上设置成像装置；成像装置连接至计算机；计算机通过电子控制单元驱动激光器，激光器发出近红外波段的激光；激光通过激光操控单元扩束并准直后，通过激光通道传输至光学显微镜内；经过二向色分光镜反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊，调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；通过手动二维样品移动台将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在液态中；照明灯发出白光，从透明的样品的下面入射至样品；微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；通过激光操控单元调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机；计算机通过电子控制单元控制三维电动样品台按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的透射式光学超分辨成像装置。

照明光采用反射式，本发明的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置包括：电子控制单元、激光器、激光操控单元、耦合镜、激光通道、光学显微镜、微球镜、二向色分光镜、三维电动样品台、手动二维样品移动台、成像装置、计算机和照明灯；其中，样品放置在三维电动样品台上，三维电动样品台设置在手动二维样品移动台上；样品浸没在液体中，微球镜注入至液体中；电子控制单元分别连接至激光器、激光操控单元和三维电动样品台，电子控制单元与计算机互相连接；激光器连接至激光操控单元；照明灯与激光操控单元并排放置，位于耦合镜前，耦合镜设置在激光通道前，激光通道连接至光学显微镜内部；光学显微镜内且位于显微物镜后瞳上方的光轴上设置二向色分光镜；光学显微镜的显微物镜正对样品；在光学显微镜上设置成像装置；成像装置连接至计算机；计算机通过电子控制单元驱动激光器，激光器发出近红外波段的激光；激光通过激光操控单元扩束并准直后，通过激光通道传输至光学显微镜内；经过二向色分光镜反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊，调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；通过手动二维样品移动台将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在空中；照明灯发出白光，经耦合镜通过激光通道进入至光学显微镜内，由二向色分光镜反射至样品；微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；通过激光操控单元调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机；计算机通过电子控制单元控制三维电动样品台按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的反射式光学超分辨成像装置。

激光操控单元包括光隔离器、扩束镜组、一维电动位移台、光强调节元件、镜架和开关；其中，扩束镜组放置在一维电动位移台上，光强调节元件放置在镜架中；光隔离器、扩束镜组和光强调节元件沿光轴依次排列；开关位于激光操控单元的光路中的任意位置；激光先通过光隔离器保证激光不返回保护激光器；激光经过扩束镜组扩束，经过光强调节元件调节光强，经过开关出射。光强调节元件包括半波片和偏振分光棱镜PBS，半波片放置在镜架中，激光经过半波片改变偏振方向，然后经过偏振分光棱镜PBS；通过旋转镜架改变半波片的角度，实现激光强度调节。扩束镜组包括两个透镜，通过一维电动位移台改变两个透镜之间的距离，从而调节发散角。开关为电动开关，采用叶片式，打开时通光。

电子控制单元包括：多功能控制卡，一维电动位移台驱动器、旋转镜架驱动器、激光器驱动器、开关驱动器、三维电动样品台驱动电路和直流稳压电源；其中，交流电源连接至直流稳压电源；直流稳压电源分别连接至一维电动位移台驱动器、旋转镜架驱动器、激光器驱动器第和开关驱动器；计算机连接至多功能控制卡，多功能控制卡分别连接至一维电动位移台驱动器、旋转镜架驱动器、激光器驱动器、开关驱动器和三维电动样品台驱动电路；一维电动位移台驱动器连接至一维电动位移台，旋转镜架驱动器连接至镜架，激光器驱动器连接至激光器，三维电动样品台驱动电路连接至三维电动样品台；开关驱动器连接至开关。

激光器采用红外激光器，发出近红外(IR)波段的激光，一方面IR激光对生物样品无损，同时通过滤光片也容易与成像所用的可见光分开，不至于对成像光产生干扰。

微球镜为透明球体，材料为SiO2、聚苯乙烯或TiO₂，折射率n为1.3～2.1，微球镜的粒径D为5～30微米，表面钝化。

微球镜与样品表面的距离在100nm以内，悬浮固定在空中，与样品表面无接触，不会划伤或粘结样品。

显微物镜采用高数值孔径NA的限位物镜，NA≥1.15。

成像装置采用数字电荷耦合器件CCD相机。

三维电动样品台移动的步距d与微球镜的粒径D满足：

计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，中心部分图像为一张超分辨图像的中心位置

的图像，这样只选取近轴成像部分，去掉原图像边缘的枕形畸变部分。

二向色分光镜对近红外光全反射，对照明光半透半反。

对于透明的样品，液体采用生理盐水，对于不透明的样品，液体采用纯水。

本发明的另一个目的在于提供一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置的成像方法。

本发明的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置的成像方法，采用透射式，包括以下步骤：

1)将样品浸没在液体中；提供微球镜，将微球镜注入至液体中；

2)计算机通过电子控制单元驱动激光器，激光器发出近红外波段的激光；

3)激光通过激光操控单元扩束并准直后，通过激光通道传输至光学显微镜内；

4)经过二向色分光镜反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊，调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；

5)通过手动二维样品移动台将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在液态中；

6)照明灯发出白光，从透明的样品的下面入射至样品；

7)微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；

8)通过激光操控单元调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机；

9)计算机通过电子控制单元控制三维电动样品台按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；

10)计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的透射式光学超分辨成像装置。

本发明的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置的成像方法，采用反射式，包括以下步骤：

1)将样品浸没在液体中；提供微球镜，将微球镜注入至液体中；

2)计算机通过电子控制单元驱动激光器，激光器发出近红外波段的激光；

3)激光通过激光操控单元扩束并准直后，通过激光通道传输至光学显微镜内；经过二向色分光镜反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊；

4)调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；

5)通过手动二维样品移动台将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在液体中；

6)照明灯发出白光，经耦合镜通过激光通道进入至光学显微镜内，由二向色分光镜反射至样品；

7)微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；

8)通过激光操控单元调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机；

9)计算机通过电子控制单元控制三维电动样品台按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；

10)计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的反射式光学超分辨成像装置。

本发明的优点：

本发明采用近红外激光，通过高数值孔径的显微物镜，在样品附近形成一个光镊，将其作为一个无形的手，来无接触、无干扰地操控微球镜，实现微球镜在样品表面任意感兴趣区的精确定位、移动和精确聚焦功能，从而很好地解决了现有技术存在缺陷；可实现微球镜对样品整个感兴趣区的光学超分辨成像，将该成像方法从演示性实验变为新型实用技术和仪器装置，光学超分辨成像空间分辨率已达到λ/8，横向放大率5.4倍，突破了传统的光学衍射极限(λ/2)，实现了“无标记”的光学远场、宽场超分辨显微成像。

附图说明

图1为本发明的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置的实施例一的示意图；

图2为本发明的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置的实施例二的示意图；

图3为本发明的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置的实施例一的成像对比图，其中，(a)为电镜图，(b)为光学显微镜图，(c)为微球镜成像图，(d)为(c)的局部放大图。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例一

如图1所示，本实施例的照明光采用反射式，基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置包括：电子控制单元1、激光器2、激光操控单元3、激光通道4、光学显微镜5、微球镜、二向色分光镜7、三维电动样品台8、手动二维样品移动台9、成像装置10、计算机11和照明灯6；其中，透明的样品放置在三维电动样品台8上，三维电动样品台8设置在手动二维样品移动台9上；样品浸没在液体中，微球镜注入至液体；电子控制单元1分别连接至激光器2、激光操控单元3和三维电动样品台8，电子控制单元1与计算机11互相连接；激光器2连接至激光操控单元3；激光操控单元3通过激光通道4连接至光学显微镜5内部；照明灯6与激光操控单元3并排放置，照明灯6与激光操控单元3并排放置，耦合镜设置在激光通道4前，激光通道4连接至光学显微镜5内部；光学显微镜5内且位于显微物镜后瞳上方的光轴上设置二向色分光镜7；光学显微镜5的显微物镜13正对样品。14为手动二维样品移动台9的调节杆。

在本实施例中，激光器2采用波长1064nm，功率3W的红外激光器2；微球镜为直径约20微米钛酸钡，折射率n＝2.1，样品中的距离为173.3nm；显微物镜为高数值孔径水浸显微物镜(63X/NA1.15)。多功能控制卡(DAQ卡)：4路AD，16bit,4路模拟输出，8路数字输出，16路数字输入，主频1MHz。照明灯6采用卤素灯。

本实施例的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像方法，采用反射式，包括以下步骤：

1)将样品浸没在水中；提供直径约20μm的钛酸钡(n＝2.1)作为微球镜，溶于水，将微球镜用微注射器注入，样品为纳米电极；

2)计算机11通过电子控制单元1驱动激光器2，激光器2发出波长1064nm的激光；

3)激光通过激光操控单元3扩束至7mm并准直后，通过激光通道4传输至光学显微镜

5内；经过二向色分光镜7反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊；

4)调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台9在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；

5)通过手动二维样品移动台9将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在液体中；

6)照明灯6发出白光，经耦合镜通过激光通道4进入至光学显微镜5内，有二向色分光镜7反射至样品；

7)微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；

8)通过激光操控单元3调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置10形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机11；

9)计算机11通过电子控制单元1控制三维电动样品台8按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元3自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机11，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；

10)计算机11对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的反射式光学超分辨成像装置10。

如图3所示，(a)为电镜成像，(b)为普通的光学显微镜5(63倍水镜/NA1.15)，(c)为微球镜成像，后用计算机11拼接得到一幅40×40μm的超分辨图像，(d)为(c)的局部放大的图像。由图3可以看出，微球镜成像与电镜成像类似，均可以清楚地分辨间距为173.3nm的电极结构，其分辨率已超过光学衍射极限(200nm)，而在同样的物镜下光学显微镜5无法分辨该三端电极结构。

实施例二

如图2所示，本实施例的照明光采用透射式，本实施例的基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置10包括：电子控制单元1、激光器2、激光操控单元3、耦合镜、激光通道4、光学显微镜5、微球镜、二向色分光镜7、三维电动样品台8、手动二维样品移动台9、成像装置10、计算机11和照明灯6；其中，样品放置在三维电动样品台8上，三维电动样品台8设置在手动二维样品移动台9上；样品浸没在液体中，微球镜注入至液体中；电子控制单元1分别连接至激光器2、激光操控单元3和三维电动样品台8，电子控制单元1与计算机11互相连接；激光器2连接至激光操控单元3；激光通道4连接至光学显微镜5内部；光学显微镜5内且位于显微物镜后瞳上方的光轴上设置二向色分光镜7；光学显微镜5的显微物镜正对样品；在光学显微镜5上设置成像装置10；成像装置10连接至计算机11。在光学显微镜5上设置成像装置10；成像装置10连接至计算机11。照明灯6发出的照明光经过聚焦镜12入射到样品上。

最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置，照明光采用透射式，其特征在于，所述光学超分辨成像装置包括：电子控制单元、激光器、激光操控单元、激光通道、光学显微镜、微球镜、二向色分光镜、三维电动样品台、手动二维样品移动台、成像装置、计算机和照明灯；其中，透明的样品放置在三维电动样品台上，三维电动样品台设置在手动二维样品移动台上；样品浸没在液体中，微球镜注入至液体中；电子控制单元分别连接至激光器、激光操控单元和三维电动样品台，电子控制单元与计算机互相连接；激光器连接至激光操控单元；激光操控单元通过激光通道连接至光学显微镜内部；光学显微镜内且位于显微物镜后瞳上方的光轴上设置二向色分光镜；光学显微镜的显微物镜正对样品；在光学显微镜上设置成像装置；成像装置连接至计算机；计算机通过电子控制单元驱动激光器，激光器发出近红外波段的激光；激光通过激光操控单元扩束并准直后，通过激光通道传输至光学显微镜内；经过二向色分光镜反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊，调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；通过手动二维样品移动台将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在液态中；照明灯发出白光，从透明的样品的下面入射至样品；微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；通过激光操控单元调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机；计算机通过电子控制单元控制三维电动样品台按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的透射式光学超分辨成像装置。

2.一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置，照明光采用反射式，其特征在于，所述光学超分辨成像装置包括：电子控制单元、激光器、激光操控单元、耦合镜、激光通道、光学显微镜、微球镜、二向色分光镜、三维电动样品台、手动二维样品移动台、成像装置、计算机和照明灯；其中，样品放置在三维电动样品台上，三维电动样品台设置在手动二维样品移动台上；样品浸没在液体中，微球镜注入至液体中；电子控制单元分别连接至激光器、激光操控单元和三维电动样品台，电子控制单元与计算机互相连接；激光器连接至激光操控单元；照明灯与激光操控单元并排放置，位于耦合镜前，耦合镜设置在激光通道前，激光通道连接至光学显微镜内部；光学显微镜内且位于显微物镜后瞳上方的光轴上设置二向色分光镜；光学显微镜的显微物镜正对样品；在光学显微镜上设置成像装置；成像装置连接至计算机；计算机通过电子控制单元驱动激光器，激光器发出近红外波段的激光；激光通过激光操控单元扩束并准直后，通过激光通道传输至光学显微镜内；经过二向色分光镜反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊，调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；通过手动二维样品移动台将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在液体中；照明灯发出白光，经耦合镜通过激光通道进入至光学显微镜内，由二向色分光镜反射至样品；微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；通过激光操控单元调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机；计算机通过电子控制单元控制三维电动样品台按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的反射式光学超分辨成像装置。

3.如权利要求1或2所述的光学超分辨成像装置，其特征在于，所述激光操控单元包括光隔离器、扩束镜组、一维电动位移台、光强调节元件、镜架和开关；其中，扩束镜组放置在一维电动位移台上，光强调节元件放置在镜架中；光隔离器、扩束镜组和光强调节元件沿光轴依次排列；开关位于激光操控单元的光路中的任意位置；激光先通过光隔离器保证激光不返回保护激光器；激光经过扩束镜组扩束，经过光强调节元件调节光强，经过开关出射。

4.如权利要求3所述的光学超分辨成像装置，其特征在于，所述光强调节元件包括半波片和偏振分光棱镜PBS，半波片放置在镜架中，激光经过半波片改变偏振方向，然后经过偏振分光棱镜PBS；通过旋转镜架改变半波片的角度，实现激光强度调节。

5.如权利要求1或2所述的光学超分辨成像装置，其特征在于，所述电子控制单元包括：多功能控制卡，一维电动位移台驱动器、旋转镜架驱动器、激光器驱动器、开关驱动器、三维电动样品台驱动电路和直流稳压电源；其中，交流电源连接至直流稳压电源；直流稳压电源分别连接至一维电动位移台驱动器、旋转镜架驱动器、激光器驱动器第和开关驱动器；计算机连接至多功能控制卡，多功能控制卡分别连接至一维电动位移台驱动器、旋转镜架驱动器、激光器驱动器、开关驱动器和三维电动样品台驱动电路；一维电动位移台驱动器连接至一维电动位移台，旋转镜架驱动器连接至镜架，激光器驱动器连接至激光器，三维电动样品台驱动电路连接至三维电动样品台；开关驱动器连接至开关。

6.如权利要求1或2所述的光学超分辨成像装置，其特征在于，所述微球镜为透明球体，材料为SiO2、聚苯乙烯或TiO₂，折射率n为1.3～2.1，微球镜的粒径D为5～30微米，表面钝化。

7.如权利要求1或2所述的光学超分辨成像装置，其特征在于，所述微球镜与样品表面的距离在100nm以内。

8.如权利要求1或2所述的光学超分辨成像装置，其特征在于，所述三维电动样品台移动的步距d与微球镜的粒径D满足：

9.一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置的成像方法，采用透射式，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：

1)将样品浸没在液体中；提供微球镜，将微球镜注入至液体中；

2)计算机通过电子控制单元驱动激光器，激光器发出近红外波段的激光；

3)激光通过激光操控单元扩束并准直后，通过激光通道传输至光学显微镜内；

4)经过二向色分光镜反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊，调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；

5)通过手动二维样品移动台将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在液态中；

6)照明灯发出白光，从透明的样品的下面入射至样品；

7)微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；

8)通过激光操控单元调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机；

9)计算机通过电子控制单元控制三维电动样品台按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；

10)计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的透射式光学超分辨成像装置。

10.一种基于激光操控微球镜的光学超分辨成像装置的成像方法，采用反射式，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：

1)将样品浸没在液体中；提供微球镜，将微球镜注入至液体中；

2)计算机通过电子控制单元驱动激光器，激光器发出近红外波段的激光；

3)激光通过激光操控单元扩束并准直后，通过激光通道传输至光学显微镜内；经过二向色分光镜反射后，耦合进显微物镜，由显微物镜聚焦形成光镊；

4)调节显微物镜的焦点改变光镊的纵向位置，并结合手动二维样品移动台在水平面内的平移，将液体中的微球镜移动至焦点处，光镊抓取到微球镜；

5)通过手动二维样品移动台将微球镜移动到样品的表面，通过调节显微物镜的焦点调节微球镜与样品表面之间的距离，光镊将微球镜悬浮固定在液体中；

6)照明灯发出白光，经耦合镜通过激光通道进入至光学显微镜内，由二向色分光镜反射至样品；

7)微球镜将样品携有精细结构信息的渐逝波投射到远处，由被置于远场的显微物镜接收；

8)通过激光操控单元调节激光光束的发散角，改变光镊沿光轴的位移，从而改变微球镜距离样品表面的距离，使得样品在成像装置形成清晰的超分辨图像，一个位置的超分辨图像传输至计算机；

9)计算机通过电子控制单元控制三维电动样品台按指定的路径和范围水平面移动，进行步进移动分区成像，移动的步距小于微球镜的直径，使得微球镜位于样品表面的下一个位置，同时根据采集的图像清晰度，通过激光操控单元自动调节激光光束的发散角，实时调节微球镜相对样品表面的纵向距离，得到当前位置的清晰超分辨图像，并传输至计算机，直至完成整个样品表面感兴趣区成像；

10)计算机对每一位置的超分辨图像选取中心部分图像，将所有位置的中心部分图像无缝拼接，得到一幅大范围的完整超分辨图像，从而实现了基于微球镜成像的反射式光学超分辨成像装置。

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