CN101076867A - 全内反射荧光（tirf）显微镜 - Google Patents

Abstract

一种全内反射荧光(TIRF)显微镜具有共轭透镜30，其被放置在偏离主显微镜轴AA的位置。透镜30被载片固定，以使显微镜轴AA和共轭透镜轴BB之间的径向间距可被改变。载片60还使透镜绕显微镜轴旋转。当透镜30旋转时，由入射激光束产生的光斑64绕物镜34的圆周移动。这改变了隐失波的极化方向，样本44位于隐失波中。通过将发射的荧光作为透镜角的函数进行研究，可提供有关研究中的分子的空间姿态的信息。

Description

全内反射荧光（TIRF）显微镜

技术领域

【0001】本发明涉及一种全内反射显微镜，且优选地涉及一种全内反射荧光(TIRF)显微镜。

背景技术

【0002】近年来，TIRF显微术或方法已日益盛行，特别是其可作为一种研究宏观分子酶类，蛋白质等的实时移动行为的工具。一般，一个或多个探测器在定义的方向上被连接到待研究的蛋白质或其它分子。然后，随着分子移动，例如当其经历催化作用时，探测方向上的变化被检测。大多数探测器是荧光的，并具有自然偶极子。具有与偶极子平行的极化方向的光优选被吸收；类似地，由探测器发射的荧光也优选在平行于偶极子轴线的方向上被极化。

【0003】在典型的TIRF显微镜中，待研究的样本是由合适波长的平面极化激光照射的，以由探测器吸收。这使探测器发出荧光(一般以不同的波长)，并且发射的光被分解成两个垂直极化部件。通过研究这些部件的比率，可以确定各向异性。

【0004】在TIRF显微镜中，通过将待研究的分子放置得非常靠近玻璃或其它表面；然后用光以一掠射角透过玻璃照射，以在与样本相邻的内表面上获得全内反射，使场的有效深度保持为很小。在全内反射发生的此点上，隐失波被产生，其从玻璃表面向外延伸出大约200纳米左右。样本被放置在隐失波中，并且极化的隐失波激励荧光探测器发射，然后如前面所述发射的光被检测并分析。

【0005】典型的TIRF配置示意地示于图1中。待研究的样本10放置在两个玻璃片14，16之间的狭长的样本空间12内。物镜18被设置在样本的前面，透镜和玻璃片16之间的缝隙13一般被油填充。

【0006】照射样本10的激光19只照射通过透镜的边沿，透镜充分折射此光，以当其到达与样本紧邻的玻璃片16的前边沿时，能完全从内部被反射。此内反射使样本置于样本空间12内的隐失波的光中。由样本内的探测器发射的荧光沿透镜的整个区域被采集，并传递到其它光学元件上(未示出)以用于分析。

【0007】当到达边界的光被极化时，隐失波(evanescent wave)也被极化。当吸收偶极子的方向与隐失波的极化方向一致时，所研究的分子的荧光是最大的。发射的荧光也被极化。如果分子的方向是杂乱的，则分子系综没有极化，但检查时域上的各向异性现像提供了有关偶极子的旋转或翻转速率(tumbling rate)的信息。当用现代CCD照相机观察单个分子时，可以确定单个分子的方向。通过将发射的荧光强度的角变化作为激发光的极化角度的函数进行测量，可以计算偶极子的方向。精确计算荧光偶极子的角度需要测量多个极化角度。

【0008】在TIRF显微镜中，玻璃(16)的表面和样本缝隙(12)(通常充满水)之间的界面本身可用作起偏振器。仅在一个方向上照射光，以使入射和反射波存在于一个平面上，产生极化隐失波，该隐失波在一些方向上比在另一些方向上更适合于激励偶极子。克服此类问题的一种方法已经在S.Wakelin & C.R.Bagshow，A prism combination fornear isotropic fluorescence excitation by total internalreflection，Journal of Microscopy vol.209.Pt 2 Februray 2003，pages 143-148中公开。该文中描述的设备使用复杂的棱镜组合作为光分束器，以在三维方向上获得同向激励。不过，此文中描述的配置相对比较复杂，并且也不适于使用在TIRF显微镜内(Wakelin & Bagshow依靠棱镜组合照射样本，棱镜组合完全与用来接收发射的荧光的物镜分离)。

发明内容

【0009】本发明的第一个目标是至少减轻现有技术的各种困难。

【0010】本发明的另一个目标是提供一种TIRF显微镜，在这种显微镜中，使用者可以很容易地改变隐失波的极化。

【0011】根据本发明的第一方面，提供了一种全内反射显微镜，其包括物镜和共轭透镜，由此，入射在所述共轭透镜上的照射光束被焦距到所述物镜上的束斑；所述共轭透镜被固定在可调节的载片上，由此所述透镜是可移动的以使所述束斑绕所述物镜的圆周移动。

【0012】优选地，此显微镜是TIRF显微镜。

【0013】物镜和共轭透镜具有平行的光轴，载片优选地固定共轭透镜以绕物镜的光轴/显微镜的光轴旋转。可选地，透镜可被选择为倾斜一角度，而不是旋转的，以使束斑绕物镜的圆周移动。在这种情况下，共轭透镜可以在物镜光轴的中心。

【0014】当然，应该理解在权利要求和说明书中表述“束斑”表明物镜的前表面上的一个很小的但非零大小的区域。应该理解此斑点不一定是照射光束的焦点，而是由物镜的前表面和入射光束的会聚光锥(converging cone)相交定义的区域。

【0015】优选地，载片可进一步调节，以使束斑在物镜的径向上奇迹周围上能移动。在一个实施例中，这可以通过调节物镜的光轴和共轭透镜的平行光轴之间的间距实现。

【0016】根据本发明的第二方面，提供了一种操作全内反射显微镜的方法，所述全内反射显微镜具有物镜和共轭透镜，其中入射在所述共轭透镜上的照射光束被聚焦成所述物镜上的束斑，该方法包括关于物镜移动共轭透镜以使束斑绕物镜的圆周移动。

【0017】此方法进一步扩展到从已经被光束照射过的样本中采集光，并将采集的光作为物镜的圆周上的束斑的角位置的函数进行分析。也可以类似地将采集的光作为物镜的束斑的径向位置的函数进行分析。

附图说明

【0018】本发明可以以多种方式被实际实施，参考附图并通过例子，一个具体的实施方式将被描述，在图中：

【0019】图1一般图解说明了TIRF显微镜的原理；

【0020】图2是根据本发明的一个实施方式的TIRF显微镜的示意图；

【0021】图3是通过共轭透镜和物镜的纵剖面。

【0022】图4a显示了共轭透镜安装的方式；和

【0023】图4b显示了撞击到物镜的表面上的入射激光的运动。

具体实施方式

【0024】图2是根据本发明的实施方式的TIRF显微镜的示意图。显然，应该理解此图纯粹是示意性的，其并不代表准确的相对大小或距离。

【0025】如图中所示，激光20产生光束，该光束通过扩束器22，光束调节器(例如光测弹性调制器)24和挡块26，该光束被从挡块26导向成一角度的分色镜28。分色镜28将光束反射到偏离轴的共轭透镜30。通过此透镜之后，光以一定角度被折射，如参考号32所示，以撞击到物镜34的外边沿。然后，光折射通过该透镜并进入总体表示为36的样本夹持器。在夹持器中，样本44被保持在下玻璃片40和上玻璃片42之间充满水的缝隙中。下琉璃板40和物镜34之间的空间38填满了油。

【0026】来自物镜34边沿的入射光以一掠射角撞击到玻璃片40上，并在玻璃/水界面上完全是内反射的，从而产生如上文描述的在样本44的区域内的隐失波。反射光返回通过物镜的另一边沿并且或返回到共轭透镜30或可选地由光学路径中的挡块(未示出)阻挡。反射光在TIRF装置中不是特别关心的。

【0027】样本在各个方向上发射荧光，发射的光中的部分被物镜采集，并如虚线48(更准确地说，在由虚线32，46定义的锥形内)所示返回共轭透镜。从共轭透镜上其返回通过分色镜并通过滤光器50，可移动的极化检偏器52和半镀银镜54到达照相机56。目镜58使使用者能实时地查看捕捉到的图像。

【0028】共轭透镜30被提供有可调节的载片60，其允许使用者手动或自动地改变共轭透镜的光轴BB和物镜34和显微镜的主光轴AA之间的间隔。此调节可以通过任何简便的装置，诸如举例来说导螺杆62来实现，从图3和4a可清楚看出这一点。通过旋转导螺杆，使用者能调节物镜的光轴和激光斑撞击物镜上的那一点之间的距离。如果此距离太小，内部反射不会发生，但当此距离大于所需的最小值时，随着共轭透镜被移动，总内反射会发生在不同的掠射入射的角度。

【0029】共轭透镜载片60还被布置成使偏离轴的共轭透镜30绕与主显微镜轴AA共轴的旋转轴旋转。图4a是沿着显微镜轴AA看进去的共轭透镜和载片的图。载片在双方向箭头66的方向上的旋转使入射激光斑64在物镜34的边沿绕透镜的圆周移动。不管光斑在圆周的位置如何，样本上继续生成隐失波。然而，在界面上生成的极化或偏振基面会随透镜旋转。因此，通过将发射的荧光的强度作为共轭透镜的旋转位置的函数进行测量，使用者可以得到有关偶极子引起荧光的空间中的方向的信息，因此获得被研究的微观分子的位置的信息。这使使用者能实时研究分子的翻转。

【0030】如图4a所示，共轭透镜载片60被布置为圆形，其中心位于显微镜轴AA上的一点。圆形载片被对齐以使平行于其上表面的平面垂直于显微镜轴。共轭透镜30被装在载片上，并被布置以使圆形载片的中心不位于沿共轭透镜的光轴BB上的一点，即，共轭透镜的光轴与显偏离显微镜的轴。为了使圆形共轭透镜载片60绕其中心旋转，即关于与显微镜轴AA共轴的旋转轴旋转，可购买的径向滚珠，诸如从SKF可获得的6210-2RS1，可用在圆形透镜载片(未示出)的外周边上。

【0031】因此，如上所述，隐失波的极化基面是在玻璃/水界面上产生的，其将随共轭透镜30的旋转而旋转，根据本发明的实施例能使光的极化平面旋转入射到样本44上。

【0032】在可替代的布置中(未示出)，所示设备可以被转化成传统的以明视场模式运行的显微镜，这仅需将照射灯放置在样本夹持器36的远侧即可实现。这提供了同时获得样本的相衬像和TIRF图像的可能。这种布置对于Waklin & Bagshaw的方法是不可行的，原因是棱镜的位置将必需阻挡明视场照明的附加源。

【0033】用以上所述的装置，显微镜运行在“远场”模式下，这是一种能同时获得全视场的实时图像的一种模式；使用者不必像在传统的共焦显微术中必需的那样对全视场进行扫描。

【0034】再次参考图2，另一种可能性就是使用光测弹性调制器24，以旋转入射激光束的极化平面，并由此旋转全内反射激励光束的极化平面。我们不认为作为第一近似，这会改变隐失波的极化，尽管可能存在次级效应。如果想研究反射光46，并允许其沿光轴无阻碍地返回，可以使用极化检偏器52进行额外的分析。

Claims (9)

1.一种全内反射显微镜，包括物镜和共轭透镜，入射在所述共轭透镜上的照射光束由此被焦距成所述物镜上的束斑；所述共轭透镜被固定在可调节的载片上，从而使所述透镜是可移动的以使所述束斑绕所述物镜的圆周移动。

2.根据权利要求1所述的显微镜，其中所述载片固定所述共轭透镜以关于所述物镜的光轴旋转。

3.根据权利要求1或2所述的显微镜，其中所述载片使所述物镜的光轴和所述共轭透镜的平行光轴之间的间距是可被调节的。

4.一种操作全内反射显微镜的方法，所述全内反射显微镜具有物镜和共轭透镜，其中入射在所述共轭透镜上的照射光束由此被焦距成所述物镜上的束斑，所述方法包括使所述共轭透镜关于所述物镜移动，以使所述束斑围绕所述物镜的圆周移动。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述物镜具有第一光轴，所述共轭透镜具有第二平行光轴，该第二平行光轴与所述第一光轴相隔开，所述方法包括绕所述第一轴旋转所述共轭透镜。

6.根据权利要求4或5所述的方法，包括在所述物镜的径向方向上移动所述束斑。

7.根据权利要求4-6中的任何一项权利要求所述的方法，包括从已经被所述光束照射过的样本中采集光，并将所采集的光作为所述物镜的所述圆周上的所述束斑的角位的函数进行分析。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，包括如权利要求4-6中的任何一项权利要求所述的方法，包括从已经被所述光束照射过的样本中采集光，并将所采集的光作为所述物镜上的所述束斑的径向位置的函数进行分析。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中来自所述样本的光是由所述样本发射的荧光。

Images