CN107356566B - 宽场三维超高分辨定位和成像方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种对完整细胞的宽场三维超高分辨定位和成像方法，包括：调制入射光的偏振状态，变成P偏振光或S偏振光；调制后的光束在变为切向偏振光或者径向偏振光后对样品进行照明；利用入射角大于全内反射临界角的光产生的倏逝波照明细胞的下表面；利用入射角度小于全内反射临界角透射光和其被细胞上表面反射一次后的反射光干涉产生的图案照明细胞的上表面；根据采集的样品发出的荧光信息，重构完整细胞的三维超分辨图像。本发明还公开一种对完整细胞的宽场三维超高分辨定位和成像装置。本发明具有成像速度快、装置简单、操作方便等特点，可以很好地应用于荧光样品的检测之中。
Description
技术领域
本发明属于超分辨显微成像领域，尤其涉及一种对完整细胞的宽场三维超高分辨定位和成像方法与装置。
背景技术
常规的宽场光学显微镜受到衍射效应的影响，横向分辨率被限制在激发光的半波长左右，轴向分辨率则更低。为了了解一些复杂的生物过程中分子调控的基础，需要对培养的细胞或完整组织中活细胞内蛋白质的动力学进行分析。
目前许多常用的成像方法实现横向超分辨的关键是对荧光信号进行强度调制，如STED、SSIM中结构上的强度调制和PALM、STORM中随机过程中的强度调制。这些强度调制依赖于不同激发波长，对荧光蛋白标记有严格的要求，从而限制了它们的应用。荧光偶极子是荧光的固有特性，而且极化强度会通过旋转的线偏振激发光改变。这一偏振特性可以产生不受特定荧光团限制的强度调制，因此偏振相关的超分辨方法有着很强的兼容性和广阔的生物学应用前景。
虽然轴向分辨率突破的进度落后于横向分辨率，但也出现了很多提高轴向分辨率的方法，如驻波显微、4pi显微镜等干涉方法和3D-STORM、3D-PALM、iPALM和3D-STED等单分子定位方法。但这些方法牺牲了时间分辨率，也依赖特殊光学元件和大量的数据分析以达较高的精度。全内反射荧光显微镜TIRF是最早给出亚衍射级轴向信息的光学方法之一，改变全内反射的入射角，还可以进一步得到对应荧光样品的深度信息，成像速度也很快。然而TIRF成像范围被限制在盖玻片附近的几百纳米；同时TIRF对轴向信息的获取还依旧是定位技术，并不能得到三维的超高分辨信息。
因此在对完整细胞的研究需要一种方法实现完整细胞的三维超高分辨成像，同时在不牺牲分辨率的前提下，提高时间分辨率。
发明内容
本发明提供了一种对完整细胞的宽场三维超高分辨定位和成像方法与装置，结合旋转全内反射显微、干涉对比显微和偏振调制方法实现对完整细胞的宽场三维高精度定位与成像。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、操作方便等特点，可以很好地应用于荧光样品的检测之中。
一种对完整细胞的宽场三维超高分辨定位与成像方法，包括以下步骤：
1)对激光器发出的激光光束进行准直；
2)光束起偏后通过二分之一波片，变成P偏振光或S偏振光；
3)使调制后的光束通过二维扫描振镜系统聚焦在显微物镜后焦面，实现在该面上的环形扫描和变角度扫描；
4)显微镜后焦面上的环形径向偏振光转换或切向偏振光转换波片使线偏光的偏振方向能够实现横向全角度扫描；
5)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光；
6)细胞下表面由入射角大于全内反射临界角的光全内反射产生的倏逝波照明，产生的荧光强度为：
其中θ为入射角，z为轴向深度，α为激发光的入射角，为激发光的方位角，I代表电场强度，ρ为考虑到发散角的激光光束强度的空间分布，Ω为光束的发散角，f为轴向的荧光分子强度。
考虑到有限的入射角和穿透深度，可以得到：
g＝Hf
其中g和f分别对应N个角度和N个深度的向量，H为N角度和N深度的信息组成的矩阵，与上述的算符均相关。因此可以将成像过程看做一个线性系统，通过求解逆问题的方式，从多角度图像中重建出细胞的三维荧光密度分布。
其中，当入射角度θ1大于全反射角时，激发的倏逝波场沿着z轴呈指数衰减，在细胞的下表面附近激发荧光，通过改变照明角度改变衰减系数，实现z轴的差别照明。
7)细胞上表面由入射角小于全内反射临界角的透射光与反射光干涉产生的图案照明，干涉产生的照明图案强度分布满足公式：
E～1+rTEexp[iφ(H)]，
其中rTE是与界面垂直的电场分量的菲涅尔反射系数，φ(H)是透射光与反射光之间的相位差。
与轴向位置H相关的φ(H)满足公式：
菲涅尔系数满足公式：
其中，λ为入射光真空中的波长，为特征矩阵MTE的四个参数，ki为不同材料中的波矢；nSi，nox，nb分别为硅、二氧化硅和样品中的折射率；θSi，θox，θb分别为硅、二氧化硅和样品中的入射光角度；dox为二氧化硅膜层的厚度。
8)进行偏振调制时，探测器上的光强分布符合泊松分布，且随偏振的改变呈周期性变化，可表示为：
I(r,θ)～Poisson(μ(r,θ))
f(θ,αi)＝cos2(αi-θ)
其中，μ为到达探测器的光子数，r为探测器上位置，θ为激发光的偏振角度，I0为由于系统响应不稳定引入的与偏振相关的周期性校正因子，U为系统的点扩散函数，g0(ri)和αi分别为位置为ri的第i个辐射偶极子的极化强度和极化方向，b(r)为短时间内偏振不稳定的背景，f(θ,αi)为随入射光偏振方向改变的有效辐射光子率。
9)根据扫描过程中收集的荧光信息，以及成像过程的前向物理模型，求解相关的逆问题得到样品的三维超分辨信息重构。
本发明还提供了一种对完整细胞的宽场三维超高分辨定位与成像装置，包括光源、承载待测样品的样品台，所述光源与样品台之间依次设有：
用于准直激光源发出的光束的准直透镜；
用于将光源发出的光束改变为线偏振光的起偏器；
用于使线偏振光源变为P偏振光或S偏振光的1/2波片；
用于使激发光实现环形扫描和角度改变的二维扫描振镜系统；
用于产生显微物镜后焦面的共轭面的4f系统；
用于使激发光偏振实现横向全角度扫描的波片；
用于反射激发光、透射荧光信号的二色镜；
用于在显微物镜后焦面上聚焦一个位置可控点的场镜；
用于将激发光聚焦到样品上的显微物镜；
并设有用于控制所述扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。
针对细胞的下表面，所述的控制器控制二维扫描振镜系统，使激发光由入射角大于全内反射临界角的光产生的倏逝波进行照明；
针对细胞的上表面，所述的控制器控制二维扫描振镜系统，使激发光由入射角度小于全内反射临界角透射光和其被细胞上表面附近反射一次后的反射光干涉产生的图案进行照明。
本发明中通过探测系统接收样品发出的信号光，该探测系统包括：
用于将信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；
用于探测信号光的光强信号的EMCCD探测器。
作为优选，所述光源与起偏器之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤和准直的准直透镜。
本发明中所述的细胞上表面附近的盖玻片表面与细胞之间依次镀了硅膜和二氧化硅膜用于增强反射效应。
本发明原理如下：
显微系统成像的分辨率受光学系统衍射的影响，要对完整细胞进行三维的超分辨成像，最大的问题在于轴向分辨率的提高。Lightsheet横向照明的最细光束只能做到半波长量级，Tirf的穿透深度最多为几百纳米，成像范围局限于细胞的下表面，无法对一个细胞进行完整成像。
在本发明方法中，为了对一个完整细胞进行三维超分辨成像，将细胞分为了上下表面两个部分；同时为了不牺牲时间分辨率，使用宽场照明。对于细胞的下表面，利用多角度TIRF照明得到不同角度下与轴向位置相关的荧光强度。在细胞的上表面附近的盖玻片上分别镀上硅膜和二氧化硅膜对反射光进行场增强，入射的激发光与其反射光干涉产生轴向结构光照明细胞的上表面。通过改变入射角度可以改变干涉产生的照明图案，从而得到每个轴向位置在不同角度照明时的强度变化曲线，将得到的荧光信息与曲线对应即可得到荧光颗粒的轴向分布。二维扫描振镜系统在改变入射角的同时使入射光在显微物镜后焦面上进行环形扫描，该面共轭面上的波片使入射光的偏振方向实现横向全角度扫描。根据荧光分子在不同极性光照射下的发射模型，以基于极大似然估计的解调算法得到横向的荧光分子分布。结合横向与轴向的信息，可以得到完整细胞的三维超分辨成像。
相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)首次提出了结合偏振调制、全内反射和干涉照明对完整细胞进行三维定位和成像；
(2)针对成像过程构建前向物理模型，以解病态逆问题的方式解构图像，得到三维分辨信息；
(3)装置简单，操作方便。
附图说明
图1为本实施例的宽场三维超高分辨定位和成像装置的结构示意图；
图2为本实施例中以全内反射方式对细胞下表面进行照明的示意图；
图3为本实施例中以反射干涉方式对细胞上表面进行照明的示意图；
图4为本实施例中实现横向偏振全角度扫描波片的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
如图1所示的宽场三维超高分辨定位和成像装置，包括：激光光源1，准直透镜2，起偏器3，1/2波片4，二维扫描振镜系统5，透镜6，波片7，透镜8，二色镜9，场镜10，显微物镜11，样品台12，EMCCD探测器13和扫描振镜的控制器14。
准直透镜2、起偏器3和1/2波片4依次位于激光光源1出射光束的光轴之上。二维扫描振镜系统5、透镜6、波片7、透镜8和二色镜9依次位于经反射后光束的光轴之上，其中，透镜6、波片7和透镜8组成了一个4f系统，使波片7与显微物镜11的后焦面共轭。
场镜10、显微物镜11和样品台12分别位于经二色镜9反射后光束的光轴之上。EMCCD探测器13位于经二色镜9后透射光束的光轴之上。控制器14与二维扫描振镜系统5相连，用于控制扫描振镜系统的扫描。
本实施例中，显微物镜11的数值孔径NA＝1.49。
采用图1所示的装置进行超分辨显微的方法如下：
从激光光源1发出的激光光束，经过准直透镜2完成准直。经过准直后的光束入射到起偏器3变为线偏振光，旋转1/2波片4可以改变线偏振光的偏振方向，使其变为S偏振光或P偏振光。二维扫描振镜系统5使入射光在改变角度的同时呈环形扫描，经过波片7变为切向偏振光或者径向偏振光，实现偏振的横向全角度扫描。经过二维扫描振镜系统之后的平行光经过二色镜9、场镜10和显微物镜11平行入射到样品台12上。用于控制二维扫描振镜系统的控制器14首先控制激发光的入射角从全内反射的临界角开始增大，使激发光在载玻片界面上发生全内反射，产生的倏逝波对细胞的下表面进行照明，如图2所示。该倏逝波激发的荧光被探测到的强度也随z轴以指数形式衰减，可以写为：
其中θ为入射角，z为轴向深度，α为激发光的入射角，为激发光的方位角，I代表电场强度，ρ为考虑到发散角的激光光束强度的空间分布，Ω为光束的发散角，f为轴向的荧光分子强度。考虑到有限的入射角和穿透深度，可以得到：
g＝Hf
其中g和f分别对应N个角度和N个深度的向量，H为N角度和N深度的信息组成的矩阵，与上述的算符均相关。因此将成像过程看做一个线性系统，通过求解逆问题的方式重建出细胞下表面以上800nm左右的荧光密度分布。
然后控制二维扫描振镜系统使激发光的入射角从0度扫描至全内反射临界角之间，此时激发光直接入射到细胞上表面附近镀了场增强膜的盖玻片上，反射一次后的反射光与直接入射光进行干涉，产生干涉图案对细胞上表面进行照明，如图3所示。改变角度同样也可以得到不同深度的荧光颗粒对应不同入射角度时被激发的荧光强度，得到细胞上表面以下400nm左右的荧光密度分布。
在执行上述多角度扫描的同时，在EMCCD探测器13的曝光时间内保持入射角不变改变激发光的方位角实现偏振方向全角度扫描，使荧光分子被不同极性的光照射发射，如图4所示。结合得到的轴向和横向数据，可以对厚度在1μm左右的完整细胞进行高精度的三维超分辨定位与成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种对完整细胞的宽场三维超高分辨定位和成像方法，其特征在于，包括：
调制入射光的偏振状态，变成P偏振光或S偏振光；
调制后的光束在变为切向偏振光或者径向偏振光后对样品进行照明；
利用入射角大于全内反射临界角的光产生的倏逝波照明细胞的下表面；
利用入射角度小于全内反射临界角透射光和其被细胞上表面反射一次后的反射光干涉产生的图案照明细胞的上表面；
根据采集的样品发出的荧光信息，重构完整细胞的三维超分辨图像。
2.如权利要求1所述的宽场三维超高分辨定位和成像方法，其特征在于：当入射角度θ1大于全反射角时，激发的倏逝波场沿着z轴呈指数衰减，在细胞的下表面附近激发荧光，通过改变照明角度来改变衰减系数，实现z轴的差别照明。
3.如权利要求1所述的宽场三维超高分辨定位和成像方法，其特征在于：产生全内反射照明时，得到的荧光强度其分布满足公式：
其中θ为入射角，z为轴向深度，α为激发光的入射角，为激发光的方位角，I代表电场强度，ρ为发散角的激光光束强度的空间分布，Ω为光束的发散角，f为轴向的荧光分子强度。
4.如权利要求1所述的宽场三维超高分辨定位和成像方法，其特征在于：细胞上表面设置依次镀有硅膜和二氧化硅膜用于增强反射效应的盖玻片。
5.如权利要求4所述的宽场三维超高分辨定位和成像方法，其特征在于：干涉产生的照明图案强度分布满足公式：
E～1+rTEexp[iφ(H)]，
其中rTE是与界面垂直的电场分量的菲涅尔反射系数，φ(H)是透射光与反射光之间的相位差；
与轴向位置H相关的φ(H)满足公式：
菲涅尔反射系数满足公式：
p0＝nSi cosθSi，p1＝nox cosθox，p2＝nb cosθb，
其中，λ为入射光真空中的波长，为特征矩阵MTE的四个参数，ki为不同材料中的波矢；nSi，nox，nb分别为硅、二氧化硅和样品中的折射率；θSi，θox，θb分别为硅、二氧化硅和样品中的入射光角度；dox为二氧化硅膜层的厚度。
6.如权利要求1所述的宽场三维超高分辨定位和成像方法，其特征在于：入射光在显微物镜的后焦面上以不同的入射角对样品进行环形扫描。
7.如权利要求1所述的宽场三维超高分辨定位和成像方法，其特征在于：在调制后的光束转换为切向偏振光或者径向偏振光时，采集荧光信息的探测器上的光强分布符合泊松分布，且随偏振的改变呈周期性变化，可表示为：
I(r,θ)～Poisson(μ(r,θ))
f(θ,αi)＝cos2(αi-θ)
其中，μ为到达探测器的光子数，r为探测器上位置，θ为激发光的偏振角度，I0为由于系统响应不稳定引入的与偏振相关的周期性校正因子，U为系统的点扩散函数，g0(ri)和αi分别为位置为ri的第i个辐射偶极子的极化强度和极化方向，b(r)为短时间内偏振不稳定的背景，f(θ,αi)为随入射光偏振方向改变的有效辐射光子率。
8.一种对完整细胞的宽场三维超高分辨定位和成像装置，包括光源、承载待测样品的样品台、将光线投射到所述样品台的显微物镜和采集信号光光强的探测器，其特征在于：设有使激发光在样品面进行扫描的二维扫描振镜系统，控制所述二维扫描振镜系统的控制器，和收集所述待测样品发出的信号光的探测系统；
针对细胞的下表面，所述的控制器控制二维扫描振镜系统，使激发光在显微物镜后焦面上进行环形扫描的同时以大于全内反射临界角入射，产生倏逝波照明样品；
针对细胞的上表面，所述的控制器控制二维扫描振镜系统，使激发光在显微物镜后焦面上进行环形扫描的同时以小于全内反射临界角入射，透射光和其被细胞上表面附近反射一次后的反射光干涉产生的图案照明样品。
9.如权利要求8所述的宽场三维超高分辨定位和成像装置，其特征在于：所述的光源与二维扫描振镜系统之间依次设有：
用于准直激光光源发出的光束的准直透镜；
用于将光源发出的光束改变为线偏振光的起偏器；
用于将线偏振光变为S偏振或P偏振的1/2波片。
10.如权利要求9所述的宽场三维超高分辨定位和成像装置，其特征在于：所述显微物镜的后焦面共轭面上放置径向偏振光或切向偏振光转换的玻片，用于实现横向的全角度偏振快速调制。
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