DE19604363A1 - Zusatzmodul zur ortsaufgelösten Fokusvermessung - Google Patents

Description

In einigen Anwendungsgebieten der Mikroskopie ist es wünschens­ wert, möglichst exakte Informationen über die räumliche Intensitätsverteilung des Lichts im Fokus des Mikroskop­ objektivs zu erhalten. Ein solches Anwendungsgebiet ist beispielsweise die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, die ausführlich in der WO 94/16313 beschrieben ist. Bei der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie werden in dem sehr kleinen Volumen des Laserfokus vereinzelt auftretende Fluoreszenz-Ereignisse mit einem konfokalen Detektor detektiert. Bei diesem Meßverfahren kommt es sehr kritisch sowohl auf die Größe und Form des Beleuchtungsvolumens, das durch den Laserfokus in der Probe definiert ist, als auch auf Größe und Form des Detektionsvolumens an, das durch den optischen Pfad des konfokalen Detektors definiert ist. Dabei ist auch die Lage des Detektionsvolumens relativ zum Beleuchtungsvolumen von Bedeutung. Die Bestimmung der Volumina erfolgt häufig rein rechnerisch anhand der optischen Daten der im Strahlengang angeordneten Komponenten. Dafür müssen jedoch die optischen Daten und die Abstände aller Komponenten bekannt sein, was häufig nicht der Fall ist.

In Journal of Microscopy, Vol. 117, Seiten 219-232 (1979) ist ein Verfahren zur Bestimmung der Punktübertragungsfunktion eines konfokalen Mikroskops beschrieben, bei dem eine als Objekt dienende Lochblende in unterschiedlichen Ebenen entlang der optischen Achse durch den Laserfokus bewegt und ortsauf­ gelöst die auf den konfokalen Detektor fallende Lichtintensität gemessen wird. Zur Anwendung dieses Verfahrens ist jedoch ein entsprechend fein in den drei Raumrichtungen verstellbarer Objekttisch für das Mikroskop erforderlich. Außerdem können die Meßergebnisse sehr leicht durch Abbildungsfehler im Detektions- Strahlengang verfälscht werden.

Aus der EP-A2-0 487 233 ist es darüberhinaus bei optischen Nahfeldmikroskopen bekannt, ein mikroskopisches Objekt mit der scharfen Spitze einer ausgezogenen Glasfaser abzutasten. Für die Abtastbewegung ist dazu die Glasfaserspitze in einem piezoelektrischen Röhrchenscanner aufgenommen, der eine Bewegung der Glasfaserspitze in drei zueinander senkrechten Raumrichtungen gestattet. Die Bilderzeugung kann dabei auf zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen: entweder wird das Objekt beleuchtet und das in die Glasfaser eingekoppelte Licht detektiert und zur Bilderzeugung verwendet oder es wird das Objekt über die Glasfaser beleuchtet und das von einem Mikroskopobjektiv aufgesammelte Licht zur Bilderzeugung verwendet. Hinweise auf die ortsaufgelöste Vermessung eines Fokus sind in dieser Schrift jedoch nicht enthalten.

Die vorliegende Erfindung soll ein einfaches und preiswertes Zusatzmodul für Mikroskope schaffen, mit dem eine ortsaufge­ löste Vermessung des von einem Mikroskopobjektiv erzeugten Fokus möglich ist. Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch ein Zusatzmodul mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der abhängigen Ansprüche.

Die Erfindung soll darüber hinaus Verfahren zur Vermessung von Beleuchtungs- und/oder Detektionsvolumina oder der Punktbildübertragungsfunktion von Mikroskopen oder anderen optischen Abbildungssystemen angeben. Diese Ziele werden durch Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 11-13 gelöst.

Die vorliegende Erfindung erlaubt insbesondere auch dann die Vermessung eines von einem Mikroskopobjektiv erzeugten Laser­ fokus, wenn sich dieser in einer Flüssigkeit und/oder nahe an einem Deckglas, auch mit zwischengeschalteter Immersions­ flüssigkeit, befindet. Es können somit Foki unter realistischen Bedingungen mit den bei der Bildgebung vorgesehenen Medien vermessen werden.

Das erfindungsgemäße Zusatzmodul umfaßt einen Träger, der zum An- oder Aufsetzen auf den Objekttisch eines Mikroskopes aus­ gebildet ist. An diesem Träger ist eine Positioniereinheit, die eine Feinpositionierung in drei zueinander senkrechten Raum­ richtungen relativ zum Träger gestattet und an dieser Positioniereinheit ist eine optische Nahfeldsonde angeordnet. Ein Beispiel dafür ist eine Glasfaser mit einer ausgezogenen Spitze an einem Ende und einem Lichtdetektor am anderen Ende oder eine Glasfaser mit einer ausgezogenen Spitze an einem Ende und einer Adaptiermöglichkeit für einen Lichtdetektor am anderen Ende. Letzteres Beispiel liefert den Vorteil, daß anstelle des Lichtdetektors alternativ eine Glasfaserbeleuchtung an das Zusatzmodul anschließbar ist. Das Zusatzmodul kann dann auch als punktförmige Lichtquelle, beispielsweise zur Vermessung des Detektionsvolumens, eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Zusatzmodul hat einen sehr einfachen Aufbau und kann an oder auf einem bereits vorhandenen Mikroskoptisch adaptiert werden. Die optische Nahfeldsonde bzw. die Spitze der Glasfaser wird in den Fokus des Mikroskop­ objektivs gebracht und anschließend mit der Positioniereinheit durch den Laserfokus bewegt. Das an der jeweiligen Position innerhalb des Fokus mit dem Lichtdetektor detektierte Licht wird aufgezeichnet und entsprechend der Bewegung der Faser­ spitze in Form eines zwei- oder dreidimensionalen Datenfeldes in einem Computer abgelegt. Von diesem Datensatz können dann beliebige ein-, zwei- oder dreidimensionale Schnitte oder der ganze Datensatz nachfolgend auf einem Monitor dargestellt oder zur Berechnung des Fokusvolumens herangezogen werden.

Die vorliegende Erfindung greift auf die bisherigen, positiven Erfahrungen mit spitz zu laufenden Glasfasern in der optischen Nahfeldmikroskopie zurück. Dabei wird insbesondere ausgenutzt, daß die Glasfaserspitze eine sehr kleine Apertur von nur einigen 10 nm hat und jeweils nur das Licht aus einem entsprechend kleinen Aperturbereich in die Glasfaserspitze eingekoppelt wird und zum Detektor gelangt. Da ohnehin nur das in die Glasfaser eingekoppelte Licht detektiert werden kann, können sich hier auch keine Abbildungsfehler negativ auswirken. Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird aller­ dings auf jegliche Zwischenschaltung einer abbildenden Optik zwischen der Glasfaserspitze und dem Lichtdetektor verzichtet, was wiederum den Aufwand reduziert.

Der Träger des erfindungsgemäßen Zusatzmoduls kann eine Basis­ platte aufweisen, zu der die optische Achse des Mikroskop­ objektivs und auch der Glasfaser im wesentlichen senkrecht steht und die eine zur optischen Achse in der Mittenstellung der Positioniereinheit koaxiale Markierung aufweist. Die Basis­ platte kann dabei insbesondere die Abmessungen eines konven­ tionellen Objektträgers haben, so daß das Zusatzmodul mit einem konventionellen Objekthalter auf dem Objekttisch des Mikroskopes festklemmbar ist. Die konzentrische Markierung dient dabei zur einfachen, groben Positionierung des Zusatz­ moduls relativ zum Fokus des Mikroskopobjektivs. Bei einer Basisplatte aus Glas oder einem anderen transparenten Material können die Markierungen in die Basisplatte eingeritzte Linien sein.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Basisplatte ein hindurchgehendes Loch aufweist. Mittels der Positioniereinheit kann dann die optische Nahfeldsonde bzw. die Glasfaserspitze in dieses Loch gefahren werden, so daß die Vermessung des Fokus in dem Loch erfolgt und die Basisplatte demzufolge den Fokus nicht verfälschen kann.

Soll ein Fokus nach dem Durchgang durch ein Deckgläschen vermessen werden, so läßt sich dieses von unten an der Basis­ platte anbringen. Mittels der Positioniereinheit kann hier die Sonde auf den gewünschten Abstand zum Deckgläschen gefahren werden. Zwischen Deckgläschen und Objektiv kann Immersions­ flüssigkeit eingebracht werden. Zur Vermessung des Fokus direkt in einer Flüssigkeit kann diese auf das Deckgläschen in das Loch mit der Sonde gebracht werden.

Zusätzlich zu der Positioniereinheit sollten noch Mittel zur Grobpositionierung der optischen Nahfeldsonde in Richtung der optischen Achse des Mikroskopobjektivs, bzw. zugleich der Achse der Glasfaser, vorgesehen sein. Um eine solche Grobpositio­ nierung zu ermöglichen, kann der Träger aus einer Basisplatte und zwei Hülsen bestehen, wobei die eine Hülse an der Basis­ platte befestigt ist und die Positioniereinheit an der zweiten Hülse angeordnet ist. Durch Mittel zum axialen Verschieben, z. B. mit Gewinden, der beiden Hülsen gegeneinander ist dann die Grobpositionierung realisierbar.

Bei einem weiterhin vorteilhaften Ausführungsbeispiel weist der Träger zusätzlich Leuchtmittel, beispielsweise Leuchtdioden, zur-Beleuchtung der optischen Nahfeldsonde, insbesondere der Spitze der Glasfaser auf. Dadurch kann die Sonde leichter in den Tiefenschärfebereich des Mikroskopobjektivs gebracht werden, indem bei Einblick in die Mikroskopokulare auf die Sonde scharf gestellt wird.

Bei einem einfachen Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Zusatzmoduls ist die Bewegung der Positioniereinheit einfach über die an die Positioniereinheit angelegten Strom- oder Spannungssignale kalibriert. Um jedoch höheren Genauigkeits- Anforderungen zu genügen, können statt dessen am Träger des Zusatzmoduls kapazitive, induktive oder optische Abstandssensoren vorgesehen sein.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele näher erläutert. Dabei zeigen:

Fig. 1 eine Prinzipskizze eines inversen Mikroskops mit einem erfindungsgemäßen Zusatzmodul,

Fig. 2 eine vergrößerte Schnittdarstellung des erfindungs­ gemäßen Zusatzmoduls, und

Fig. 3 eine vergrößerte Schnittdarstellung eines alternativen Ausführungsbeispieles für ein Zusatzmodul.

In der Fig. 1 ist mit (1) ein konventionelles inverses Mikroskop, beispielsweise das Axiovert der Anmelderin, bezeichnet. Der konkrete optische Aufbau des Mikroskops (1) ist beispielsweise in der DE-A-39 38 413 beschrieben, auf die deshalb bezüglich des Aufbaus verwiesen sei.

Oberhalb des in den Strahlengang eingeschalteten Objektivs (4) ist der Objekttisch (6) angeordnet, auf dem das erfindungs­ gemäße Zusatzmodul (7) positioniert ist. Zum Halten des Zusatz­ moduls (7) auf dem Objekttisch (6) dient dabei der nicht eingezeichnete, konventionelle Objekthalter.

Mit (2) ist ein konventioneller Laser bezeichnet, dessen Laser­ strahl an der Rückseite des Mikroskops in den mikroskopischen Strahlengang eingekoppelt ist. Der Laserstrahl wird dabei zunächst soweit aufgeweitet, daß er nach Umlenkung am Teil­ spiegel (5) die Pupille des Objektivs (4) ausfüllt. Durch das Objektiv (4) wird der Laserstrahl beugungsbegrenzt fokussiert.

Zur Vermessung des Laserfokus wird dieser mit der optischen Nahfeldsonde in mehreren zur optischen Achse des Mikroskop­ objektivs (4) senkrechten Ebenen abgetastet und die jeweils detektierten Signalintensitäten ermittelt und aufgezeichnet. Die Steuerung der Bewegung der Sonde (Glasfaserspitze 13a), die Meßwerterfassung und die Meßwertdarstellung erfolgt mittels eines Computers (21) über ein spezielles Interface (19). Die ortsaufgelöst gemessenen Intensitätswerte werden als ein 3D- Datenfeld in einem Speicher (20) des Rechners (21) abgelegt. Über ein entsprechendes Graphik-Programm und eine spezielle Auswerte-Software können beliebige ein- oder zweidimensionale Schnitte durch das 3D-Datenfeld auf einem Monitor dargestellt werden. Außerdem ist es auch möglich, das gesamte Datenfeld beispielsweise in Falschfarben-Darstellung auf dem Monitor darzustellen. Eine weitere spezielle Auswerte-Software ermöglicht es, das Volumen des Laserfokus zu berechnen, indem beispielsweise das von denjenigen Meßpunkten eingeschlossene Volumen berechnet wird, in denen der Meßwert mehr als einen vorbestimmten Anteil, beispielsweise etwa 1/e², des maximalen Intensitätssignals aufweist.

Hinsichtlich des detaillierten Aufbaus des erfindungsgemäßen Zusatzmoduls sei auf die Fig. 2 verwiesen. Der Träger des Zusatzmoduls (7) besteht aus einer Trägerplatte (8) und zwei zylindrischen Bauteilen (9, 10). Die Trägerplatte (8) ist z. B. aus Glas oder Metall und stimmt bezüglich ihrer Abmessungen mit einem Standard-Objektträger mit Kantenlängen von rund 76 mm x 26 mm × 1 mm überein. Etwa in der Mitte weist die Trägerplatte (8) auf der vom Objektiv (4) abgewandten Seite eine Vertiefung (8a) und in der Mitte dieser Vertiefung ein durch die Basisplatte (8) hindurchgehendes Loch (8b) mit einem Durchmesser von 1 mm auf. Das Objektiv (4) und der vom Objektiv (4) fokussierte Laserstrahl sind in der Fig. 2 gestrichelt angedeutet, da diese nicht Bestandteil des Zusatzmoduls sind.

Koaxial zum Loch (8b) ist das erste zylindrische Bauteil (9) lösbar an der Basisplatte (8) befestigt. Durch Abnehmen des Bauteils (9) von der Basisplatte (8) läßt sich leicht das Loch (8b) mit Flüssigkeit (32) füllen oder von dieser reinigen. Das zweite zylindrische Teil (10) ist mit dem ersten zylindrischen Teil (9) mittels eines Feingewindes axial verstellbar verbunden. Dadurch kann das zweite zylindrische Teil (10) relativ zum ersten zylindrischen Teil (9) verdreht und dabei gleichzeitig mehr oder minder im ersten zylindrischen Teil versenkt werden. Dies ist eine stark vereinfachte Lösung. Andere axiale Stellantriebe und Führungen stehen dem Fachmann zahlreich zur Verfügung. Am zweiten zylindrischen Teil (10) ist über einen Aufnahmering (11) der piezoelektrische Röhrchenscanner (12) aufgenommen. Der piezoelektrische Röhr­ chenscanner (12) besteht in bekannter Weise aus mehreren separat ansteuerbaren Elektroden an der Außenseite des piezoelektrischen Röhrchens. Je nachdem an welche dieser Segmente eine Hochspannung angelegt wird, wird der Röhrchenscanner derart verformt, daß die Spitze (12a) sich in drei zueinander senkrechten Raumrichtungen bewegen kann. Innerhalb des Röhrchenscanners ist eine Glasfaser (13) mit einer scharfen, ausgezogenen Spitze an dem objektivseitigen Ende (13a) angeordnet. Diese bildet eine bekannte optische Nahfeldsonde. Andere Beispiele sind bekannt, z. B. metallbedampfte Siliziumnitrid-Bruchspitzen. Eine Photodiode (14) als Lichtdetektor ist an dem entgegengesetzten Ende angeordnet. Sie kann sich im Zusatzmodul oder auch außerhalb befinden, dann dient die Faser auch als Signalleitung und die Photodiode ist im Interface (19) untergebracht. Bei einer Bewegung des vorderen Endes des Röhrchenscanners (12a) folgt die Spitze (13a) der Glasfaser (13) der Bewegung des Röhrchenscanners und führt dementsprechend ebenso wie das vordere Ende (12a) des Röhrchenscanners (12) je nach angelegter Spannung eine Bewegung in drei zueinander senkrechten Raumrichtungen aus. Für die Kalibrierung der Bewegung des Röhrchenscanners (12) sind am zweiten zylindrischen Teil (10) Positionsdetektoren (18a, 18b) vorgesehen. Der Positionsdetektor (18b) mißt dabei die Auslenkung des Röhrchenscanners (12) entlang der Achse der Faser (13) und der Positionsdetektor (18a) mißt die Position der Spitze (12a) des Röhrchenscanners (12) in einer zur Achse der Glasfaser (13) senkrechten Richtung. Ein dritter Positionsdetektor, der die Auslenkung senkrecht zur Zeichenebene in Fig. 2 mißt, ist nicht eingezeichnet.

Am ersten zylindrischen Teil (9) sind noch zwei Leuchtdioden (17a, 17b) angeordnet, die zur einfachen Positionierung des Zusatzmoduls relativ zum Laserfokus dienen.

Die Justierung des Zusatzmoduls relativ zum Laserfokus erfolgt wie folgt: zunächst wird durch Drehen des zweiten Zylinderteils (10) gegenüber dem Zylinderteil (9) der gewünschte Abstand der Spitze (13a) der Glasfaser (13) oberhalb des Loches (8b) in der Basisplatte eingestellt. Die Justierung des Zusatzmoduls (7) und der Spitze (13a) der Glasfaser (13) relativ zum Laserfokus erfolgt mit dem Kreuztisch des Mikroskopes derart, daß das Loch (8b) der Basisplatte (8) mit dem Laserfokus zusammenfällt. Das Loch (8b) dient dabei als Markierung und kann durch nicht dargestellte Löcher im ersten zylindrischen Teil (9) beobachtet werden. Anschließend wird durch Einblick in den Okulartubus (3) des Mikroskops durch Betätigung des Fokustriebes des Mikroskops auf die Spitze (13a) der Glasfaser (13) scharf gestellt und durch Nachjustierung des Kreuztisches die Faserspitze (13a) in die Mitte des Sehfeldes gebracht. Zur Beobachtung der Faser­ spitze durch den Okulartubus des Mikroskops werden die Leucht­ dioden (17a, 17b) eingeschaltet, damit die Faserspitze (13a) beleuchtet ist. Damit ist die Zusatzeinrichtung justiert und es kann der Laserfokus vermessen werden, indem unterschiedliche Spannungen an die Kontroll-Leitungen (15) für den Röhrchenscanner angelegt werden und bei jeder angelegten Spannung das von der Photodiode (14) detektierte Signal über die Ausgangsleitungen (16) registriert wird. Für die Fokusvermessung von hochvergrößernden Objektiven kann es erforderlich sein, das obige Verfahren zunächst mit einem Objektiv geringer Vergrößerung durchzuführen, um das Zusatzmodul relativ zum Strahlengang des Mikroskopes zu justieren. Anschließend wird erst auf das zu vermessende Objektiv gewechselt und die Nahfeldsonde wieder in die Bildmitte und die Fokusebene des zu vermessenden Objektivs justiert.

Ein Deckglas (31) kann an der Unterseite der Trägerplatte (8) angeordnet werden, ebenso wie eine Immersionsflüssigkeit (30) zwischen Mikroskopobjektiv (4) und Deckglas (31) und wie ein Flüssigkeitstropfen (32) zwischen Deckglas (31) und optischer Nahfeldsonde (13). Diese Teile (30, 31, 32) werden je nach den Aufnahmebedingungen für eine nachfolgende mikroskopische Auf­ nahme, für die der Laserfokus kalibriert wird, ausgewählt und angeordnet, und zwar bei Bedarf auch nur teilweise, z. B. Deck­ glas (31) und Flüssigkeit (32) ohne Immersionsflüssigkeit (30). Die Spitze (13a) der Nahfeldsonde (13) kann dabei auch in den Flüssigkeitstropfen (32) auf dem Deckglas (31) eintauchen.

Das in der Fig. 3 dargestellte Ausführungsbeispiel weist im wesentlichen den selben Aufbau auf wie das Ausführungsbeispiel nach Fig. 2. Anstelle eines Lichtdetektors ist hier jedoch an der von der Faserspitze (13a) abgewandten Seite der Glasfaser (13) eine Schnittstelle (42) vorgesehen, an die ein Lichtdetektor ansetzbar ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Einsatzvielfalt des Moduls erhöht, da an der Schnittstelle (42) das Licht einer Faserbeleuchtung, deren Faser mit (40) bezeichnet ist, in die Faser (13) des Zusatzmoduls einkoppelbar ist.

Bei Einkopplung von Licht in das Zusatzmodul wirkt die Faserspitze (13a) als punktförmige Lichtquelle. Wird das aus der Faserspitze austretende und in das Mikroskopobjektiv (4) eintretende Licht nachfolgend detektiert, so läßt sich durch Auswertung der als Funktion der Faserposition detektierten Lichtintensität das Detektionsvolumen des Mikroskopes vermessen. Bei dieser Anwendung des Zusatzmoduls kann ein zwei- oder dreidimensionales Datenfeld des vom Mikroskopobjektiv (4) detektierten Fokusvolumens aufgezeichnet werden.

Der für die Detektion des Lichtes erforderliche Detektor kann beispielsweise an einer in der Fig. 1 nicht dargestellten Schnittstelle des Mikroskopes adaptiert sein, die üblicher Weise zum Anschluß einer Kamera dient. Bei Anschluß einer CCD- Kamera an eine solche Schnittstelle können die Ausgangssignale der Kamera für die Vermessung des Bildes der durch die Nahfeldsonde gebildeten punktförmigen Lichtquelle herangezogen werden. Um dieses Punktbild mit höherer Auflösung zu vermessen, ist es auch möglich, den Bildraum des Mikroskopes mit einer weiteren Nahfeldsonde und einem daran angeschlossenen Detektor abzurastern. Durch die Bewegung der Faserspitze (13) in drei orthogonalen Raumrichtungen im Objektraum in Kombination mit einer Bewegung der Nahfeldsonde in drei orthogonalen Raumrichtungen im Bildraum wird dann ein sechsdimensionales Datenfeld erzeugt, aus dem die Punktbildübertragungsfunktion der zwischen Objektraum und Bildraum angeordneten Optik bestimmt werden können.

Wird dagegen das Zusatzmoduls in Verbindung mit einer konfokalen Anordnung, z. B. einem Laser-Scan-Mikroskop oder einem Fluoreszenz-Korrelation-Spektrometer, eingesetzt, so können die ohnehin vorhandenen konfokalen Detektoren Anwendung finden, um ein zwei- oder dreidimensionales Datenfeld des vom Mikroskopobjektiv (4) und vom konfokalen Detektor erzeugten Detektionsvolumens aufzuzeichnen.

Bei der Abrasterung des Bildraumes mit einer Nahfeldsonde kann auch ein Teilstrahlengang vor der beleuchtungsseitigen Faserspitze aus der Glasfaser durch einen Faserkoppler in einen Referenzstrahlengang ausgekoppelt und nach Durchlaufen einer gleichlangen optischen Weglänge parallel zum Detektionsstrahlengang in die Nahfeldsonde des Bildraumes mit einem zweiten Faserkoppler wieder eingekoppelt werden. Das in die Spitze der Nahfeldsonde des Bildraumes eingekoppelte Licht interferiert dann mit dem Licht des Referenzstrahlenganges. Aus dem Interferenzsignal erhält man dann auch Information über den Phasenverlauf des Lichts im Beobachtungsstrahlengang des Mikroskopes bzw. über den Phasenverlauf der Punktbildfunktion.

Bei dem in der Fig. 3 dargestellten Zusatzmodul ist die Schnittstelle unmittelbar am Zusatzmodul vorgesehen. Selbstverständlich ist es alternativ auch möglich, die Glasfaser (13) länger, beispielsweise mit einer Länge von 1 m, auszubilden und die Schnittstelle in Form eines käuflichen Faserhalters am Ende der Glasfaser vorzusehen.

Alternativ zu dem in den Fig. 2 und 3 dargestellten Ausführungsbeispielen kann anstelle der manuellen Grobpositionierung auch ein motorischer Positionierantrieb, beispielsweise in Form eines Tauchspulenmotors mit Positionsdetektor, vorgesehen sein. In diesem Fall kann auch die Feinpositionierung in axialer Richtung durch den motorischen Positionierantrieb erfolgen, so daß der Röhrchenscanner (12) nur noch zur Positionierung und/oder zum Abrastern in den beiden zur optischen Achse senkrechten Richtungen dient.

In den in den Figuren -dargestellten Ausführungsbeispielen weist das Zusatzmodul nur eine einzige Nahfeldsonde auf. Es ist natürlich auch möglich, mehrere Nahfeldsonden parallel zueinander im Zusatzmodul anzuordnen, die dann je nach Ansteuerung des Röhrchenscanners (12) synchron zueinander bewegt werden. Mit einer solchen Mehrfachanordnung lassen sich die Meßzeiten durch die Simultanmessung an mehreren Stellen deutlich reduzieren.

Anhand der Fig. 1 wurde der Einsatz des Zusatzmoduls in Verbindung mit einem inversen Mikroskop beschrieben. Es ist jedoch auch möglich, das Zusatzmodul an einem aufrechten Mikroskop, beispielsweise an der Unterseite des Objekttisches auf zunehmen. Es ist dann allerdings bei Messungen in Flüssigkeiten darauf zu achten, daß der Flüssigkeitstropfen nicht in den Sensor hineinläuft.

Claims (15)

1. Zusatzmodul (7) zur ortsaufgelösten Vermessung des Fokus eines Mikroskopobjektivs (4) umfassend:

• - einen Träger (8, 9, 10), der zum An- oder Aufsetzen auf den Objekttisch (6) eines Mikroskops (1) aus­ gebildet ist,
• - eine am Träger (8, 9, 10) angeordnete Positionierein­ heit (12), die eine Feinpositionierung in zwei zueinander senkrechten Raumrichtungen relativ zum Träger (8, 9, 10) gestattet und
• - eine an der Positioniereinheit (12) angeordnete optische Nahfeldsonde, insbesondere eine Glasfaser (13) mit einer Spitze (13a).

2. Zusatzmodul nach Anspruch 1, wobei der Träger eine Basis­ platte (8) aufweist, zu der die optische Achse des Mikroskopobjektivs (4) im wesentlichen senkrecht steht und wobei die Basisplatte (8) eine zur optischen Achse koaxiale Markierung (8b) aufweist.

3. Zusatzmodul nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein Loch (8b) durch die Basisplatte (8) geht und/oder Markierungen auf der Unterseite der Basisplatte (8) ausgebildet sind.

4. Zusatzmodul nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die Positioniereinheit (12) in Richtung der optischen Achse des Mikroskopobjektivs (4) grobpositionierbar am Träger (8, 9, 10) aufgenommen ist.

5. Zusatzmodul nach Anspruch 4, wobei der Träger eine Basis­ platte (8) und zwei Hülsen (9, 10) aufweist, von denen eines (9) mit der Basisplatte (8) verbunden ist und wobei die zweite Hülse (10) mit der Positioniereinheit (12) in der ersten Hülse (8) axial verstellbar geführt ist.

6. Zusatzmodul nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Träger Leuchtmittel (17a, 17b), vorzugsweise Leuchtdioden, zur Beleuchtung der Sonde (13a) aufweist.

7. Zusatzmodul nach einem der Ansprüche 1-6, wobei der Träger (8, 9, 10) Abstandssensoren (18a, 18b) zur Bestimmung der Position der Sonde (13a) aufweist.

8. Zusatzmodul nach einem der Ansprüche 1-7, wobei die optische Nahfeldsonde (13a) eine Apertur von weniger als 200 nm, vorzugsweise von weniger als 100 nm, aufweist.

9. Zusatzmodul nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die optische Nahfeldsonde (13) einen Lichtdetektor (14) aufweist.

10. Zusatzmodul nach einem der Ansprüche 1-8, wobei eine Schnittstelle (42) zum Ansetzen eines Lichtdetektors oder einer Faserbeleuchtung vorgesehen ist.

11. Verfahren zur Vermessung des Beleuchtungsvolumens eines durch ein Mikroskopobjektiv fokussierten Laserstahls, wobei eine optische Nahfeldsonde, insbesondere eine Glasfaser (13) mit einer Spitze (13a) an einem Ende, mittels einer in drei zueinander senkrechten Raumrichtungen beweglichen Positioniereinheit (12) durch den Fokus bewegt wird und das in die Sonde (13a) eingekoppelte Licht abhängig von der Position der Sonde (13a) detektiert wird und wobei aus den in Abhängigkeit von der jeweiligen Position der Sonde (13a) zugehörigen detektierten Lichtintensitäten das Fokusvolumen berechnet wird.

12. Verfahren zur Vermessung des Detektionsvolumens eines mikroskopischen Strahlenganges, wobei eine optische Nahfeldsonde, insbesondere eine Glasfaser (13) mit einer Spitze (13a) an einem Ende, mittels einer in drei zueinander senkrechten Raumrichtungen beweglichen Positioniereinheit (12) durch den Fokus eines Objektivs bewegt wird, wobei Licht in die Glasfaser (13) eingekoppelt wird und das aus der Spitze (13a) der Glasfaser (13) ausgekoppelte und vom Objektiv aufgesammelte Licht abhängig von der Position der Sonde (13a) detektiert wird und wobei aus den in Abhängigkeit von der jeweiligen Position der Sonde (13a) zugehörigen detektierten Lichtintensitäten das Detektionsvolumen berechnet wird.

13. Verfahren zur Vermessung der Punktbildübertragungsfunktion eines optischen System, insbesondere eines mikroskopischen Strahlenganges, wobei eine optische Nahfeldsonde, insbesondere eine Glasfaser (13) mit einer Spitze (13a) an einem Ende, mittels einer in drei zueinander senkrechten Raumrichtungen beweglichen Positioniereinheit (12) durch den Objektraum des optischen Systems bewegt wird, wobei Licht in die Glasfaser (13) eingekoppelt wird und das aus der Spitze (13a) der Glasfaser (13) ausgekoppelte und vom optischen System übertragene Licht in einem Bildraum des Objektraumes abhängig von der Position der Sonde (13a) mit einer zweiten in drei zueinander senkrechten Richtungen beweglichen optischen Nahfeldsonde detektiert wird und wobei aus den in Abhängigkeit von den jeweiligen Positionen der beiden optischen Nahfeldsonden zugehörigen detektierten Lichtintensitäten ein sechsdimensionales Datenfeld aufgezeichnet und daraus die Punktbildübertragungsfunktion berechnet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Apertur der optischen Nahfeldsonde (13a) kleiner oder gleich 200 nm, vorzugsweise kleiner oder gleich 100 nm, ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-14, dadurch gekennzeichnet, daß die für eine folgende Messung vorgesehenen Medien im Raum zwischen Mikroskopobjektiv (4) und Objekt auch bei der Vermessung des Fokusvolumens angeordnet sind, insbesondere daß Immersionsflüssigkeit (30), Deckglas (31) und/oder Lösungsmittel (32) für das Objekt zwischen Mikroskopobjektiv (4) und optischer Nahfeldsonde (13a) angeordnet sind.