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Die
Erfindung betrifft eine Anordnung zum Untersuchen oder/und Manipulieren
einer auf einem Probenträger angeordneten Probe, umfassend
eine erste Vorrichtung zum Untersuchen oder/und Manipulieren der
Probe mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung, welche auf der von
der Probe abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet
und mit einem Objektiv versehen ist, wobei zwischen dem Objektiv
und dem Probenträger eine Flüssigkeit vorgesehen
ist, eine zweite Vorrichtung zum Untersuchen oder/und Manipulieren
der Probe, welche auf der die Probe tragenden Seite des Probenträgers
angeordnet ist und eine wesentlich größere Ortsauflösung aufweist
als die erste Vorrichtung, und einen Rahmen, an dem der Probenträger
befestigt ist.
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Es
sei bereits an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „Manipulieren"
nicht nur eine körperliche Veränderung der Probe
verstanden wird, sondern auch eine berührungslose Einwirkung
auf die Probe, durch welche die Probe in wenigstens einer ihrer
Eigenschaften verändert wird. Unter dem Begriff „Untersuchen"
wird hingegen eine Einwirkung auf die Probe verstanden, welche die Probe
in ihren Eigenschaften unverändert lässt, jedoch
Informationen über diese Eigenschaften liefert.
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Die
Kombination der optischen Mikroskopie und der Rastersondenmikroskopie
SPM (SPM – Scanning probe microscopy) zur Untersuchung
und Manipulation von Proben auf kleiner Längenskala bringt
zahlreiche Vorteile mit sich, da sich die Stärken beider
Methoden ergänzen. In der optischen Mikroskopie ist es
dank moderner CCD-Technik (CCD – Charge coupled device)
möglich, Prozesse mit hoher Geschwindigkeit aufzunehmen,
auch wenn nur wenige Photonen von der Probe ausgehen. Die Ortsauflösung
liegt dabei im Allgemeinen in der Größenordnung
der Wellenlänge des verwendeten Lichts. Hingegen kann mit
der Rastersondenmikroskopie eine Probe mit erheblich größerer
Ortsauflösung, insbesondere mit atomarer Auflösung,
untersucht werden, jedoch nur mit vergleichsweise geringer Geschwindigkeit.
Daher ist die Kombination beider Techniken vorteilhaft.
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Aus
der
EP 0 701 102 B1 ist
eine gattungsgemäße Anordnung bekannt, bei der
die erste Vorrichtung zum Untersuchen oder/und Manipulieren der
Probe mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung von einem optischen
Nahfeld-Rastermikroskop gebildet, auch SNOM genannt (SNOM – scanning
nearfield optical microscope), während die zweite Vorrichtung,
welche eine wesentlich größere Ortsauflösung aufweist
als die erste Vorrichtung, von einem Rasterkraftmikroskop AFM (AFM – atomic
force microscope) gebildet ist. Bei der bekannten Anordnung ist
der Probenträger, auf dem die Probe angeordnet ist, auf eine
Linse aufgesetzt, welche einen Teil der Abbildungsoptik der ersten
Vorrichtung bildet. Diese Linse hat den Zweck, möglichst
viel Licht zur Probe zu leiten und möglichst viel Licht
von der Probe wieder aufzufangen. Problematisch ist dabei jedoch,
dass beim Probenwechsel die Gefahr eines Verkratzens der Linse besteht.
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Daher
sind die derzeit auf dem Markt erhältlichen gattungsgemäßen
Anordnungen mit einem Ölimmersions-Mikroskop ausgestattet,
bei welchem der Raum zwischen dem Objektiv der ersten Vorrichtung
und dem Probenträger mit einem Immersionsöl gefüllt
ist, um eine vergleichbare numerische Apertur sicherstellen zu können.
In der Praxis hat sich aber gezeigt, dass auch geringste Bewegungen
des Objektivs, wie sie beispielsweise zum Fokussieren auf die Probe
erforderlich sind, zu Schwingungen führen, die sich über
das Immersionsöl auf dem Probenträger und damit
auf die Probe übertragen. Hierdurch wird das gleichzeitige
Untersuchen oder/und Manipulieren der Probe mittels der zweiten
Vorrichtung, die eine wesentlich größere Ortsauflösung
aufweist als die erste Vorrichtung, erschwert. Ja es kann sogar vorkommen,
dass die vom Objektiv ausgehenden Schwingungen so stark sind, dass
das gleichzeitige Untersuchen oder/und Manipulieren der Probe mittels
der zweiten Vorrichtung unmöglich wird.
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Lediglich
der Vollständigkeit halber sei zum Stand der Technik ferner
auf die
WO 02/067037
A2 , die
WO
2006/048683 A1 und die
EP 0 527 448 B1 hingewiesen.
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Demgegenüber
ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung der gattungsgemäßen
Art anzugeben, bei welcher die Probe mechanisch weitestgehend von
Bewegungen zur Fokussierung der ersten Vorrichtung zum Untersuchen oder/und
Manipulieren der Probe mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung entkoppelt
ist.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine gattungsgemäße
Anordnung gelöst, bei welcher das Objektiv mit dem Rahmen
in einer zur Oberfläche des Probenträgers im Wesentlichen
orthogonal verlaufenden Richtung im Wesentlichen unbeweglich verbunden
ist, und bei welcher eine von dem Objektiv mechanisch entkoppelte
Fokussierungsoptik vorgesehen ist, mit deren Hilfe die elektromagnetische Strahlung
auf die Probe fokussierbar ist.
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Aufgrund
der erfindungsgemäßen Anordnung sind mit dem Rahmen,
an dem der Probenträger befestigt ist, lediglich solche
Teile der Optik der ersten Vorrichtung verbunden, welche relativ
zu dem Rahmen nicht bewegt werden müssen. Sämtliche Teile
der Optik der ersten Vorrichtung, welche relativ zu dem Rahmen bewegt
werden müssen, insbesondere deren Fokussierungsoptik, sind
hingegen vom Objektiv und damit auch vom Rahmen mechanisch entkoppelt
angeordnet, so dass von ihnen ausgehende Schwingungen sich nicht
auf den Rahmen übertragen können. Und dies selbst
dann nicht, wenn zwischen dem Probenträger und dem Objektiv
ein Immersionsöl vorgesehen ist.
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Wie
dies an sich bekannt ist, kann die erste Vorrichtung ein optisches
Mikroskop sein, welches beispielsweise in invertierter Anordnung
vorgesehen sein kann, d. h. das Objektiv befindet sich üblicherweise
unterhalb des Probenträgers. Da derartige Mikroskope, insbesondere
dann, wenn sie zur elektronischen Datenerfassung ausgelegt sind, über
eine entsprechende ortsauflösende Sensorik verfügen, beispielsweise
einen CCD-Chip, kann die elektromagnetische Strahlung dem infraroten
oder/und dem sichtbaren oder/und dem ultravioletten Spektralbereich
entstammen.
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Die
zweite Vorrichtung kann beispielsweise ein Rasterkraftmikroskop
AFM, ein Rastertunnelmikroskop STM (STM – Scanning tunneling
microscope), ein nahfeldoptisches Mikroskop SNOM oder ein anderes
Rastersondenmikroskop SPM sein.
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Schließlich
wird in Weiterbildung der Erfindung vorgeschlagen, dass die Fokussierungsoptik eine
Autofokussierungseinrichtung umfasst, welche beispielsweise eine
Einheit zur Bestimmung der Position eines totalreflektierten Strahls
der elektromagnetischen Strahlung oder einer ausschließlich
zum Zwecke der Fokussierung eingesetzten weiteren elektromagnetischen
Strahlung umfasst, sowie eine Stelleinheit zur Beeinflussung der
Lage einer Korrekturlinse bzw. Korrekturoptik. Dabei kann die Einheit zur
Bestimmung der Position eines total reflektierten Strahls eine Quadranten-Fotodiode
oder einen CCD-Chip umfassen. Der total reflektierte Strahl kann
von einem Laserstrahl gebildet sein, wie er beispielsweise in der
Fluoreszenz-Mikroskopie zur Anregung der Probe verwendet wird. Grundsätzlich
ist es jedoch auch möglich, dass die weitere elektromagnetische
Strahlung von einem zusätzlich vorgesehenen Laser emittiert
wird, vorzugsweise einem Infrarot-Laser.
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Die
Erfindung wird im Folgenden an einem Ausführungsbeispiel
anhand der Zeichnung näher erläutert werden. Es
stellt dar:
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1 eine
schematische Darstellung des Aufbaus einer erfindungsgemäßen
Anordnung zum Untersuchen oder/und Manipulieren einer Probe; und
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2 eine
vergrößerte Darstellung des Details A aus 1.
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In 1 ist
eine erfindungsgemäe Anordnung allgemein mit 10 bezeichnet.
Sie umfasst einen Rahmen 12, an dem ein Probenträger 14 für
eine Probe 16 in einer nachfolgend noch näher
zu erläuternden Weise befestigt ist. Die erfindungsgemäße Anordnung
umfasst ferner eine erste Vorrichtung 18 zum Untersuchen
oder/und Manipulieren der Probe 16 mit Hilfe elektromagnetischer
Strahlung, welche auf einer von der Probe 16 abgewandten
Seite 14a (s. 2) des Probenträgers 14 und
damit in dem dargestellten Ausführungsbeispiel unterhalb
des Probenträgers 14 angeordnet ist. In dem Ausführungsbeispiel
gemäß 1 ist die erste Vorrichtung
von einem Fluoreszenz-Mikroskop gebildet, auf dessen Aufbau weiter
unten noch näher eingegangen werden wird. Schließlich
ist auf der die Probe 16 tragenden Seite 14b (s. 2)
des Probenträgers 14, d. h. im dargestellten Ausführungsbeispiel
oberhalb des Probenträgers 14, eine zweite Vorrichtung 20 zum Untersuchen
oder/und Manipulieren der Probe vorgesehen, welche eine wesentlich
größere Ortsauflösung aufweist als die
erste Vorrichtung 18. In dem Ausführungsbeispiel
gemäß 1 ist die zweite Vorrichtung 20 von
einem Rasterkraftmikroskop AFM gebildet, dessen Aufbau nachfolgend
noch näher erläutert werden wird.
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Bezeichnet
man in 1 die durch den Doppelfpfeil Z angedeutete Richtung
als die Höhenrichtung der Anordnung 10, so ist
ein Objektiv 22 der ersten Vorrichtung 18 erfindungsgemäß in
dieser Höhenrichtung Z im Wesentlichen unbeweglich, vorzugsweise
starr, mit dem Rahmen 12 verbunden, während eine
Fokussierungsoptik 24 der ersten Vorrichtung 18 an
einem von dem Rahmen 12 mechanisch entkoppelten Ort vorgesehen
ist. Auf diese Weise können sich von der Fokussierung der
ersten Vorrichtung 18 ausgehende Schwingungen nicht auf das
Objektiv 22 und von dort über das Immersionsöl 26
weiter zum Probenträger 14 und zur Probe 16 hin ausbreiten.
Dies ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung der Probe 16 mittels
der ersten Vorrichtung 18 und der zweiten Vorrichtung 20.
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Wie
in 2 besser erkennbar ist, ist der Probenträger 14 von
einem Deckglas gebildet, wie es in der Mikroskopie üblicherweise
verwendet wird. Dieses Deckglas 14 ist an einer Petrischale 28 befestigt,
welche an der entsprechenden Stelle ein Loch aufweist. Die Petrischale 28 ist
ihrerseits in einen Probenhalter 30 eingesetzt, der an
dem Rahmen 12 über Magnete 32 gehalten
ist.
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Die
als Fluoreszenz-Mikroskop ausgebildete erste Vorrichtung 18 umfasst
einen Laser 36, dessen in 1 gestrichelt
dargestellter Laserstrahl 38 über einen Halbspiegel 40 und
das Objektiv 22 zur Probe 16 gelenkt wird. Wie
in 2 erkennbar, wird der Laserstrahl 38 am
Probenträger 14 total reflektiert, wobei ein Teil
des evaneszenten Feldes des Laserstrahls 38 in die Probe 16 einkoppelt
und diese zur Fluoreszenz anregt. Der total reflektierte Laserstrahl 38' kehrt über
den Halbspiegel 40 zu einer Quadranten-Fotodiode 42 zurück,
welche zur Bestimmung der Position des reflektierten Laserstrahls 38' eingesetzt
wird. Aus der ermittelten Position des total reflektierten Laserstrahls 38' auf
der Quadranten-Fotodiode 42 bestimmt ein Rechner 44 den
Fokussierungsgrad und gibt an eine durch den Doppelpfeils S angedeutete
Stelleinheit der Fokussierungsoptik 24 ein Stellsignal
aus, in Folge dessen die Fokussierungsoptik 24 in dem für
eine optimale Fokussierung erforderlichen Maße in Höhenrichtung
Z verstellt wird. Das von der Probe 16 ausgehende Fluoreszenzlicht 46,
das in 1 gepunktet dargestellt ist, wird vom Objektiv 22 zu
einer Bilderfassungssensorik 48 geleitet. Dabei durchsetzt
es den Halbspiegel 40, ein Breitbandfilter 50,
ein Wärmeschutzfilter 52 und die Fokussierungsoptik 24.
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Die
als Rasterkraftmikroskop AFM ausgebildete zweite Vorrichtung 20 umfasst
einen die Probe 16 abtastenden Hebelarm 56, in
der Fachsprache auch „cantilever" genannt, der an der Spitze
eines aus Plexiglas gefertigten Kegelstumpfs 58 befestigt ist.
Zwischen dem Kegelstumpf 58 und dem Probenträger 14 kann
eine Flüssigkeit 59 vorgesehen sein, beispielsweise
eine Nährflüssigkeit, so dass auch lebende Proben 16,
beispielsweise lebende Zellen, untersucht werden können.
Der Abstand des Cantilevers 56 von der Oberfläche
der Probe 16 wird mittels einer XY-Piezoeinheit 60 und
einer Z-Piezoeinheit 62 derart geregelt, dass die Kraft
zwischen dem Cantilever 56 und der Oberfläche
der Probe 16 konstant gehalten wird. Die Position des Canitlevers 56 wird
dabei mittels eines von einem Laser 64 emittierten Laserstrahls 66 detektiert,
der vom Cantilever 56 reflektiert und von einer weiteren
Quadranten-Fotodiode 68 hinsichtlich seiner Position auf
derselben erfasst wird.
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Festzuhalten
ist, dass sowohl die erste Vorrichtung 18 als auch die
zweite Vorrichtung 20 neben den beschriebenen Feinpositionierungseinrichtungen
auch über (nicht dargestellte) Grobpositionierungseinrichtungen
verfügen. Diese sind aber im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung nicht von Bedeutung, da die Grobpositonierung vor Beginn der
eigentlichen Messung abgeschlossen ist und daher von den Grobpositionierungseinrichtungen
während der Messung keine Schwingungen mehr ausgehen. Ebenso
kann die erste Vorrichtung 18 nicht nur ein einziges Objektiv 22 umfassen,
sondern kann auch über eine Mehrzahl derartiger Objektive
verfügen, welche beispielsweise in einem Objektivrevolver angeordnet
sein können. Während der laufenden Messung wird
dieser Objektivrevolver aber nicht bewegt, so dass das Objektiv
zumindest in Höhenrichtung Z im Wesentlichen unbeweglich,
vorzugsweise insgesamt starr, mit dem Rahmen verbunden ist.
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Nachzutragen
ist noch, dass anstelle der Quadranten-Fotodioden 42 und 68 jeweils
auch ein CCD-Chip verwendet werden kann.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 0701102
B1 [0004]
- - WO 02/067037 A2 [0006]
- - WO 2006/048683 A1 [0006]
- - EP 0527448 B1 [0006]