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Die
Erfindung betrifft Mikroskope mit einem Beleuchtungsstrahlengang,
der zur Beleuchtung einer Probe mit Beleuchtungslicht eine Lichtquelle,
ein Objektiv und eine Optik, die das Beleuchtungslicht in eine Pupillenebene
des Objektivs fokussiert, aufweist, und mit einem Detektionsstrahlengang,
der zur Aufnahme von Fluoreszenzlicht der Probe einen Detektor,
insbesondere einen zweidimensional ortsauflösenden Detektor,
aufweist, sowie Betriebsverfahren für derartige Mikroskope.
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Ein
solches Mikroskop kann aufgrund der (punktförmigen) Fokussierung
in die Pupillenebene als Weitfeldmikroskop im engeren Sinne bezeichnet werden.
Hingegen ist der Beleuchtungsstrahlengang in der Pupillenebene bei
abtastenden (engl. „scanning”) Mikroskopen nur
entweder linienförmig fokussiert (Linienabtastung, engl. „line
scanning”)) oder gar kollimiert (Punktabtastung, engl. „point
scanning”).
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Die
Mikroskopie unter Anwendung der sogenannten Totalreflexions-Fluoreszenz
(engl. „total internal reflection fluorescence”,
TIRF) ist eine besondere Form der Fluoreszenzmikroskopie. Sie ist
beispielsweise in
WO
2006/127692 A2 (dort beispielsweise in
9 und
10C) offenbart.
1 erläutert die
Zusammenhänge. Die Fluorophore F
0 Probe
5 werden
mittels eines evaneszenten Beleuchtungsfelds E ausschließlich
in einer dünnen Schicht hinter der Grenzfläche
zwischen Deckglas
16 und Probe
5 zur Fluoreszenz
F
1 angeregt. Das evaneszente Beleuchtungsfeld
E in der Probe
5 wird erzeugt, in dem die Anregungsstrahlung
T innerhalb des Deckglases
16 unter einem Winkel θ > θ
c, der zur Totalreflexion führt,
auf die Grenzfläche Deckglas-Probe geleitet wird. Dabei
ist θ
c der Grenzwinkel, ab dem
Totalreflexion auftritt. Indem nur die dünne Schicht zur
Fluoreszenz angeregt wird, kann eine besonders hohe axiale Auflösung
erzielt werden. Die optische axiale Auflösung eines TIRF-Mikroskops
ergibt sich aus der Eindringtiefe d des evaneszenten Feldes in die
Probe. In Abhängigkeit des Einfallswinkels θ ergibt
sich die axiale Auflösung aus
wobei λ die Anregungswellenlänge,
n
1 die Brechzahl des Deckglases und n
2 die Brechzahl des Mediums der Probe ist.
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Die
Beleuchtung erfolgt typischerweise wie in 2 schematisch
dargestellt durch das Mikroskopobjektiv 4 hindurch in dessen
Randbereich so, dass das Beleuchtungslicht nach Verlassen des Objektivs 4 die
optische Achse des Objektivs 4 unter einem Winkel kreuzt,
der größer oder gleich dem Totalreflexionsgrenzwinkel θc ist. Um die notwendigen großen
Einfallswinkel für das Anregungslicht T zu ermöglichen,
muss das Mikroskopobjektiv 4 eine hohe numerische Apertur
aufweisen. Die entstehende Fluoreszenz wird durch dasselbe Objektiv 4 gesammelt und
auf eine Kamera (nicht dargestellt), beispielsweise ein ladungsgekoppeltes
Bauteil (engl. „charge coupled device”; CCD),
abgebildet.
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Ebenfalls
aus
WO 2006/127692
A2 ist zur Erhöhung des mikroskopischen Auflösungsvermögens
die Verwendung photoschaltbarer Fluoreszenzfarbstoffe bekannt (engl. „Photo-activated
Localization Microscopy”; PALM, auch PAL-M). Durch Licht sehr
geringer Intensität bei einer Aktivierungswellenlänge
wird eine äußerst geringe Anzahl zufällig
verteilter Fluorophore in einen anregbaren Zustand transformiert
(aktiviert) und anschließend auf bekannte Weise durch Licht
einer Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Die übrigen,
nichtaktivierten Fluorophore lassen sich durch die Anregungswellenlänge
nicht zur Fluoreszenz anregen. Aufgrund der zufälligen
Verteilung liegen die aktivierten und angeregten Fluorophore in
der Regel räumlich soweit auseinander, dass die aus den
Fluoreszenzereignissen entstehenden, beugungsbegrenzt verbreiterten
Intensitätsverteilungen der Punktquellenabbilder einander
nicht überlappen. In der PAL-Mikroskopie wird eine Vielzahl
von Einzelbildern mit einer jeweils geringen Anzahl von derartigen
nichtüberlappenden Fluoreszenzereignissen aufgenommen. Während
der Aufnahme der Einzelbilder kann eine andere Gruppe von Fluorophoren
so aktiviert werden, dass sie zuvor gebleichte Fluorophore ersetzt. Die
Intensitätsverteilungen der Fluoreszenzereignisse erstrecken
sich in den Einzelbildern aufgrund der Beugungsverbreiterung über
mehrere Bildelemente (engl. „picture elements”;
Pixel). Die Ursprünge der einzelnen Fluoreszenzereignisse
werden in den Einzelbildern anhand der beugungsverbreiterten Intensitätsverteilungen
mittels einer Ausgleichsrechnung mit Subpixelauflösung
lokalisiert und in ein hochauflösendes Ergebnisbild eingetragen.
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In
modernen Weitfeldmikroskopen im engeren Sinne werden, im Gegensatz
zu den Laser-Scanning-Mikroskopen (dort insbesondere bei nichtlinearer
Fluoreszenzanregung), nur relativ schwache Lichtquellen mit nur
geringen Lichtintensitäten verwendet. Die Fokussierung
in die Pupillenebene führt dabei zwangsläufig
zu geringen Lichtintensitäten in der Probe, da die Leistung
der Lichtquelle auf einen sehr großen Probenbereich verteilt
wird. Geringe Intensitäten sind aber in der Regel aus mehreren
Gründen durchaus erwünscht. Einerseits sind Fluorophore
mit hoher Quantenausbeute verfügbar, zum anderen soll die
Strahlenbelastung der Probe so gering wie möglich gehalten
werden. Bei direkter Beobachtung durch ein Okular besteht bei hoher
Lichtintensität zudem die Gefahr der Schädigung
der Augen des Beobachters. Geringe Beleuchtungslichtintensitäten sind
insbesondere in der TIRF-Mikroskopie erwünscht, da hohe
Intensitäten zu einer Sättigung der Farbstoffe
im deckglasnahen Bereich führen würden, wodurch
die Farbstoffe aus den tieferen Bereichen der Probe einen stärkeren
Beitrag zum Bild lieferten. Allerdings ist es in der TIRF-Mikroskopie
ohnehin schwierig, hohe Intensitäten in der Probe zu erreichen,
da ein Großteil der Leistung aufgrund der Totalreflexion
gar nicht in die Probe hineingelangt.
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Es
gibt jedoch auch Weitfeldtechniken, die sehr hohe Intensitäten
benötigen. Beispielsweise müssen bei PAL-Mikroskopen
die bereits beobachteten Fluorophore sehr schnell in einen Dunkelzustand überführt
werden, um die Messdauer zu verringern, was durch Bleichen geschehen
kann. Je höher dabei die Beleuchtungslichtintensität
ist, desto schneller werden die aktivierten Fluorophore ausgebleicht.
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Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mikroskope und Verfahren
der eingangs genannten Arten zu verbessern, so dass die Beleuchtungslichtintensität
in der Probe mit geringem Aufwand flexibel einstellbar ist.
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Die
Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop, welches die in
Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein Betriebsverfahren,
welches die in Anspruch 10 angegebenen Merkmale aufweist.
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Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen
angegeben.
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Erfindungsgemäß ist
vorgesehen, dass die Lichtquelle ein Laser ist und dass in dem Beleuchtungsstrahlengang
eine variable Optik angeordnet ist, die eine veränderliche
Einstellung eines Strahlquerschnitts des Beleuchtungslichts in einer
Zwischenbildebene ermöglicht, wobei eine Divergenz des
Beleuchtungslichts für unterschiedliche Strahlquerschnitte
identisch ist. Mit anderen Worten, die Divergenz des Beleuchtungslichts,
insbesondere beim Auftreffen auf die Probe und in der Zwischenbildebene,
ist unabhängig von dem Strahlquerschnitt in der Zwischenbildebene.
Der Strahlquerschnitt ist die von dem Beleuchtungslicht-Strahlenbündel
quer zur Ausbreitungsrichtung eingenommene Fläche. Die
in den verschiedenen Einstellungen identische Divergenz in der Bildebene
kann jeden denkbaren Wert annehmen, insbesondere kann sie Null sein,
so dass kollimiertes Licht vorliegt.
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Durch
das Anordnen einer variablen Optik zur veränderlichen Einstellung
des Strahlquerschnitts in einem Anregungslaserstrahl lässt
sich der räumliche Bereich der Probe, in dem eine Fluoreszenzanregung
stattfindet, also das Sehfeld des Mikroskops, in seiner Größe
flexibel verändern. Da durch eine Optik zur variablen Einstellung
des Strahlquerschnitts die übertragene Beleuchtungslichtleistung
nicht beeinflusst wird, kann durch die Änderung des Strahlquerschnitts
im Anregungsstrahlengang (und damit des korrespondierenden Bündeldurchmessers
auf der Probe) die Intensität (hier als Leistung pro Fläche
angenähert) des Laser-Beleuchtungslichts in der Probe in
einem großen Wertebereich variiert werden. Dadurch kann
dasselbe Mikroskop mit geringem Aufwand für Messungen mit
niedriger und alternativ mit hoher Beleuchtungslichtintensität
eingesetzt werden. Verschiedene Stellen der Probe können
dabei beispielsweise in bekannter Weise durch Verschieben der Probe
quer zum Beleuchtungsstrahlengang und zum Detektionsstrahlengang
beleuchtet und untersucht werden.
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Vorzugsweise
ist die variable Optik außerhalb des Detektionsstrahlengangs
angeordnet. Dadurch kann der Beleuchtungsstrahlengangquerschnitt
unabhängig von einem Detektionsstrahlengangquerschnitt
eingestellt werden.
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Vorteilhafterweise
kann der Beleuchtungsstrahlengang derart ausgebildet sein, dass
das Beleuchtungslicht nach Verlassen des Objektivs eine optische
Achse des Objektivs unter einem Winkel kreuzt, der größer
oder gleich einem Totalreflexionswinkel ist. Dadurch können
beispielsweise PALM und TIRF mit variabler Beleuchtungsintensität
betrieben werden.
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In
einer ersten Ausgestaltungsvariante umfasst die variable Optik ein
Teleskop, das zwischen mindestens zwei Vergrößerungseinstellungen
umschaltbar ist. Dabei weist eine Vergrößerungseinstellung
des Teleskops vorzugsweise eine Vergrößerung von
weniger als eins auf. Die Bereitstellung einer Umschaltmöglichkeit
auf eine Vergrößerung von weniger als eins führt
dazu, dass die gleiche Laserleistung auf einen deutlich kleineren
Bereich wirken und so die Intensität in der Probe zu lasten
des Sehfeldes erhöht werden kann. Ein Teleskop mit einer
0,5× Vergrößerung sorgt beispielsweise
für eine Vervierfachung der Lichtintensität im
Bereich der Probe.
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In
einer zweiten Ausgestaltungsvariante ist die variable Optik in ihrer
Vergrößerung stufenlos einstellbar (Zoomoptik).
Dabei ist die Zoomoptik vorzugsweise auf eine Vergrößerung
von weniger als eins einstellbar. Verwendet man eine Zoomoptik (anstelle
eines Teleskops), so lässt sich das Sehfeld und damit die
Beleuchtungsintensität in der Probe kontinuierlich verstellen.
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Die
Einschränkung des Sehfeldes durch Verkleinerung des Strahlquerschnitts
des Beleuchtungsstrahlengangs stört bei Techniken wie PALM
nur wenig, da die beobachteten Strukturen im Submikrometerbereich
liegen. Um den Nachteil des verkleinerten Sehfeldes zu reduzieren,
kann man das System automatisch auf das kleinere Sehfeld anpassen.
In einer weitergehenden Ausführungsform umfasst der Detektionsstrahlengang
daher vorteilhafterweise eine einstellbare, insbesondere vergrößernd
wirkende Tubuslinse, die zwischen einer Position im Detektionsstrahlengang
und einer Position außerhalb des Detektionsstrahlengangs
beweglich ist, oder eine entsprechend einstellbare Zoomoptik. Durch
eine vergrößernd wirkende Tubuslinse oder eine
entsprechend einstellbare Zoomoptik kann bei verkleinerter Sehfeldeinstellung
der gesamte Detektor ausgeleuchtet werden. Alternativ dazu kann
eine softwaregestützte Beschneidung des Detektorbildes
in Art einer interessierenden Region (engl. „region of
interest”; ROI) erfolgen. Sofern zur Beschneidung nur ein Teilbereich
des vom Detektor aufgenommenen Bildes, also eine echte Untermenge
der Detektorpixel, aus dem Detektor ausgelesen wird, kann dies vorteilhafterweise
aufgrund der kleineren Datenmenge zu schnelleren Bildaufnahmen führen.
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Vorzugsweise
verläuft der Detektionsstrahlengang durch dasselbe Objektiv
wie der Beleuchtungsstrahlengang. Dies gilt insbesondere im Falle einer
TIRF-Beleuchtung.
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Der
Betrieb des erfindungsgemäßen Mikroskops erfolgt
vorzugsweise in folgenden Schritten: Einstellen der variablen Optik
in eine von mehreren Stellungen; Einstellen der einstellbaren Tubuslinse im
Detektionsstrahlengang zur Abbildung eines mit dem eingestellten
Strahlquerschnitt des Beleuchtungslichts korrespondierenden Sehfelds
auf den Detektor; Fokussieren des Beleuchtungslichts in die Pupillenebene
des Objektivs und Aufnehmen von Fluoreszenzlicht von der Probe mittels
des Detektors.
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Alternativ
dazu kann der Betrieb des erfindungsgemäßen Mikroskops
in folgenden Schritten erfolgen: Einstellen der variablen Optik
in eine von mehreren Stellungen; Fokussieren des Beleuchtungslichts
in die Pupillenebene des Objektivs und Aufnehmen von Fluoreszenzlicht
von der Probe mittels des Detektors, wobei nur eine echte Untermenge von
Pixeln des Detektors, die einem Sehfeld entspricht, das mittels
des Strahlquerschnitts des Beleuchtungslichts eingestellt ist, in
ein Bild aufgenommen wird. Die Aufnahme nur einer Untermenge der Detektorpixel
kann dabei bedeuten, dass der Detektor vollständig ausgelesen,
aber nur ein Teilbereich davon in ein Speicherabbild aufgenommen
wird. Alternativ kann damit ein nur teilweises Auslesen des Detektors
gemeint sein.
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Die
Erfindung umfasst auch Steuereinheiten und Computerprogramme, die
zur Durchführung eines erfindungsgemäßen
Verfahrens eingerichtet sind.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher
erläutert.
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In
den Zeichnungen zeigen:
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1 ein
Schema der Funktionsweise von TIRF,
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2 eine
TIRF-Beleuchtungsmöglichkeit nach dem Stand der Technik
in schematische Darstellung,
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3 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen
Mikroskops,
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4 ein
zweites Mikroskop mit einer Zoomoptik,
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5 ein
drittes Mikroskop zur TIRF-Beleuchtung,
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6 ein Ergebnis einer Beschneidung des Detektorbildes
zur Kompensation eines verkleinerten Sehfeldes und
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7 Bilder einer Aufnahme mit vergrößernder
Tubuslinse zur Kompensation eines verkleinerten Sehfeldes.
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In
allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche
Bezugszeichen.
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3 zeigt ein Mikroskop 1 mit einem
Beleuchtungsstrahlengang, in dem unter anderem eine Lichtquelle 2,
ein Strahlteiler 3 und ein Mikroskopobjektiv 4 zur
Beleuchtung einer Probe 5 mit Beleuchtungslicht der Lichtquelle 2 angeordnet
sind. Die Lichtquelle 2 ist ein Laser, der zur Anregung
einer bestimmten Fluorophorsorte wie GFP (engl. „green-fluorescent
protein”) geeignet ist. Der Strahlteiler 3 koppelt
einen Detektionsstrahlengang, der von der Probe 5 durch
dasselbe Objektiv 4 bis zu einem Detektor 6 verläuft,
aus. Der Strahlteiler 3 kann beispielsweise als dichroitischer
Farbteiler ausgebildet sein, der im von der Probe 5 kommenden
Licht die Anregungswellenlänge des Beleuchtungslichts von
den Fluoreszenzwellenlängen der Probe 5 trennt.
Der reflektierte oder gestreute Anteil des Anregungslichts wird
zur Lichtquelle 2, der Fluoreszenzanteil zum Detektor 6 geleitet.
Der Detektor 6 ist beispielsweise ein zweidimensional ortsauflösendes
CCD (engl. „charge coupled device”).
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Im
Beleuchtungsstrahlengang sind dem Laser 2 eine nichtabgebildete
Lichtleitfaser und dieser eine Kollimationsoptik 8 nachgeordnet,
in alternativen Ausführungsformen ohne Lichtleitfaser (nicht
abgebildet) kann gegebenenfalls auf die Kollimationsoptik 8 verzichtet
werden. Der Kollimationsoptik 8 ist als Mittel zur veränderlichen
Einstellung des Strahlquerschnitts des Beleuchtungslichts ein variables
Teleskop 10 nachgeordnet, in dem durch eine erste Optik 9 und
eine zweite Optik 10.1 zur Unendlichabbildung eine Zwischenbildebene
(nicht abgebildet) erzeugt wird. Das Teleskop ist insofern variabel,
als mittels eines Antriebs 11 eine dritte Optik 10.2 anstelle der
zweiten Optik 10.1 bewegt werden kann, beispielsweise durch
Einschwenken. Zu einem Zeitpunkt befindet sich stets nur eine der
Optiken 10.1/10.2 im Beleuchtungsstrahlengang.
Die dritte Optik 10.1 hat eine kleinere Brennweite als
die zweite Optik 10.2. Die Optiken 10.1, 10.2 sind
dabei so angeordnet und derart beweglich, dass ihre beleuchtungsseitigen
Brennebenen im in den Beleuchtungsstrahlengang eingeschwenkten Zustand
der betreffenden Optik 10.1/10.2 mit der probenseitigen
Brennebene der ersten Optik 9 zusammenfallen. Das Teleskop
hat beispielsweise mit der zweiten Optik 10.1 wie abgebildet
eine Vergrößerung von 0,9, mit der dritten Optik 10.2 hingegen
eine Vergrößerung von 0,5. Alternativ kann das
Teleskop mit der zweite Optik 10.1 eine Vergrößerung
von 1 oder mehr aufweisen.
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Im
gemeinsamen Abschnitt der Strahlengänge (zwischen Strahlteiler 3 und
Objektiv 4) ist eine beleuchtungsseitige Tubuslinse 7 (Beleuchtungstubuslinse)
angeordnet, die den Beleuchtungsstrahlengang punktförmig
in die Pupillenebene P des Objektivs 4 oder zumindest in
die Nähe der Pupillenebene P fokussiert. Dadurch wird das
Beleuchtungslicht vom Mikroskopobjektiv 4 als kollimiertes
Bündel auf die Probe 5 geworfen. Die Punkte der
Probe, die in der probenseitigen Brennebene des Objektivs 4 liegen,
werden über eine Tubuslinse 13A/13B auf
den Detektor 6 abgebildet (Weitfeldmikroskop). Bei dem Weitfeldsystem
handelt es sich nicht um ein konfokales System.
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Die
Divergenz des Beleuchtungslichts beim Eintritt in die Beleuchtungstubuslinse 7 ist
unabhängig von der Vergrößerungseinstellung
des Teleskops 10.
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Die
Tubuslinsen 13A und 13B sind mittels eines Antriebs 11 alternativ
in den Detektionsstrahlengang beweglich, beispielsweise einschwenkbar.
Die zweite Tubuslinse 13B bewirkt im Gegensatz zur ersten
Tubuslinse 13A eine stärkere Vergrößerung
des Bildes auf dem Detektor 6. Die Brennweite der zweiten
Tubuslinse 13B ist so gewählt, dass das Sehfeld des
Mikroskops mit der dritten Teleskopoptik 10.2 (kleineres
Sehfeld als mit der zweiten Teleskopoptik 10.1) nahezu
vollständig auf den Detektor 6 abgebildet wird,
wenn sich die zweite Tubuslinse 13B im Detektionsstrahlengang
befindet. Entsprechend ist die Brennweite der ersten Tubuslinse 13A so
gewählt, dass das größere Sehfeld des
Mikroskops mit der zweiten Teleskopoptik 10.1 auf den Detektor 6 abgebildet
wird, wenn sich die erste Tubuslinse 13B im Detektionsstrahlengang
befindet.
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Die
Steuereinheit 14 kann über die Antriebe 11 die
Vergrößerung des Teleskops 10 und der
Detektionstubuslinse 13A/13B einstellen. Durch
Umschalten zwischen der zweiten Optik 10.1 und der dritten
Optik 10.2 kann der Strahlquerschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs
verändert werden. Das hat eine Variation des ausgeleuchteten
Bereichs der Probe 5 und damit eine Variation der Beleuchtungsintensität
in der Probe 5 zur Folge. Außerdem kann die Steuereinheit 14 die
Menge der Pixel des Detektors 6 oder eine echte Untermenge
davon auslesen und zur Weiterverarbeitung über eine Schnittstelle
(nicht abgebildet) ausgeben.
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In
Teilfigur 3A ist die zweite Optik 10.1 des
Teleskops 10 in den Beleuchtungsstrahlengang eingeschwenkt.
In Teilfigur 3B ist stattdessen die dritte
Optik 10.2 des Teleskops 10 in den Beleuchtungsstrahlengang
eingeschwenkt. Es ist zu erkennen, dass der Strahlquerschnitt im
Beleuchtungsstrahlengang und der Bündeldurchmesser in der
Probe 5 im Fall der zweiten Optik 10.1 größer
sind als im Fall der dritten Optik 10.2. Damit ist das
Sehfeld des Mikroskops 1 im erstgenannten Fall größer
als im zweitgenannten Fall (angedeutet durch eine Ansicht eines
vergrößerten Ausschnitts der Probe 5).
Die Beleuchtungslichtintensität in der Probe 5 ist
im zweitgenannten Fall höher als im erstgenannten Fall.
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Beispielsweise
wird der Steuereinheit 14 durch einen Benutzer die Einstellung
des kleineren Sehfelds vorgegeben (siehe 3B). Daraufhin kann
die Steuereinheit 14 beispielsweise automatisch die zum
kleineren Sehfeld gehörige zweite Detektionstubuslinse 13B in
den Detektionsstrahlengang fahren. Entsprechend kann sie bei Vorgabe
des großen Sehfeldes beispielsweise automatisch die zum
größeren Sehfeld gehörige erste Detektionstubuslinse 13A in
den Detektionsstrahlengang fahren. Zu einem Zeitpunkt befindet sich
stets nur eine der Detektionstubuslinsen 13A/13B im
Detektionsstrahlengang.
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In
alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) ist das
gesamte Teleskop 10 (beispielsweise bestehend aus der ersten
Optik 9 und der zweiten Optik 10.1) gegen ein
anderes Teleskop mit einer anderen Vergrößerung
automatisch austauschbar. Es können auch drei und mehr
Teleskope gegeneinander automatisch austauschbar sein.
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Das
in 4 gezeigte Mikroskop 1 stimmt weitgehend
mit dem Mikroskop 1 gemäß 3 überein. Anstelle eines Teleskops 10 ist
im Beleuchtungsstrahlengang jedoch eine hinsichtlich ihres Abbildungsmaßstabs
variabel einstellbare Zoomoptik 15 angeordnet. Insbesondere
können Vergrößerungen von weniger als
eins eingestellt werden. Auch dieses Mikroskop 1 erlaubt
die Veränderung des Strahlquerschnitts im Beleuchtungsstrahlengang
und damit des Sehfelds. Die so erzielbare Intensitätsanpassung
ist durch eine Zoomoptik stufenlos regelbar. Die Divergenz des Beleuchtungslichts
beim Eintritt in die Beleuchtungstubuslinse 7 ist unabhängig
von der Vergrößerungseinstellung der Zoomoptik 15.
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Die
Veränderung des Sehfeldes kann im Detektionsstrahlengang
automatisch berücksichtigt werden. Dies kann durch die
Steuereinheit 14 geschehen, indem sie beispielsweise bei
einer Vergrößerung von weniger als eins durch
die Zoomoptik 15 nur eine echte Untermenge der Pixel des
Detektors 6 verarbeitet, die dem resultierenden, verkleinerten Sehfeld
entspricht. Vorzugsweise liest die Steuereinheit 14 auch
nur diese Untermenge von Pixel aus dem Detektor aus, um die zu übertragende
Datenmenge zu minimieren. Dies erlaubt höhere Bildwiederholfrequenzen
bei der Aufnahme mit verkleinertem Sehfeld gegenüber der Aufnahme
mit regulärem Sehfeld (Vergrößerung der
Zoomoptik 15 von eins). Alternativ zu einer Detektionstubuslinse 13 mit
fester Brennweite kann eine einstellbare Detektionstubuslinse 13A/13B gemäß 3 vorgesehen werden.
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5 zeigt
das Mikroskop 1 gemäß 4 in einer
TIRF-Konfiguration, bei der der Beleuchtungsstrahlengang derart
ausgebildet ist, dass das Beleuchtungslicht nach Verlassen des Objektivs 4 die optische
Achse OA des Objektivs 4 unter einem Winkel kreuzt, der
größer oder gleich einem Totalreflexionswinkel
ist.
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In 6 ist die Auswahl einer interessierenden
Region durch Beschneidung des Detektorbilds angedeutet (vergrößernde
Tubuslinse 13B nicht vorhanden oder nicht verwendet). Teilfigur 6A zeigt die
Detektorpixel einer regulären Aufnahme mit großem
Sichtfeld (zweite Optik 10.1 im Beleuchtungsstrahlengang
beziehungsweise Zoomoptik 15 auf Vergrößerung
von 1:1 eingestellt). Teilfigur 6B zeigt
die Detektorpixel einer Aufnahme mit reduziertem Sichtfeld (dritte
Optik 10.2 im Beleuchtungsstrahlengang beziehungsweise
Zoomoptik 15 auf Vergrößerung von weniger
als eins eingestellt). Die echte Untermenge von Detektorpixel kann
beispielsweise auf die Bildgröße des gesamten
Detektors umgerechnet werden. Aus Teilfigur 6C ist
erkennbar, dass die interessierende Region mit gleicher Auflösung
wie im regulären Bild (6A) aufgenommen wurde.
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7 deutet die Kompensation des verkleinerten
Sehfelds im Bereich einer interessierenden Region durch Vergrößerung
des Abbildungsmaßstabs des Detektionsstrahlengangs mittels
einer vergrößernden Tubuslinse 13B an.
Teilfigur 7A zeigt (wie 6A)
die Detektorpixel einer regulären Aufnahme mit großem
Sichtfeld. Teilfigur 7B zeigt die Detektorpixel einer
Aufnahme mit reduziertem Sichtfeld (dritte Optik 10.2 im
Beleuchtungsstrahlengang beziehungsweise Zoomoptik 15 auf Vergrößerung
von weniger als eins eingestellt) durch eine vergrößernde
Tubuslinse 13B. Es ist erkennbar, dass die interessierende
Region mit höherer Auflösung aufgenommen wurde
als im regulären Bild (7A).
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Mikroskop
- 2
- Lichtquelle
- 3
- Strahlteiler
- 4
- Mikroskopobjektiv
- 5
- Probe
- 6
- Detektor
- 7
- Beleuchtungstubuslinse
- 8
- Kollimationsoptik
- 9
- Erste
Optik
- 10
- Variables
Teleskop
- 10.1
- Zweite
Optik
- 10.2
- Dritte
Optik
- 11
- Antrieb
- 12
- Okular
- 13A/B
- Detektionstubuslinse
- 14
- Steuereinheit
- 15
- Zoomoptik
- 16
- Deckglas
Einfallswinkel
- θc
- Totalreflexionsgrenzwinkel
- T
- Beleuchtungslicht
- E
- Evaneszentes
Feld
- F0/1
- Fluorophor
- OA
- Optische
Achse
- P
- Pupillenebene
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 2006/127692
A2 [0003, 0005]
