DE102005000915A1 - Vorrichtung zur multifokalen konfokalen mirkoskopischen Bestimmung der räumlichen Verteilung und zur multifokalen Fluktuationsanalyse von fluoreszenten Molekülen und Strukturen mit spektral flexibler Detektion - Google Patents
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Abstract
Bei einem Verfahren für FCS mit multifokaler Beleuchtung und/oder Detektion wird eine Probe an vielen Punkten parallel und gleichzeitig untersucht.
Description
- Aus der Literatur und aus der Praxis bekannte Systeme für die Kombination von Fluoreszenzmikroskopie mit FCS bestehen z.B. aus einem CLSM, das zur Bildgebung an einen optischen Port eines Mikroskopstativ angeschlossen wird, und aus einer separaten Beleuchtungs- und Detektionseinheit für FCS, die an einen anderen Port des Stativs angeschlossen ist und zur Aufzeichnung und Weiterverarbeitung des Fluoreszenzsignals an jeweils einem Punkt dient (Zeiss). In einer anderen Realisierung erfolgt die Fluoreszenzmikroskopie über einen Epifluoreszenzaufbau und die FCS-Messung über eine separate Einheit wie eben beschrieben (Brock, 1999). In einer anderen Realisierung erfolgt die Bildgebung mit einem CLSM und die FCS-Anregung und Detektion über die gleiche Optik unter Verwendung der gleichen (DKFZ) oder separater Detektoren (Leica).
- Allen diesen Systemen ist es zu eigen, dass insbesondere die FCS-Messung nur an einem Punkt der Probe zur Zeit durchgeführt werden kann, und dass die FCS-Messung mit konventionellen Strahlteilern und Detektionsfiltern ausgeführt wird. Die inhärente, relativ lange Dauer einer FCS-Messung von mindestens wenigen Sekunden macht es sehr schwierig, verschiedene Messpunkte miteinander zu vergleichen, da in typischen Anwendungen lebende Zellen untersucht werden, die Bewegungen und strukturelle Veränderungen im Sekundenbereich und schneller zeigen und damit eine wohldefinierte Positionierung innerhalb der Probe für verschiedene Messpunkte nacheinander schwierig oder unmöglich machen. Insbesondere die Verwendung der Ergebnisse einer FCS-Analyse (wie oben beschrieben) als kontrastgebendes Signal zur Bildgebung in ein, zwei oder drei Dimensionen wird damit schwierig bis unmöglich. Außerdem müssen die für die FCS-Messung verwendeten Detektoren eine sehr hohe Quantenausbeute und ein sehr gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis aufweisen, um im für FCS-Messungen benötigten Photonenzählbetrieb verwendet werden zu können. Es werden vorwiegend Avalanche-Photodioden (APDs) verwendet, die eine sehr kleine Detektorfläche besitzen und daher für spektrale Detektion, wie sie bisher verwendet wird (Leica, Zeiss), nicht geeignet sind.
- Die Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie, z.B. konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM), und konfokaler Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, z.B. Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie (FCS), erlaubt die gleichzeitige bildgebende Bestimmung der räumlichen Verteilung fluoreszenter Moleküle in einer Probe und der Dynamik dieser Moleküle z.B. in Folge von Bewegungsprozessen wie gerichtetem Transport und ungerichteter Diffusion. In bestehenden und aus der Literatur bekannten Systemen kann für die Fluoreszenzfluktuationsanalyse jeweils nur ein Punkt zur Zeit beleuchtet werden und das zugehörige Fluoreszenzsignal aufgezeichnet und weiterverarbeitet werden. In einem Rasterscan-Verfahren können verschiedene Punkte der Probe nacheinander angefahren werden. Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur gleichzeitigen Beleuchtung mehrerer Punkte der Probe (z.B. entlang einer Linie) und zur gleichzeitigen parallelen Aufzeichnung und Weiterverarbeitung des Fluoreszenzsignals von diesen Punkten. Die Weiterverarbeitung beinhaltet eine Autokorrelationsanalyse eines und/oder die Kreuzkorrelationsanalyse mehrerer spektraler Detektionskanäle, die Analyse der Intensitätsverteilungshistogramme in verschiedenen Kanälen und ähnliche Methoden, im Folgenden zusammenfassend FCS-Messung genannt. Insbesondere kann die Detektion des Fluoreszenzsignals mit Hilfe eines Spektrometers erfolgen, das eine flexible und frei wählbare Aufteilung der Fluoreszenz in verschiedene Kanäle ermöglicht. Mit Hilfe eines Strahlscanners zur Bewegung der Anregungspunkte über die Probe oder eines Probenscanners zur Bewegung der Probe über die Anregungspunkte können systematisch verschiedene Sätze von Punkten der Probe angefahren werden, um die räumliche Verteilung der Fluoreszenz aufzuzeichnen und ortsaufgelöst die dynamischen Eigenschaften zu bestimmen.
- Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die räumliche Verteilung von fluoreszenten Molekülen in einer Probe mit spektral aufgelöster Detektion in einem oder mehreren Kanälen bildgebend zu bestimmen und ihre Dynamik mit Hilfe einer FCS-Analyse an einer Vielzahl von Punkten, die zum Beispiel entlang einer Linie liegen, in einem oder mehreren spektralen Kanälen gleichzeitig parallel zu erfassen.
- Mit Hilfe einer Scanvorrichtung, bei der entweder die Punkte der Beleuchtung und Detektion über die Probe oder die Probe über die Punkte der Beleuchtung und Detektion bewegt werden, können systematisch im Rasterscanverfahren viele Probenorte und damit z.B. die gesamte Probe erfasst werden. Die FCS-Messung an einem Punkt dauert typischerweise mehrere Sekunden. Durch die Parallelisierung werden viele Punkte gleichzeitig erfasst und die Messung an verschiedenen Punkten insgesamt beschleunigt. Neben der reinen Fluoreszenzintensität wie für Fluoreszenzmikroskopie bekannt können damit Ergebnisse der FCS-Messung wie z.B. Korrelationszeiten dynamischer Prozesse (Triplett-Kinetik, Diffusion), Teilchenzahlen, molekulare Helligkeiten oder Wechselwirkungsparameter von mit unterschiedlichen Fluoreszenzen markierten Molekülen als kontrastgebendes Signal zur Bildgebung verwendet werden. Außerdem soll das Fluoreszenzlicht mit frei und stufenlos einstellbarer spektraler Detektion und mit der für FCS benötigten Quantenausbeute und dem für FCS benötigten Signal-zu-Rausch-Verhältnis aufgenommen werden, z.B. auf Detektoren in Form von einzelnen Punkten oder Anordnungen von Punkten insbesondere entlang einer Linie (Linien-/Zeilendetektor).
- Bei vergleichbar guter räumlicher Auflösung eines multifokalen CLSM, z.B. eines Linescanners, ist die Bildaufnahme im Vergleich zu einem Punktscanner deutlich schneller.
- Auch die FCS-Messung an verschiedenen Punkten wird durch die gleichzeitige parallele Aufnahme verschiedener Punkte deutlich beschleunigt im Vergleich zu Systemen mit einem Fokus, da an verschiedenen Punkten gleichzeitig statt nacheinander FCS-Messungen durchgeführt werden können. Dies erlaubt die Verwendung der Ergebnisse einer FCS-Messung als kontrastgebende Signale zur Bildgebung.
- Die Kombination von FCS mit spektral flexibler Detektion, d.h. Wechseln des spektralen Detektionsbereichs ohne Filterwechsel o.ä., erlaubt eine schnelle Anpassung an verschiedene experimentelle Bedingungen.
- Die Kombination von FCS mit CLSM in einem optischen System/Aufbau erlaubt eine sehr gut reproduzierbare und kalibrationsfreie Identifizierung von FCS-Messpunkten in einem CLSM-Bild.
- Die Kombination von FCS mit spektral flexibler Detektion, d.h. Wechseln des spektralen Detektionsbereichs ohne Filterwechsel o.ä., erlaubt spektrale Überbestimmung, d.h. es gibt mehr Detektionskanäle als Typen von Fluorophoren, was wiederum das Signal-zu-Rausch-Verhältnis verbessern kann.
- Die gleichzeitige Messung des Fluoreszenzsignals an verschiedenen Punkten erlaubt mittels einer zeitlich-räumlichen Korrelationsanalyse der Signale von verschiedenen Punkten die Messung von Eigenschaften gerichteter Transportprozesse wie Richtung und Geschwindigkeit, insbesondere wenn die Messpunkte entlang einer geraden Linie angeordnet sind.
- Die gleichzeitige FCS-Messung an verschiedenen Punkten in nichtstrukturierten Proben wie fluoreszenten Molekülen in Lösung erlaubt eine deutlich schnellere Bestimmung von Eigenschaften wie Teilchenkonzentration, Diffusionskoeffizient und Wechselwirkung von unterschiedlichen Molekülspezies, da anstelle einer langen FCS-Messung an einem Punkt nun viele kurze gleichzeitige FCS-Messungen zu den gleichen Ergebnissen bei gleicher statistischer Güte führt.
- Besonders vorteilhafte Aufführungen beinhalten beispielsweise:
- • FCS mit multifokaler Beleuchtung/Detektion, d.h., vorzugsweise an vielen Punkten parallel und gleichzeitig und/oder
- • FCS mit Detektion in einem Spektrometer und einem oder mehreren spektral flexiblen, stufenlos einstellbaren Detektionskanälen und/oder
- • CLSM mit multifokaler Beleuchtung/Detektion kombiniert mit Detektion in einem Spektrometer und einem oder mehreren spektral flexiblen, d.h. programmierbaren, Detektionskanälen und/oder
- • Multifokal kann insbesondere heißen: Viele Punkte gleichzeitig entlang einer Linie (Linescanning-System) und/oder
- • Die Kombination des multifokalen Aufbaus, insbesondere des Linienscanners, mit lateral strukturierter Beleuchtung und/oder interferometrisch bedingter axialer Auflösungsverbesserung (z. B. 4Pi-Aufbau).
- In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Bauteile mit denselben Bezugszeichen versehen sind.
-
1 zeigt eine mögliche Realisierung eines Linienscanners, wie er z.B. in (Pawley, 1995) beschrieben wird, als Umsetzung des multifokalen Konzepts. Licht aus einem oder mehreren Lasern (30 ) wird mittels Optik (31 ) in eine Faser (32 ) gekoppelt und mit Hilfe einer Auskoppel-/Kollimationsoptik (33 ) kollimiert in eine Strahlzusammenführung (34 ) geführt. Dies kann auch kaskadiert zur Zusammenführung mehrerer Laser erfolgen. Das kollimierte Licht (35 ) kann durch eine anamorphotische Strahlaufweitung asymmetrisch in x und y aufgeweitet werden, da es in x auf einen Punkt und in y auf eine Linie fokussiert wird. Das Laserlicht wird durch einen Strahlteiler (36 ) und eine zylindrische Linse (37 ) geführt, die so ausgerichtet ist, dass sie in x keine Wirkung hat und in y das Licht auf die Mitte eines um die senkrecht dazu stehende Mittellinie drehbaren Spiegels (38 ) fokussiert. Dieser kann wohldefiniert gedreht werden, z.B. mit einem Galvanometer-Antrieb. Die Mitte des Spiegels liegt gleichzeitig in der Brennebene einer sphärischen Scanlinse (39 ), bevorzugt einer sogenannten F-Theta-Linse, die die Drehung des Lichtbündels mit Hilfe des Spiegels in eine laterale Bewegung in x in der Zwischenbildebene (40 ) eines Mikroskops (41 ) umwandelt. Gleichzeitig fokussiert sie das Licht in x auf einen Punkt und in y auf eine Linie in der Zwischenbildebene (40 ). Diese Linie wird mit Hilfe der Tubuslinse (42 ) und des Objektivs (43 ) in die objektseitige Brennebene (44 ) des Mikroskops abgebildet. Das durch Laserlicht angeregte Fluoreszenzlicht wird durch die gleiche Optik wieder eingesammelt, vom Anregungslicht mit Hilfe des Strahlteilers (36 ) getrennt und auf die spektrale Detektionseinheit (45 ) geleitet. Dort wird es mit Hilfe eines oder mehrerer dispersiver Elemente (46 ) und mit Filtern mit festen oder frei wählbaren spektralen Eigenschaften sowie mit Hilfe geeigneter, z.B. zylindrischer Optiken (47 ) auf einen oder mehrere Liniendetektoren (48 ) geführt. Zwischen den Detektoren (48 ) und dem Strahlteiler (36 ) können sich noch Schlitzblenden in einer zu (40 ) konjugierten Bildebene befinden, die die Konfokalität gewährleisten. Insbesondere kann eine anamorphotische Strahlweitenanpassung vor oder hinter dem dispersiven Element (46 ) eingefügt werden. Die Linie in der Objektebene (44 ) wird somit erst durch das Mikroskop in die Zwischenbildebene (40 ) und dann auf den Liniendetektor (48 ) abgebildet. Zur Bildaufnahme wird die Linie durch Drehung des Scannerspiegels (38 ) systematisch durch die Probe bewegt und das Signal dazu synchronisiert auf den Detektoren (48 ) aufgezeichnet, so dass an einem Computer die räumliche Verteilung von fluoreszenten Molekülen/Strukturen rekonstruiert werden kann. Da die Punkte einer ganzen Linie simultan statt seriell aufgenommen werden, kann eine deutlich höhere Bildrate erreicht werden als bei einem Punktscanner. Zur FCS-Messung kann eine Linie in einem zuvor aufgenommenen Bild ausgewählt werden, die dann durch eine entsprechende feste Drehstellung des Scannerspiegels (38 ) für eine wählbare Zeit beleuchtet wird. Das Fluoreszenzlicht von Punkten entlang dieser beleuchteten Linie wird gleichzeitig parallel aufgezeichnet und entsprechend einer FCS-Messung weiterverarbeitet. Als Liniendetektoren kommen einzelne Zeilen von CCD- oder CMOS-Array-Chips, CCD- oder CMOS-Linien-Chips oder lineare Anordnungen von Photodioden oder Photomultipliern in Frage. Insbesondere Avalanchephotodioden (APDs) und CCD- oder CMOS-Arrays sind aufgrund ihrer besonders hohen Quantenausbeute und des gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis geeignet. - In einer möglichen Erweiterung wird bei (
35 ) mit Hilfe geeigneter Elemente wie der Interferenzüberlagerung leicht in y verkippter Laserstrahlen, einem Neutralfilter mit in y periodischer Transmission oder einem in y periodischen Transmissionsgitter eine strukturierte Beleuchtung in y aufgeprägt, die in die Probe abgebildet wird und das Auflösungsvermögen verbessert. - In einer anderen Erweiterung wird das Licht, wie aus der punktkonfokalen 4Pi-(Pawley, 1995) und der Standing-Wave-Epifluoreszenzmikroskopie bekannt, auf zwei einander gegenüberstehende Objektive aufgeteilt, so dass durch Interferenz eine zusätzliche Verbesserung der Auflösung entlang der optischen Achse erreicht wird.
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2 zeigt eine Erweiterung des in1 gezeigten Aufbaus, bei dem eine zylindrische Linse (49 ) das Licht in x auf einen Punkt fokussiert und in y unverändert lässt. Dieser Punkt liegt in der Brennebene einer sphärischen Linse (50 , Idealerweise mit den gleichen Eigenschaften wie die Scanlinse,39 ), in deren anderer Brennebene sich der drehbare Galvanometerspiegel (38 ) befindet und die die Strahlen in x wieder kollimiert und in y auf die Drehachse des Galvanometerspiegel (38 ) fokussiert. - Die dargestellten Strahlengänge für einen Linienscanner zur Bildnahme und FCS-Messung sind beispielhaft und lassen sich auch in modifizierter Form realisieren.
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3 zeigt mögliche Realisierungen spektraler Detektionseinheiten (45 ) mit festen oder wählbaren spektralen Bereichen der Detektionskanäle, die sowohl für Punktdetektoren mit sphärischer Optik als auch für Liniendetektoren mit zylindrischer Optik geeignet sind. - Realisierung (A) ist Stand der Technik (Pawley, 1995) mit dichroitischen Spiegeln (
2 ) und Filtern (3 ), die so gewählt werden, dass die gewünschten Ausschnitte aus dem Spektrum des einfallenden kollimierten Lichts (1 ) mit Hilfe der Linsen (4 ) auf die Detektoren (6 ) mit ihren lichtempfindlichen Bereichen (7 ) fallen. Der lichtempfindliche Bereich (7 ) kann punktförmig oder eine Linie von Punktdetektoren, d.h. ein Liniendetektor, sein. Die dargestellte Zahl von 3 Kanälen ist nur ein Beispiel. Realisierungen (B), (C), (D), (E), (F), (G) und (H) sind neu im Sinne der Erfindung, da sie für einen frei wählbaren spektralen Bereich eine Detektion mit einem für die FCS Messung geeigneten Detektor erlauben, der im Vergleich zu einem Photomultiplier eine deutlich kleinerer Detektionsfläche besitzt. - In Realisierung (B) wird das kollimierte Licht (
1 ) mit Hilfe eines dispersiven Elements, z.B. einem Prisma (8 ), spektral in ein Bündel von parallelen Strahlen (9 ) aufgespalten. Dabei ist der Ablenkungswinkel durch das dispersive Element abhängig von der Wellenlänge des Lichts. Eine Linse (10 ) ist so angeordnet, dass ihre Brennweite deutlich kleiner ist als ihr Abstand von dem anscheinenden Drehpunkt (11 ) des Lichtbündels. Dann fokussiert sie das Licht in zur optischen Achse geneigten konvergenten Strahlen in die Brennebene (12 ). Dort befindet sich ein fokussiertes Bild des Spektrums. Die hinter der Brennebene divergenten Strahlen laufen in einer Ebene (13 ) zusammen, wo sie auf einen Detektor (6 ) fallen. Mit Hilfe von verschiebbaren absorbierenden und/oder reflektierenden Blenden (14 ), die sich bevorzugt in der Brennebene (12 ) befinden und auch als Paar in Kombination einer absorbierenden und einer reflektierenden Version ausgeführt sein können, können die spektralen Bereiche ausgewählt werden, die auf den auf der optischen Achse liegenden Detektor und auf die aus der Achse gedrehten Detektoren (6 ) fallen. Eine(n) ausreichend kleine(n) Strahldurchmesser/Strahlbreite auf dem Detektor erhält man, wenn der Abstand der Linse (10 ) vom Drehpunkt (11 ) deutlich größer als die Brennweite von (10 ) und außerdem Strahldurchmesser/-breite bei (9 ) möglichst klein sind. Eine möglichst gute spektrale Auflösung erhält man, wenn die Divergenz der Strahlen bei (9 ) möglichst groß ist. - Realisierung (C) entspricht (B). Jedoch befinden sich die Blenden-/Spiegelschieber (
14 ) hier vor der Linse (10 ). Durch Verschieben werden aus den kollimierten Strahlen (9 ) die gewünschten spektralen Bereiche gewählt, die entweder auf den auf der optischen Achse liegenden Detektionsstrahlengang (bestehend aus Linse,10 , und Detektor,6 ) oder auf die aus der optischen Achse gedrehten, zu (10 ,6 ) konjugierten Detektionsstrahlengänge (15 ,6 ) geführt werden. Auch in dieser Umsetzung sind eine möglichst große Divergenz und/oder möglichst geringer) Strahldurchmesser/-breite der Bündel kollimierter Strahlen bei (9 ) wünschenswert. - Realisierung (D) zeigt, dass das dispersive Element ein Prisma (
11 ), ein Gitter (16 ) oder jedes andere Element sein kann, das kollimiert einfallendes Licht in ein Bündel spektral aufgespaltener kollimierter Strahlen aufteilt, wobei der Ablenkungswinkel von der Wellenlänge abhängt. - Realisierung (E) zeigt eine Vorrichtung, die mit einem Teleskop (realisiert z.B. mit den Linsen (
18 ) und (19 ) als Kepler'sche Anordnung, kann aber auch anders umgesetzt werden) Strahldurchmesser/-breite bei (9 ) um einen Faktor verkleinert und die Divergenz der kollimierten Bündel bei (9 ) um den gleichen Faktor vergrößert, so dass man bei (20 ) im Vergleich zu (9 ) die wünschenswerten Anforderungen von (B) und (C) besser erfüllt. Der Brennpunkt von Linse (18 ) liegt dabei im anscheinenden Drehpunkt (11 ). - Bei der Realisierung in (F) wird ausgenutzt, dass in einem Kepler'schen Teleskop eine reale Zwischenbildebene existiert. Das divergente Bündel kollimierter Strahlen wird dort als scharfes Spektrum abgebildet, so dass in der Zwischenbildebene mit den Verschiebeblenden (
14 ) spektrale Bereiche ausgewählt und auf den auf der optischen Achse gelegenen (19 ,10 ,7 ) oder auf die aus ihr verkippten Detektionsstrahlengänge (21 ,22 ,7 ) geleitet werden und auf die Detektoren wie in (E) dargestellt fallen. - In der Realisierung (G) wird das durch die Linse (
18 ) erzeugte fokussierte Spektrum mittels Verschiebeblenden (14 ) spektral selektiert auf verschiedene Strahlengänge, (23 ,7 ) und (24 ,7 ), aufgeteilt. Die Linsen (23 ) und (24 ) sind so angeordnet, dass sie in (12 ) ein invertiertes Bild des Spektrums erzeugen. Da der Brennpunkt von (18 ) in (11 ) liegt, bewirkt die Inversion ein Zusammenfallen aller konvergenter Strahlen in Ebene (13 ), vor der Brennebene (12 ). Dort ist der Detektor positioniert. Der Abstand der Linsen (23 ) und (24 ) ist dabei deutlich kleiner als der Abstand des fokussierten Spektrums zwischen der Linse (18 ) und den Linsen (23 ) und (24 ), so dass der/die Strahldurchmesser/-breite in (13 ) möglichst klein ist. - Die Realisierung (H) zeichnet sich dadurch aus, dass das divergente Bündel kollimierter Strahlen (
9 ) durch ein weiteres, um 180° gedrehtes Prisma (25 ) geführt wird, so dass ein paralleles Bündel kollimierter Strahlen (26 ) entsteht. Die Position senkrecht zur Strahlrichtung hängt von der Wellenlänge ab. Aus diesem parallelem Bündel kollimierter Strahlen können mittels Verschiebeblenden (14 ) spektrale Bereiche ausgewählt werden, die mittels der Linsen (27 ) und (28 ) auf verschiedene Detektoren (6 ) fokussiert werden. Dabei ist ein möglichst großer Abstand der Prismen und eine) möglichst kleiner) Strahldurchmesser/-breite bei (9 ) wünschenswert, um eine möglichst gute spektrale Auflösung zu erhalten.
Claims (20)
- Vorrichtung für FCS mit multifokaler Beleuchtung und/oder Detektion.
- Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe an vielen Punkten parallel und gleichzeitig untersuchbar ist.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Spektrometer vorgesehen ist.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere spektral flexible, vorzugsweise stufenlos einstellbaren Detektionskanäle vorgesehen sind.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Mikroskop, insbesondere ein konfokales Rastermikroskop, beinhaltet.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Linescanning-System umfasst.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch einen multifokalen Aufbaus, insbesondere des Linienscanners, durch lateral strukturierter Beleuchtung und/oder interferometrisch bedingter axialer Auflösungsverbesserung (z. B. 4Pi-Aufbau).
- Mikroskop, vorzugsweise konfokales Mikroskop mit multifokaler Beleuchtung und/oder Detektion mit Detektion in einem Spektrometer und einem oder mehreren spektral flexiblen, d.h. programmierbaren, Detektionskanälen.
- Mikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe an vielen Punkten parallel und gleichzeitig untersuchbar ist.
- Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Spektrometer vorgesehen ist.
- Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere spektral flexible, vorzugsweise stufenlos einstellbaren Detektionskanäle vorgesehen sind.
- Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Linescanning-System umfasst.
- Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 12, gekennzeichnet durch einen multifokalen Aufbaus, insbesondere des Linienscanners, durch lateral strukturierter Beleuchtung und/oder interferometrisch bedingter axialer Auflösungsverbesserung (z. B. 4Pi-Aufbau).
- Verfahren zur FCS-Untersuchung einer Probe, gekennzeichnet durch multifokaler Beleuchtung und/oder Detektion.
- Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe an vielen Punkten parallel und gleichzeitig untersucht wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Spektrometer zur Detektion vorgesehen ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere spektral flexible, vorzugsweise stufenlos einstellbaren Detektionskanäle vorgesehen sind.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroskop, insbesondere ein konfokales Rastermikroskop, verwendet wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die auf einmal zu untersuchenden Punkte in einer Linie liegen.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, gekennzeichnet durch die Verwendung einen multifokalen Aufbaus, insbesondere des Linienscanners, durch lateral strukturierter Beleuchtung und/oder interterometrisch bedingter axialer Auflösungsverbesserung (z. B. 4Pi-Aufbau).
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