DE102006034910B4 - Mikroskop umfassend einen Strahlvereiniger - Google Patents

Abstract

Mikroskop umfassend einen Strahlvereiniger zur Vereinigung von zwei Beleuchtungsstrahlen zur Abtastung und/oder Beeinflussung einer Probe, wobei eine teilreflektierende Schicht zur Vereinigung der Beleuchtungsstrahlen vorgesehen ist
und der Strahlvereiniger über den optisch wirksamen Querschnitt des Strahlvereinigers eine stetige Änderung in Form einer stetigen Zunahme oder einer stetigen Abnahme aufweist, so dass der Strahlvereiniger in der als Keilrichtung bezeichneten Richtung der Änderung einen keilförmigen Querschnitt aufweist und der Strahlvereiniger in den Strahlengängen der Beleuchtungsstrahlen angeordnet ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
- die Keilrichtung unter einem Winkel ungleich Null zu einer durch die Strahlengänge aufgespannten Ebene verläuft und
- das Mikroskop ein punktscannendes oder linienscannendes und/oder multifokales und/oder Nipkow-basiertes Mikroskop ist.

Description

• Stand der Technik
• Die konfokale Lasermikroskopie ist das Werkzeug für die definierte Ansteuerung von Mikroobjekten. Diese Methode stellt sehr hohe Anforderungen an die Abbildungsleistung des optischen Systems, welche typischerweise nahe dem beugungsbegrenzten Auflösungsvermögen liegt. Auf Basis der konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie wurden vielfältige Methoden zur Untersuchung und Beeinflussung mikroskopischer Objekte vorgeschlagen, so z.B. Denk in [ US 5,034,613 A , TPA], Liu in [ US 6,159,749 A , Tweezer] oder Karl Otto Greulich in „Micromanipulation by Light in Biology and Medicine“ 1999. Die Kombination aus einem bildgebenden Punkt- bzw. Linienscan-System und einem Manipulator-System bilden demnach den Kern derartiger Anordnungen. Das Interesse an der Beobachtung und Analyse schneller mikroskopischer Prozesse bringt neue Geräte und Verfahren [z.B. ZE/SS Linienscanner LSM 5 LIVE] hervor, deren Kombination mit obigen Manipulationsmethoden zu neuen Einsichten führt. Hierbei steht insbesondere die simultane Manipulation und Beobachtung mikroskopischer Prozesse im Vordergrund ( US 6094300 A , DE102004034987 A1 ). Moderne Mikroskope versuchen daher eine möglichst große Anzahl flexibler Aus- und Einkoppelstellen anzubieten ( DE102004016433 A1 , Tubus). Die gleichzeitige Verfügbarkeit von mindestens zwei Einkoppelstellen für unabhängige Scan-Systeme ist dabei besonders wichtig, um Beschränkungen in der zeitlichen Auflösung aufgrund langsamer mechanischer Schaltprozesse zu vermeiden. Neben der Tubus-Schnittstelle sind an Mikroskopstativen weitere Einkoppelstellen an den Seiten (vorzugsweise in einem erweiterten Unendlichraum; „Sideports“) sowie an der Stativ-Rückseite („Rearports“) sowie der Unterseite („Baseport“) denkbar.
• Prinzipiell sind dabei Anordnungen mit gemeinsamer Einstrahlrichtung (entweder Auflicht oder Durchlicht) oder entgegengesetzter Einstrahlrichtung (Auflicht und Durchlicht) denkbar. Abgesehen vom applikativen Hintergrund wird oftmals aus gerätetechnischer Sicht die gemeinsame Einstrahlrichtung bevorzugt.
• Für diesen Fall ist der Einsatz von mindestens einem Element erforderlich, das die Strahlengänge beider Geräte im Raum zwischen den Scannern der simultan zu betreibenden Scan-Systeme und dem Objektiv vereinigt. Um eine möglichst große System-Flexibilität gewährleisten zu können, sind bei der Stativanbindung von der Scan-Module sondern auch in den Wellenlängen und den Polarisationen der zusammengeführten Laser. Sowohl für das manipulierende als auch für das bildgebende System kann sich der spektrale Nutzbereich grundsätzlich vom ultravioletten bis zum infraroten Spektralbereich erstrecken. Applikativ typische Manipulationswellenlängen sind z.B. 351, 355 und 364 nm (Photo-Uncaging), 405 nm (Photokonvertierung, Kaede, Dronpa, PA-GFP), 488 und 532 nm (Photobleichen, FRET, FRAP, FLIP) sowie 780 - 900 nm (Multi-Photonen-Bleichen z.B. MPFRAP, 2-Photonen Uncaging; direct multiphoton stimulation). In Abhängigkeit der zusammengeführten Wellenlängen als auch der Ankoppelpositionen von bildgebendem und manipulierendem System ergeben sich zahlreiche applikativ sinnvolle Typen dichroischer Strahlvereiniger. zeigt eine Auswahl möglicher Strahlvereiniger-Typen, wobei die Manipulationswellenlängen 355nm, 405 nm, 488 und 532 nm sowohl in Transmissions- wie auch in Reflektionsrichtung eingesetzt werden können. Neutralvereiniger (z.B. T20/R80) sind hierbei für verschiedene Applikationen universell einsetzbar und ermöglichen zudem auf einfache Weise Applikationen, bei denen sowohl für das bildgebende System als auch für das Manipulations-System gleiche Laserwellenlängen eingesetzt werden (insbesondere FRAP). Typischerweise steht für die verschiedenen Strahlvereinigertypen eine motorisierte Wechseleinrichtung zur Verfügung, wie z.B. ein motorisierter Reflektorrevolver im Bereich des Unendlichraumes zwischen Objektiv und Tubuslinse.
• In der praktischen Anwendung sind zahlreiche Anforderungen an das beschriebene Strahlvereinigerelement zu erfüllen, die bei der Auslegung dieses Elementes berücksichtigt werden müssen und nicht in [ US 6,677,566 B2 ] diskutiert werden.
• Typische Probleme derartiger Strahlvereiniger bestehen im möglichen Auftreten von Interferenzen gleicher Neigung, der Sicherung der Bildqualität und -deckung beider Strahlengänge.
• Zunächst einmal ist zu beachten, dass das Strahlvereinigerelement die Abbildungsleistung des Laser-Scan-Mikroskops nicht beeinträchtigt. So sind insbesondere die Passeanforderungen des Strahlvereinigerelementes so zu wählen, dass kein Astigmatismus auftritt.
• Aufgrund des endlichen Reflexionskoeffizienten an Vorder- und Rückseite eines planparallelen Strahlvereinigers können infolge der resultierenden Rückreflexe Interferenzen gleicher Neigung auftreten, welche in der Fokalebene des Mikroskopobjektivs zu einer Amplitudenmodulation des Anregungslichtes führen. Typische Auswirkungen auf die Transmission T sind entsprechend $$T=\frac{1}{1+m{\text{sin}}^2\left(2\pi \frac{d}{\lambda }\sqrt{n^2-{\text{sin}}^2\alpha }\right)}$$

  

  in dargestellt, wobei die Modulation m=4R/(1-R) mit dem geometrischen Mittel der Reflexionskoeffizienten R²=R₁ R₂ zusammenhängt, λ die Wellenlänge, d die Dicke und n die Brechzahl des Strahlvereinigers bezeichnen. α repräsentiert den Winkel unter dem der Teiler getroffen wird und liegt typischerweise im Bereich bis 0.055 für Sehfeldzahl 18. Das strahlvereinigende Element befindet sich in einem Strahlengangbereich, in dem sich während des Scanprozesses (Bildaufnahme oder Probenmanipulation) der Einfallswinkel α ständig ändert. Entsprechend führen die am planparallelen Strahlvereiniger auftretenden Interferenzen gleicher Neigung innerhalb des Bildfeldes zu einer periodischen Amplitudenmodulation der einfallenden Lichtintensität. Dies führt in der Praxis zu störenden Streifen im bildgebenden System bzw. zu einer streifenförmig variierenden Manipulationseffizienz. Die Reflektivitäten R₁ und R₂ hängen sowohl von der Wellenlänge (besonders bei dichroischen Strahlvereinigern) als auch von der Polarisation der einfallenden Laserstrahlung ab, wobei letztere durch die Ausgangspolarisation des Scanmoduls und dessen Anbauposition am Stativ vorgegeben ist. Mit zunehmender Wellenlänge werden die im Bild auftretenden Interferenzstreifen breiter und ihre Modulationstiefe größer. Bei einem dielektrischen Strahlvereiniger wirkt sich die Polarisationsrichtung hauptsächlich auf die Wirksamkeit der Anti-Reflex (AR)-Beschichtung aus. Da der Strahlvereiniger unter 45Grad im Strahlengang liegt, was nahe am Brewster-Winkel für Glas ist, wird die p-Komponente naturgemäß weniger stark reflektiert als die s-Komponente. Um zu einer Modulation unter m=0.04 zu gelangen, hat man R=0.01 zu realisieren, was bei verschiedenen Teilerverhältnissen R₁ auf R₂<0.001 führt. Derartige Entspiegelungen sind über den teils großen Spektralbereich (vgl. ) aus technologischen Gründen selbst unter p-Polarisation praktisch nicht zu erreichen. In der Praxis ist es somit nicht möglich, die störenden Interferenzstreifen allein durch eine Optimierung der Anti-Reflex-Beschichtung des Strahlvereinigers zu vermeiden.
• Ein möglicher Ausweg bestünde in der softwaretechnischen Filterung der gemessenen Signale. Da der Strahlvereiniger regelmäßige Interferenzstreifen erzeugt bietet sich hierbei insbesondere die Methode der Fourier-Filterung an. Softwaretechnische Filtermethoden gehen jedoch bekanntermaßen mit einem räumlichen Auflösungsverlust einher und sind daher aus applikativer Sicht nicht akzeptabel.
• Optische Elemente zur spektralen Selektion sind beispielsweise aus der US 2003/0190126 A1 und der US 2005/0046837 A1 bekannt. Die US 2003/0190126 A1 betrifft ein Element mit einer lichtleitenden Platte und einem mehrschichtigen Filter. Die Schichtdicken der einzelnen Filterschichten nehmen in einer Richtung der lichtleitenden Platte zu, sodass sich in dieser Richtung die Filtereigenschaften ändern und in dieser Richtung räumlich verteilt Strahlung ausgewählter Wellenlängen aus der lichtleitenden Platte austritt. Die US 2005/0046837 A1 betrifft ein Gerät zur Spektroskopie, bei dem Anteile einer in einem Lichtleiter geführten Strahlung bei jedem Auftreffen der Strahlung auf einer teildurchlässigen Seitenfläche des Lichtleiters aus diesem ausgekoppelt werden.
• Technische Lösung der beschriebenen Probleme
• Die Einführung eines Strahlvereinigers mit definiertem Keilwinkel in ein Mikroskop löst das Problem der an planparallelen Strahlvereinigern auftretenden Interferenzen gleicher Neigung und der damit verbundenen Amplitudenmodulation des Anregungs- und Manipulationslichtes in der Fokalebene des Objektivs. Dabei ist zu beachten, daß der an einem solchen Strahlvereinigerkeil auftretende Rückreflex
1. 1. deutlich außerhalb eines Airy-Durchmessers liegt, so dass eine gegenseitige Überlagerung in der Objektebene (und damit eine Interferenz) ausgeschlossen ist
2. 2. in seiner Intensität so gering ist, dass ein „Geisterbild“ praktisch nicht nachsweisbar ist
3. 3. bei einem Linienscanner (z.B. LSM 5 LIVE / ZEISS) zu keiner parallelen Verschiebung der Beleuchtungslinie auf sich selber führt (was wiederum Interferenzen zur Folge hätte).
• Darüber hinaus sind die Passeanforderungen des Strahlvereinigerkeils so zu wählen, dass die Abbildungsleistung des mikroskopischen Systems weiterhin nahe dem beugungsbegrenzten Auflösungsvermögen liegt.
• Anforderung 1 führt auf Keilwinkel α > 1.22α /NA'/ 164.5mm / 3.74.
• Danach bestimmen Objektive mit kleiner bildseitiger Apertur den Mindestkeilwinkel. Typischerweise wird man mit einem wirksamen Keil von ca. 0.7' auskommen.
• In Bezug auf den Keilwinkel ist anzumerken, daß es aufgrund zahlreicher Kombinationen von Stativanbindung und Scan-Systemen besonders vorteilhaft ist, die Keilrichtung unter 45Grad zu den Achsen verdreht auszurichten. und b verdeutlicht diese Geometrie. Da der Strahlvereiniger unter 45° zur
• Einfallsrichtung steht, muß die Projektion auf die Hauptachsen betrachtet werden. Hierbei ergibt sich eine Keilrichtung von α = tan^-11/√2 = 35,26° bzgl. der Strahlvereinigerkante ( und der Keilwinkel ist um den Faktor V2 zu vergrößern.
• Die in dargestellte Geometrie ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn ein Linienscanner als bildgebendes System verwendet wird. Die Keilrichtung liegt dann jeweils schräg (d.h. 45°) zu beiden denkbaren Hauptachsen der Scanlinie (parallel zu den Strahlvereinigerkanten), so dass unabhängig von der Stativ-Ankoppelposition des Linien-Scanners der am Strahlvereinigerkeil auftretende Rückreflex zu keiner parallel auf sich selbst verschobenen Linie führt. Die in dargestellte Strahlvereinigergeometrie ermöglicht somit auch bei einem Linien-Scanner bei allen denkbaren Stativanbindungen eine wirksame Vermeidung der beschriebenen Interferenzstreifen.
• Bei einem großen Keilwinkel des Strahlvereinigers und schlechter AR-Beschichtung wird der Strahlvereinigerkeil „Geisterbilder“ verursachen. zeigt die für ein bestimmtes Verhältnis von Nutzsignal und 1. Reflex erforderlichen Entspiegelungseigenschaften eines Strahlvereinigerkeils von etwa 0.7'. Die praktisch nicht störendende Größe von T₁/T₀=0.01 liefert dann R₂>0.01, was technologisch für beide Polarisationskomponenten s und p sicher beherrscht wird. Anders als bei einem planparallelen Strahlvereinigersubstrat ermöglicht eine keilförmige Strahlvereinigergeometrie somit bereits bei AR-Beschichtungen mit einer Reflektivität von R₂≈ 1 % eine effiziente Vermeidung von Geisterbildern und Interferenzstreifen. Da sich diese Anforderung für beide Polarisationskomponenten problemlos realisieren lässt, können dieselben Strahlvereinigerkeile bei beliebigen Polarisationsverhältnissen der einfallenden Laserstrahlen verwendet werden. Der definierte Keilwinkel erlaubt somit auch die Verwendung desselben Strahlvereinigertyps bei verschiedenen Anbaupositionen der Scan-Module am Mikroskopstativ.
• In der ist dreidimensional ein Strahlteiler dargestellt, wie er beispielsweise in einem motorisierten Strahlteilerwechsler angeordnet ist.
• A ist die vorzugsweise in einem 45 Grad Winkel zur optischen Achse des einfallenden Lichtes angeordnete Teilerfläche.
• Hier ist der Strahlengang eines inversen Mikroskops schematisch dargestellt, d.h. die Probe wird von unten beleuchtet.
• Ein beispielsweise von unten kommender Strahlengang einer Manipulationsbeleuchtungseinheit durchläuft den Strahlteiler in Transmission und wird über die Teilerfläche A mit dem Strahlengang einer bildgebenden Einheit (Reflektion am Strahlvereiniger) vereinigt, wodurch beide Strahlen mit gleicher Einfallsrichtung auf die Probe gelangen.
• In der ist ein bezüglich des Keilwinkels stark vergrößerter Querschnitt entlang der Linie S in 5a) dargestellt, um den Keilwinkel der Teilerfläche zu verdeutlichen.
• Ein Anstieg bzw. Abfall des Querschnittes erfolgt in einem Winkel ungleich Null Grad zu der Ebene, die von den Strahlen „Man“ und „Im“ (vgl. } aufgespannt wird.
• Die beschriebene Lösung hat den Vorteil, daß sie im Durchgang auch bei Substraten mit 2mm Dicke noch keinen wesentlichen Einfluß auf die Abbildungseigenschaften (Pupillenausleuchtung, Farbquerfehler) des durchgehenden Lichtes hat. Bei Einsatz von Strahlvereinigern mit keilförmiger Geometrie kommt es somit zu keinen störenden Aberrationen und Bildartefakten.
• Weitere Lösungen mit dicken Substraten und großen Keilfehlern sind denkbar. Sie bieten eine gute Stabilität und sind technologisch leicht beherrschbar, erfordern allerdings eine separate Korrektur des durchgehenden Strahlweges.
• Verallgemeinernd können die beschriebenen Strahlvereiniger mit definiertem Keilwinkel zum Zusammenführen der Strahlengänge von beliebigen bildgebenden und manipulierenden Systemen verwendet werden. Neben (konfokalen) Punkt- und Linien-Scannern kann es sich hierbei insbesondere auch um multifokale Laserscan-Systeme (z.B. auf Basis von Linsenarrays, Diodenlaser-Arrays, beliebiger Strahlteileranordnungen) und Spinning Disk Systeme/Nipkow-Systeme handeln. Darüber hinaus ist auch eine vorteilhafte Verwendung der beschriebenen keilförmigen Strahlvereiniger bei der simultanen Probenmanipulation und/oder Bildgebung mit Hilfe von (strukturierten) Weitfeld-Beleuchtungssystemen denkbar; insbesondere dann wenn diese mit kohärenten Lichtquellen (Laser) ausgerüstet sind.
• Die beschriebene Erfindung betrifft unter anderem folgende applikative Schwerpunkte:
• • Entwicklung von Organismen: Analyse lebender Zellen in einer 3D-Umgebung (insbesondere einem 3D-Gewebeverband) mit Markierungen und Pharmaka, die gezielt
  • - durch Laserbeleuchtung gebleicht (z.B. FRET-Experimente)
  • - durch Laserbeleuchtung gebleicht und gleichzeitig auch außerhalb der ROI beobachtet werden sollen (z.B. FRAP- und FLIP-Experimente in 3D)
  • - manipulationsbedingte Änderungen durch Laserbeleuchtung aufweisen (z.B. Aktivierung bzw. Uncaging von Transmittern in 3D)
  • - manipulationsbedingte Farbänderungen durch Laserbeleuchtung aufweisen (z.B. paGFP, Dronpa, Kaede)
• • innerzelluläre Transportvorgänge, deren Dynamik (meist im Bereich von Hundertstelsekunden) oftmals durch Methoden wie FRAP mit ROI-Bleichen untersucht wird. Beispiele für solche Studien sind z.B. hier beschrieben:
  • - Umenishi, F. et al. beschreiben 2000 in Biophys J., 78:1024-1035 eine Analyse der räumlichen Beweglichkeit von Aquaporin in GFP-transfizierten Kulturzellen. Hierzu wurden in den Zellmembranen Punkte gezielt lokal gebleicht und die Diffusion der Fluoreszenz in der Umgebung analysiert.
  • - Gimpl, G. et al. beschreiben 2002 in Prag. Brain Res., 139:43-55 Experimente mit ROI-Bleichen und Fluoreszenzimaging zur Analyse der Mobilität und Verteilung von GFP-markierten Oxytocin-Rezeptoren in Fibroblasten. Dabei stellen sich hohe Anforderungen an die räumliche Positionierung und Auflösung sowie die direkte zeitliche Folge von Bleichen und Imaging.
  • - Zhang et al. beschreiben 2001 in Neuron, 31:261-275 live cell Imaging von GFP-transfizierten Nervenzellen, wobei die Bewegung von Granuli durch kombiniertes Bleichen und Fluoreszenzimaging analysiert wurde. Die Dynamik der Nervenzellen stellt dabei hohe Anforderungen an die Geschwindigkeit des Imaging.
• • Wechselwirkungen von Molekülen:
  • Die beschriebene Erfindung ist insbesondere für die Darstellung molekularer und anderer subzellulärer Wechselwirkungen geeignet. Hierbei müssen sehr kleine Strukturen mit hoher Geschwindigkeit (im Bereich um die Hundertstelsekunde) dargestellt werden. Um die für die Wechselwirkung notwendige räumliche Position der Moleküle aufzulösen, sind auch indirekte Techniken wie z.B. FRET mit ROI-Bleichen einzusetzen.
• • Signalübertragung zwischen Zellen:
  • Aktivierung bzw. Freisetzung (Uncaging) von Transmittern bzw. direkte Zell-Stimulation durch Lasereinstrahlung

Claims (5)

1. Mikroskop umfassend einen Strahlvereiniger zur Vereinigung von zwei Beleuchtungsstrahlen zur Abtastung und/oder Beeinflussung einer Probe, wobei eine teilreflektierende Schicht zur Vereinigung der Beleuchtungsstrahlen vorgesehen ist und der Strahlvereiniger über den optisch wirksamen Querschnitt des Strahlvereinigers eine stetige Änderung in Form einer stetigen Zunahme oder einer stetigen Abnahme aufweist, so dass der Strahlvereiniger in der als Keilrichtung bezeichneten Richtung der Änderung einen keilförmigen Querschnitt aufweist und der Strahlvereiniger in den Strahlengängen der Beleuchtungsstrahlen angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass - die Keilrichtung unter einem Winkel ungleich Null zu einer durch die Strahlengänge aufgespannten Ebene verläuft und - das Mikroskop ein punktscannendes oder linienscannendes und/oder multifokales und/oder Nipkow-basiertes Mikroskop ist.
2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Keilrichtung unter einem Winkel von 45° zu der Ebene verläuft.
3. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsstrahlen unabhängig voneinander in mindestens einer Richtung beweglich sind.
4. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsstrahlen Licht eines Manipulationssystems und eines bildgebenden Systems sind.
5. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Strahlvereiniger quaderförmige Außenkanten aufweist und die Keilrichtung in Richtung einer Quaderkante verläuft.

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