CN105807412B - 一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于自由曲面整形的全内反射显微装置，包括光源以及沿光路依次布置的：线偏光发生模块，用于将光源发出的光束转换为线偏光；自由曲面聚焦模块，用于将所述的线偏光转换为环状聚焦光；数字微镜反射模块，用于选择区域反射所述的环状聚焦光；光学放大传递模块，用于实现光束的全内反射照明；荧光成像模块，用于激发样品发出荧光并收集荧光信号图像。本发明还公开了一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法，本发明无机械振动模块，扫描更稳定，噪声更小；激光能量利用率更高，成像视场更加均匀；DMD控制控制扫描，角度更加准确，利于实现分层扫描与3D图像重建。
Description
技术领域
本发明涉及显微成像领域，尤其涉及一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法与装置。
背景技术
随着生物科学研究的发展，特别是与膜相关的生物现象的研究，对于一种仅观察单层样品结构的显微方法有着强烈的需求。传统的显微方法中，照明时整个视场在z轴方向上都被照明光束照明，z轴方向的分辨率和信噪比一直都做不高，为此光切片显微镜和全内反射显微镜(Tirf)都是提高z轴分辨率的技术手段。
光切片显微镜采用横向照明的方法，但由于衍射极限的存在，横向照明的最细光束只能做到半波长量级，其z轴分辨率依然达不到仅观察细胞膜结构的要求，而且由于细胞的贴壁生长，光切片显微技术很难准确照明到相应的位置。
全内反射显微镜(Tirf)是一种利用全内反射原理，由于倏逝场沿z轴方向的衰减特性，通过改变全内反射的入射角度可以实现不同的衰减系数，从而可以在细胞与装载波片之间形成100nm厚的光场，这层光场恰好与细胞的贴壁生长时细胞膜的位置重合，实现了细胞膜的准确照明。但是由于激光散斑的存在会导致光场不均匀。为此一种旋转全内反射显微系统(Ring-tirf)的发明用过旋转的方法均匀了照明光场，现在的实现旋转的方法有两种方法，如专利申请号为CN103597396A提出的振镜法和数字微镜(DMD)，但这两种方法都有自身存在的缺陷，振镜法无法避免角度震动，而数字微镜的方法会导致光能量的利用率比较低，只有5％左右。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，提高Tirf显微方法的照明均匀性和稳定性，提高激光的利用率至85％，同时使系统更加容易稳定控制，本发明提供了一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法与装置，利用自由曲面透镜和数字微镜实现均匀的全内反射显微照明。
本发明的具体技术方案如下：
一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法，包括以下步骤：
1)激光经由光纤导入系统，通过准直透镜成为平行光束，得到的平行光束透过偏振片和二分之一波片，形成线偏光，旋转二分之一波片可以改变偏振方向；
2)线偏光透过自由曲面透镜，自由曲面透镜能够使光聚焦成一个环；
3)透过自有曲面的光束照射到一偏振分光棱镜(PBS)，由于光束偏振方向可调，能够实现在PBS上全部反射；
4)经过PBS反射的光透过四分之一波片，四分之一波片快轴与光束偏振方向夹角45°，透过四分之一波片的光束聚焦到数字微镜(DMD)上，其中DMD处于自由曲面透镜的焦点处，被DMD反射的光再次透过四分之一波片照射到PBS上，由于四分之一波片的偏振矫正，光束能够完全透射PBS，透过PBS的光再通过四分之一波片变成圆偏光；
5)透过PBS的光透过变焦准直透镜，再透过二色镜照射到场镜上，所述DMD面位于准直透镜的后焦面上，准直透镜与场镜构成4f系统，经过场镜的光束聚焦在全反射物镜的后焦面上，全反射物镜与场镜构成4f系统，样品与样品容器的接触层(即全反射面)位于全反射物镜的前焦面上；
6)样品在激光的照射下发出荧光，荧光透过显微物镜和场镜照射到二色镜上，荧光被二色镜反射照射，再经过滤光片在成像系统(CCD)上成像；
本发明中，显微系统操作时，由于自由曲面透镜的作用，激光光束可以在DMD上聚焦成一“O”型纤细的环状光斑，通过控制DMD使一个“C”形区域的光能够反射到变焦准直透镜内，“C”形反射区域能够旋转，“C”形反射区域旋转一周的时间，CCD拍一张照片，得到的照片即为高均匀性、低能量损耗的全内反射图像。
本发明中，变焦准直透镜能够改变焦距，从而改变“C”形反射区域在全反射透镜后焦面上的投影大小，从而改变全反射角度的大小，进而改变投射深度，能够根据不同的样品调整照明深度，实现样品的选择照明以及图像的三维重构。
本发明还提供了一种基于自由曲面整形的全内反射显微装置，包括沿光路依次布置的：
线偏光发生模块，包括传导激光光束的光纤和准直透镜以及偏振片和二分之一波片，偏振片用于产生线偏光，二分之一波片用于改变偏振方向；
自由曲面光束聚焦模块，用于产生环状聚焦光的环状曲面透镜；
DMD数字扫描模块，包括沿光路设置的PBS、四分之一波片和DMD，经过自由曲面光束聚焦模块的线偏光会在PBS处全部反射，经过四分之一波片后变为圆偏光聚焦在DMD上，被DMD反射的光再一次通过四分之一波片，再次变成线偏光，线偏光穿过PBS，通过PBS的光再通过四分之一波片成为圆偏光；
光学放大传递模块，包括一焦距可调的准直透镜组和显微场镜，能够将DMD上的扫描形状，成像到Tirf显微物镜的后焦面上；
荧光成像模块，包括显微物镜、场镜、二色镜和CCD。
本发明的工作原理如下：
本发明的原理为利用夫琅禾费衍射定理，光衍射斑的互补原理，在传统的全反射显微镜中是用单个角度进行全反射透明，在本发明中是用一个有缺口的光环聚焦在显微物镜的后焦面上，当带缺口光环旋转时能够实现类似环状扫描全内反射显微镜相同的效果。具体实施过程中工作原理如下：
偏振光生成模块由光纤、准直透镜、偏振片、二分之一波片组成，偏振片的琼斯矩阵为θ为偏振片与x轴夹角，二分之一波片的琼斯矩阵为 为二分之一波片快轴与x轴夹角，因此可以通过改变二分之一波片的角度来改变光的偏振方向；
自由曲面聚焦模块，自由曲面设计为中心对称的环状聚焦透镜，以自由曲面为极轴建立极坐标系，其设计面型参数f(r,θ)满足r,θ分别为描述自由曲面形状的极坐标系参数，面型上点到极点的距离a,b为曲率调节系数，改变他们的值能够调整自由曲面聚焦的焦距；r0,z0为径向调节系数，用来改变自由曲面尺寸，调整在数字微镜反射面上聚焦光环的尺寸。
数字微镜反射模块，该模块由PBS、两块四分之一波片和DMD组成，PBS具有偏振选择性，从自由曲面聚焦模块出来的光再PBS处全部反射，反射光通过四分之一波片，再打到DMD上发生反射，DMD跟电脑相连，通过编程可以改变反射光的形状，反射光再次通过四分之一波片，再通过PBS，透射PBS的光再经过第二片四分之一波片。四分之一波片的琼斯矩阵为光两次通过第一片四分之一波片，光偏振方向变垂直，保证DMD反射的光能够在PBS处透射，透过PBS的光经过第二片四分之一波片，使光成为圆偏光。
光学放大传递模块，该模块由一可变焦距的透镜和显微场镜组成，设可变焦距透镜的焦距为f变，场镜焦距为f场，根据成像原理本模块能把DMD上的光斑像成像到全反射显微物镜的后焦面上，成像大小比为f场/f变，通过改变f变的大小，即可调整入射角度的大小，实现不同角度的全内反射照明。
荧光成像模块，包括全反射显微物镜、场镜、二色镜、滤光片和CCD，根据全内反射原理A为界面处光场强度，k1为样品中波矢大小，z为穿透深度，θ1为入射角度，n为介质折射率比，x为横向坐标，ω为光频。在全反射的情况下，只有反射面层的样品可以被激发，样品发出的荧光被显微物镜接收，经过场镜成像在CCD上，二色镜和滤光片保证了只有荧光信号会被接收到，且图像不会被激发光干扰。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、无机械振动模块，扫描更稳定，噪声更小；
2、激光能量利用率更高，成像视场更加均匀；
3、DMD控制控制扫描，角度更加准确，利于实现分层扫描与3D图像重建。
附图说明
图1为基于自由曲面整形的全内反射显微方装置的结构示意图；
图2为自由曲面透镜设计的面型及对平行光聚焦示意；
图3为DMD信号加载示意图。
具体实施方式
如图1所示，一种基于自由曲面整形的全内反射显微装置，包括：光纤激光器1、准直透镜2、偏振片3、二分之一波片4、自由曲面透镜5、偏振分光棱镜(PBS)6、四分之一波片7、数字微镜(DMD)8、可变焦距准直透镜9、四分之一波片10、二色镜11、显微场镜12、全内反射显微物镜13、样品14、滤光片15和CCD 16。
激光器1、准直透镜2、偏振片3、二分之一波片4和自由曲面透镜5中心放在同一光轴上，激光器1发出的激光经过准直透镜2成为平行光束，偏振片3使光束变成线偏光，二分之一波片4可以改变偏振光的偏振方向，自由曲面透镜5能将光束聚焦成环状光斑，如图2所示。
偏振分光棱镜(PBS)6、四分之一波片7、数字微镜(DMD)8、可变焦距准直透镜9、四分之一波片10、二色镜11、显微场镜12、全内反射显微物镜13和样品14放置在同一光轴上，透过自由曲面透镜5的光在偏振分光棱镜(PBS)6处能够全部反射，反射的光透过四分之一波片7，照射到数字微镜(DMD)8上，根据电脑编程，DMD8可以把选择区域的光沿原路反射回去，光透再次透过四分之一波片7照射到偏振分光棱镜(PBS)6上，由于两次透过四分之一波片7，光的偏振方向变垂直，所以光可以全部投射偏振分光棱镜(PBS)6；透过偏振分光棱镜(PBS)6的激光依次经过可变焦距透镜9、四分之一波片10、二色镜11、显微场镜12和全内反射显微物镜13照射到样品14上，其中数字微镜(DMD)8位于自由曲面透镜5的前焦面上，可变焦距透镜9、显微场镜12和全内反射显微物镜依次构成4f系统，数字微镜(DMD)8同时也位于可变焦距透镜9的前焦面上，样品位于全内反射显微物镜13的前焦面上，可变焦距透镜9与显微场镜12能够把数字微镜(DMD)8上反射的光斑成像到全内反射显微物镜13的后焦面上。
样品14在激光的激发下能发出荧光，荧光被全内反射显微物镜13收集，经显微场镜12聚焦，二色镜11反射，滤光片15滤光在CCD上成像。
采用图1所示的装置，实现基于自由曲面整形的数字微镜环状扫描全内反射显微方法，其过程如下：
(1)激光器1发出激光被准直透镜2准直，再经过偏振片3和二分之一波片4，激光变成偏振方向可以随意改变的线偏光；
(2)线偏光被自由曲面透镜5聚焦，自由曲面透镜5能将平行光束聚焦成环状光斑，光束镜偏振分光棱镜(PBS)6反射，透过四分之一波片7照射数字微镜(DMD)8上，数字微镜(DMD)8位于自由曲面透镜5的前焦面上，计算机控制数字微镜(DMD)8将选择区域的光沿原路范围，计算机施加到数字微镜(DMD)8上的形状如图3所示，但不局限于这种图案；
(3)被数字微镜(DMD)8反射的光再次透过四分之一波片7偏振方向变为与原来线偏光垂直方向的偏振光，因此第二次透过四分之一波片7的光能够透射偏振分光棱镜(PBS)6，透过偏振分光棱镜(PBS)6的激光经过可变焦距准直透镜9，成为环状平行光束，然后光束再透过四分之一波片10，线偏光变为圆偏光，以保证光在全反射时倏逝场在所有径向角度有相同的强度，透过四分之一波片的光能透过二色镜11，再被显微场镜12聚焦在全内反射显微物镜13的后焦面上，通过改变可变焦距准直透镜9的焦距可以改变聚焦在全内反射显微物镜13后焦面上光斑的大小，可以改变光的入射角，从而改变照明的深度。
(4)样品14被激光激发，发出的荧光被全内反射显微物镜13收集，然后被显微场镜12聚焦，经过二色镜11和滤光片15成像在CCD 16上。在CCD曝光时间里，电脑控制数字微镜(DMD)8上的图案扫描一个周期，即可以得到基于自由曲面整形的数字微镜环状扫描全内反射显微成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于自由曲面整形的全内反射显微装置，其特征在于，包括光源以及沿光路依次布置的：
线偏光发生模块，用于将光源发出的光束转换为线偏光；
自由曲面聚焦模块，用于将所述的线偏光转换为环状聚焦光；
数字微镜反射模块，用于选择区域反射所述的环状聚焦光；
光学放大传递模块，用于实现光束的全内反射照明；
荧光成像模块，用于激发样品发出荧光并收集荧光信号图像。
2.如权利要求1所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述的线偏光发生模块包括用于产生线偏光的偏振片和用于改变偏振方向的二分之一波片。
3.如权利要求1所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述自由曲面聚焦模块为自由曲面呈中心对称分布的环状聚焦透镜。
4.如权利要求3所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述自由曲面的其设计面型参数满足：
其中分别为描述自由曲面形状的极坐标系参数，a,b为曲率调节系数，r0,z0为径向调节系数。
5.如权利要求1所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述的数字微镜反射模块包括沿光路设置的偏振分光棱镜、第一四分之一波片、数字微镜和第二四分之一波片；
所述的偏振分光棱镜，用于反射自由曲面聚焦模块的出射光束，以及透射数字微镜的反射光束；
所述的第一四分之一波片，用于保持两次通过的光束在偏振分光棱镜处透射；
所述的数字微镜，用于依次选取不同的区域反射所述的环状聚焦光；
所述的第二四分之一波片，用于使透射偏振分光棱镜的光成为圆偏光。
6.如权利要求1所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述的荧光成像模块包括用于光束照射样品并激发荧光的全反射显微物镜，以及用于荧光信号成像的CCD。
7.如权利要求1所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述的光学放大传递模块包括可变焦距透镜和显微场镜，所述的可变焦距透镜用于将数字微镜反射模块出射的光束成像到显微物镜的后焦面上，并通过改变焦距实现不同角度的全内反射照明。
8.一种基于权利要求1～7任一项所述全内反射显微装置的全内反射显微方法，其特征在于，包括步骤：
1)光束经准直后经过偏振片和二分之一波片，成为线偏光；
2)利用自由曲面聚焦模块将所述的线偏光聚焦成环状光斑；
3)通过数字微镜反射模块区域反射所述的环状光斑，并利用四分之一波片使光成为圆偏光；
4)利用光学放大传递模块实现光束的全内反射照明；
5)光束经荧光成像模块激发样品发出荧光并收集荧光信号图像。
9.如权利要求8所述的全内反射显微方法，其特征在于，所述的数字微镜反射模块具有反射环状光斑的C形反射区，所述的C形反射区绕环状光斑的中心一周拍摄一张全内反射图像。
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