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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer Probe. Bei einem solchem Verfahren wird ein Probenbereich der Probe in einer Lichtblattebene mit zu einem Lichtblatt geformten Licht beleuchtet. Von dem Probenbereich abgestrahltes Licht wird entlang einer axialen Detektionsrichtung, die mit der Lichtblattebene einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, über ein Detektionsobjektiv in den Strahlengang eines Weitfeldmikroskops eingekoppelt. Dort wird es auf einen flächenförmigen Detektor geleitet. Im Detektor wird pixelweise die Intensität registriert, diese registrierten Werte werden in Sätze von Bilddaten von Bildern umgewandelt. Die Bilder können aus den Sätzen von Bilddaten unmittelbar dargestellt werden, sie können weiterverarbeitet und modifiziert werden, sie können auch für eine spätere Verarbeitung gespeichert werden.
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Die Untersuchung biologischer Proben, bei der die Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt erfolgt, dessen Ebene die optische Achse der Detektion in einem von Null verschiedenen Winkel schneidet, hat in jüngster Zeit stark an Bedeutung gewonnen. Üblicherweise schließt das Lichtblatt dabei mit der Detektionsrichtung, die in der Regel der optischen Achse des Mikroskopobjektivs entspricht, einen von Null verschiedenen, meist einen rechten Winkel ein. Solche Untersuchungsverfahren werden überwiegend in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt und unter dem Begriff LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy) zusammengefasst. Ein Beispiel ist das in der der
DE 102 57 423 A1 und der darauf aufbauenden
WO 2004/0535558 A1 beschriebene und als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichnete Verfahren, mit dem sich in relativ kurzer Zeit räumliche Aufnahmen auch dickerer Proben erstellen lassen: Auf der Basis von optischen Schnitten kombiniert mit einer Relativbewegung in einer Richtung senkrecht zur Schnittebene ist eine bildliche, räumlich ausgedehnte Darstellung der Probe möglich.
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Gegenüber anderen etablierten Verfahren wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen-Mikroskopie weisen die LSFM-Verfahren mehrere Vorzüge auf. Da die Detektion im Weitfeld erfolgen kann, lassen sich größere Probenbereiche erfassen. Zwar ist die Auflösung etwas geringer als bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, jedoch lassen sich mit der LSFM-Technik dickere Proben analysieren, da die Eindringtiefe höher ist. Darüber hinaus ist die Lichtbelastung der Proben bei diesen Verfahren am geringsten, was die Gefahr des Ausbleichens einer Probe reduziert, da die Probe nur durch ein dünnes Lichtblatt in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung beleuchtet wird.
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Anstelle eines rein statischen Lichtblatts kann auch ein quasi-statisches Lichtblatt erzeugt werden, indem die Probe mit einem Lichtstrahl schnell abgetastet wird. Die lichtblattartige Beleuchtung entsteht, indem der Lichtstrahl einer sehr schnellen Relativbewegung zu der zu beobachtenden Probe unterworfen wird und dabei zeitlich aufeinanderfolgend mehrfach aneinandergereiht wird. Dabei wird die Integrationszeit der Kamera, auf deren Sensor die Probe abgebildet wird, so gewählt, dass die Abtastung innerhalb der Integrationszeit abgeschlossen wird.
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Aufgrund der Beleuchtung mit einem sehr dünnen Lichtblatt, die meist auch rechtwinklig zur Detektionsachse erfolgt, wird nur ein kleiner axialer Teil der Probe im Detektionsvolumen beleuchtet und somit ein optischer Schnitt erzeugt. Um einen anderen Bereich der Probe zu beobachten wird die Probe, unabhängig von der Optik, mit einer Positioniereinheit für die Probe durch das Lichtblatt gefahren. Diese Positioniereinheit kann beispielsweise einen ansteuerbaren Probentisch, der in allen drei Raumrichtungen beweglich ist, umfassen. Dabei werden entlang der optischen Achse des Detektionsobjektivs optische Schnitte an verschiedenen Probenpositionen aufgenommen. Anhand der Bildstapel lässt sich ein räumliches Bild der Probe rekonstruieren.
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Das Lichtblatt liegt dabei im räumlichen Mittel in einer Lichtblattebene, weist jedoch selbst eine endliche Dicke, d.h. eine axiale Ausdehnung in einem Bereich ober- und unterhalb der Lichtblattebene auf, wobei seine Dicke in Ausbreitungsrichtung variiert und in der Regel im Bereich der optischen Achse des Detektionsobjektivs, dem Zentrum des Gesichtsfeldes, am dünnsten ist. Aufgrund des optischen Schnitts, d.h. der Lokalisierung des Lichtblattes in einer Lichtblattebene, werden keine Fluoreszenzsignale außerhalb des Fokusvolumens bzw. der Lichtblattebene detektiert, das Hintergrundsignal, d.h. das Signal fluoreszierender Bestandteile aus höher oder tiefer liegenden Schichten des Präparates, ist reduziert. Gegenüber üblichen Weitfeldmikroskopen führt dies zu einer deutlichen Verbesserung im Signal-Rausch-Verhältnis.
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Die Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt in einer Lichtblattebene, die nahezu senkrecht zur Detektionsrichtung liegt, wirkt somit wie ein schwacher konfokaler Filter, da Anteile ober- und unterhalb des vom Lichtblatt erfassten Bereichs nicht angeregt und somit gewissermaßen ausgeblendet werden. Die Stärke oder Wirkung dieses Filters hängt dabei von dem Verhältnis der Lichtblattdicke zum axialen Auflösungsvermögen des Detektionsobjektivs ab. Je dünner das Lichtblatt ist, desto besser ist grundsätzlich die Filterwirkung. Im Idealfall ist das Lichtblatt immer dünner als das axiale Auflösungsvermögen des Detektionsobjektivs und der daran hängenden Optik; in diesem Fall definiert das Lichtblatt das axiale Auflösungsvermögen des Gesamtsystems und die Stärke des konfokalen Filters skaliert linear mit der axialen Ausdehnung des Lichtblattes.
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Bei Detektionsobjektiven mit hoher numerischer Apertur, also beispielsweise mit einer numerischen Apertur von 0,8 und mehr, lässt sich dieser Idealfall meist nicht mehr realisieren. Je nach numerischer Apertur liegt das axiale Auflösungsvermögen der Detektionsoptik nur noch zwischen 0,5 µm und 3 µm, die Dicke des Lichtblattes im Zentrum kann jedoch nicht wesentlich unter einen Wert von 2 µm gedrückt werden, ohne das nutzbare Gesichtfeld zu stark einzuschränken. Bei Detektionsobjektiven mit großer numerischer Apertur ist das Lichtblatt aus diesem Grund in der Regel dicker als das axiale Auflösungsvermögen der Objektive. Obwohl auch hier das Signal-Rausch-Verhältnis besser als bei normalen Weitfeld-Mikroskopen ist und das Lichtblatt weiterhin als schwacher konfokaler Filter fungiert, ist dessen Wirkung jedoch deutlich reduziert.
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In der
WO 97/31282 wird ein Verfahren für die konfokale Mikroskopie beschrieben, bei dem mittels einer speziellen Aperturmaske ein konventionelles Bild und ein aus einem konventionellen und einem konfokalen Bild zusammengesetztes Bild erzeugt wird. Das konfokale Bild erhält man, indem man das konventionelle Bild von dem kombinierten Bild pixelweise subtrahiert. Die Aperturmaske kann beispielsweise als räumlicher Lichtmodulator (SLM, Spatial Light Modulator) ausgestaltet sein, insbesondere als ferroelektrische Flüssigkristallvorrichtung. Die Aperturmaske ist mit einem definierten Muster codiert, so dass jedes Detektorpixel als abgestimmter Filter für ein entsprechendes Quellenpixel fungiert, wodurch Quellen- und Detektorverteilungen korreliert werden. Aufgrund dieser Codierung besteht die sonst übliche Delta-Korrelation zwischen Quellen- und Detektorverteilungen, die durch die Verwendung einzelner Punktquellen und Punktdetektoren erreicht wird, nicht mehr, so dass Aperturmasken verwendet werden können, die das vorhandene Licht besser ausnutzen.
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Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zu entwickeln, das die Wirkung des Lichtblattes als konfokaler Filter insbesondere bei Detektionsobjektiven mit einer hohen numerischen Apertur verbessert, so dass auch für solche Systeme das Hintergrundsignal reduziert, der Dynamikumfang erhöht und die axiale Auflösung des Gesamtsystems verbessert werden kann.
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Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass ein erster Satz von Bilddaten eines ersten Bildes bei einer ersten axialen Ausdehnung des Lichtblattes erzeugt wird, und ein zweiter Satz von Bilddaten eines zweiten Bildes bei einer zweiten axialen Ausdehnung des Lichtblattes erzeugt wird. Die axialen Ausdehnungen der beiden Lichtblätter, also ihre Dicken, sind dabei voneinander verschieden. Aus den beiden Sätzen von Bilddaten wird dann durch Verrechnung ein Ausgabesatz von Ausgabebilddaten eines Ausgabebildes erzeugt, in welchem das Hintergrundsignal gegenüber dem ersten und dem zweiten Bild reduziert ist. Dabei ist die erste axiale Ausdehnung des ersten Lichtblatts größer als die zweite axiale Ausdehnung des zweiten Lichtblatts, wobei diese Festlegung willkürlich ist und ebenso auch umgekehrt vorgenommen werden kann.
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Alternativ kann anstelle des ersten, dickeren Lichtblatts zur Erzeugung des ersten Bilddatensatzes auch ein Weitfeldbild aufgenommen werden, d.h. ohne dass ein eigentliches Lichtblatt verwendet wird, da ein wesentlich dickeres Volumen beleuchtet wird. Auch hier kann die Beleuchtung von der Seite erfolgen, so dass grundsätzlich die gleiche Beleuchtungsvorrichtung verwendet werden kann.
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Die Beleuchtung kann in diesem speziellen Fall, dass der erste Bilddatensatz mit Hilfe eines Weitfeldbildes erzeugt wird, auch im Durchlicht oder Auflicht erfolgen, wenn die Fluoreszenzsignale vom Beleuchtungslicht optisch getrennt werden, bzw. dafür gesorgt wird, dass im Wesentlichen nur die Fluoreszenzsignale registriert werden.
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Ein fiktives Lichtblatt für die Verrechnung hat in dem Fall einer Weitfeldaufnahme als erstem Bild eine erste axiale Ausdehnung, welche beispielsweise der Tiefe des durchstrahlten Volumens in z-Richtung, d.h. in Detektionsrichtung, entspricht, bei einer Beleuchtung von der Seite kann diese erste axiale Ausdehnung auch mit Hilfe entsprechender optischer Elemente wie Blenden variiert werden.
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Durch die Verrechnung lässt sich also aus zwei Sätzen von Bilddaten zu zwei axialen Ausdehnungen des Lichtblatts ein Ausgabebild erzeugen, welches nur rechnerisch erzeugt wird, jedoch zu einem Bild korrespondiert, welches mit einer effektiven Lichtblattdicke aufgenommen worden zu sein scheint, die dünner als die Dicken der beiden verwendeten Lichtblätter ist, welches also gegenüber den beiden verwendeten Lichtblättern als stärkerer konfokaler Filter erscheint. Aufgrund der Verrechnung werden gleichzeitig außerdem auch Aberrationen und Artefakte im Bild, beispielsweise aufgrund von Abschattungen, reduziert. Dabei ist es vorteilhaft, wenn sich die axialen Ausdehnungen der beiden Lichtblätter möglichst stark unterscheiden, dass also das eine Bild mit einem möglichst dicken Lichtblatt und das andere mit einem möglichst dünnen Lichtblatt aufgenommen wird, dies erhöht die Genauigkeit der Verrechnung.
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Das Ausgabebild entspricht also einem Bild mit einem stärkeren konfokalen Filter als im Falle der beiden Einzelbilder, was effektiv einem noch dünneren Lichtblatt entspricht. Auf diese Weise wird insbesondere das Hintergrundsignal von Fluoreszenzen außerhalb des fokussierten Bereichs reduziert, konstante Weitfeldanteile, die beispielsweise durch Abschattungen entstehen können und in dem Bild, welches mit dem dickeren Lichtblatt bzw. im Weitfeld aufgenommen wurde, auftauchen, jedoch nicht in dem anderen Bild, verschwinden. Darüber hinaus wird das Streulicht reduziert. Auch der Dynamikumfang, also die minimalen und maximalen Intensitätswerte, die noch unterscheidbar von anderen Werten registriert werden können, wird erhöht. Außerdem kann auch der Kontrast diese Weise verbessert werden. Schließlich können auf diese Weise Aberrationen, die sich in den einzelnen Bildern bemerkbar machen, herausgerechnet werden, so dass eine Entfaltung mit der Punktspreizfunktion unter Umständen ganz entfallen kann.
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In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung werden beide Bilddatensätze voneinander subtrahiert. Diese ist besonders einfach durchzuführen und kann bei entsprechender Programmierung bereits in der Kamera vorgenommen werden, welche die beiden Bilder aufgenommen hat. Alternativ können die beiden Bilder auch mit verschiedenen Kameras aufgenommen werden, deren Daten dann zur pixelweisen Verrechnung zusammengeführt werden, wobei diese Verrechnung auch parallel erfolgen kann.
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Das zweite Bild, welches mit der dünneren, zweiten axialen Ausdehnung des Lichtblatts aufgenommen wurde, beinhaltet die interessierenden Informationen bzw. Intensitäten aus der entsprechenden, dünnen Objektebene. Diese werden jedoch von dem Hintergrundsignal, d.h. insbesondere von Streulichtanteilen und Licht von außerhalb der Fokusebene überdeckt. Das erste Bild, welches im Weitfeld bzw. mit einer dickeren, ersten axialen Ausdehnung aufgenommen wurde, enthält solche störenden Lichtanteile in noch größerem Maß bzw. nahezu ausschließlich. Zieht man die störenden Anteile, d.h. das erste Bild, von dem Bild mit sowohl den störenden Anteilen als auch den interessierenden Informationen ab, so bleiben nur die interessierenden Informationen übrig, wobei ggf. zuvor eine Normierung bzw. Skalierung der Helligkeiten vorgenommen wird.
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Aufgrund der unterschiedlichen axialen Ausdehnung der beiden Lichtblätter kann der Fall eintreten, dass für stark unterschiedliche Dicken der Lichtblätter eine einfache Subtraktion nicht mehr ausreicht und das Hintergrundsignal über- oder unterkorrigiert wird, das Ausgangsbild also weiterhin Anteile enthält, die auf Abbildungsfehler, Streulicht etc. zurückzuführen sind, bzw. dass solche Anteile nur ungenügend reduziert sind. Das Hintergrundsignal und Artefakte werden in dem Bild, welches mit dem Lichtblatt mit einer größeren axialen Ausdehnung aufgenommen wurde, heller erscheinen als in dem Bild, welches mit einer demgegenüber geringeren axialen Ausdehnung des Lichtblattes erzeugt wurde. Vorteilhaft werden daher der erste und der zweite Bilddatensatz mit einem von einer mittleren axialen Ausdehnung des jeweiligen Lichtblattes abhängigen Helligkeitsfaktor skaliert. Damit lassen sich schon befriedigende Ergebnisse erzielen, noch bessere Ergebnisse lassen sich erzielen, wenn der erste und der zweite Bilddatensatz vorzugsweise mit der lokalen axialen Ausdehnung des jeweiligen Lichtblattes am jeweiligen – bezüglich der optischen Achse des Detektionsobjektivs – lateralen Probenort skaliert werden, dies kann pixelweise erfolgen, aber auch abgestuft in Bereichen, die mehrere Pixel auf dem Detektor bzw. im entsprechenden Quellgebiet der Probe umfassen. Da die Lichtblattdicke im Bereich der optischen Achse des Detektionsobjektivs in der Regel am geringsten ist und zu den Randbereichen hin ansteigt, liefert die Berechnung unter Berücksichtigung einer entsprechenden Matrix mit Helligkeitsfaktoren die besten Ergebnisse, da jeder – in Bezug auf die optische Achse des Detektionsobjektivs als Ebenennormale – laterale Probenort auf diese Weise individuell berücksichtigt werden kann.
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Anstelle von zwei Bilddatensätzen können selbstverständlich auch mehr als zwei Bilddatensätze miteinander verrechnet werden. Beispielsweise können N Bilddatensätze aufgenommen werden, wobei dann z.B. von dem Bilddatensatz, der mit dem dicksten Lichtblatt aufgenommen wurde, alle übrigen Bilddatensätze abgezogen werden, nachdem sie mit einem Faktor 1/(N-1) gewichtet wurden, so dass jedes der zu subtrahierenden Bildern nur zu einem Bruchteil der insgesamt zu subtrahierenden Bilder berücksichtigt wird. Dieser Faktor kann in die Matrix mit den Helligkeitsfaktoren inkorporiert werden.
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Die axiale Auflösung des Lichtblattes kann für alle Bilddatensätze vor der Aufnahme von Hand eingestellt werden, aber auch eine automatische Auswahl der axialen Ausdehnung des Lichtblattes am Anfang und / oder zwischen zwei Aufnahmen ist möglich. Letztere Variante ist insbesondere dann zu bevorzugen, wenn eine Vielzahl von Ausgangsbildern erzeugt werden soll, beispielsweise zur Herstellung eines räumlichen Bildes, da mittels der Automatisierung die Einstellung und die Erzeugung des Ausgabebilddatensatzes beschleunigt werden kann.
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Die axiale Ausdehnung des Lichtblattes wird in einem Beleuchtungsstrahlengang bevorzugt mit Hilfe einer Zoomoptik, eines räumlichen Lichtmodulators oder mit Hilfe adaptiver optischer Elemente eingestellt.
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Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
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1 eine Anordnung zur Untersuchung einer mit einem Lichtblatt beleuchteten Probe,
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2 eine Beleuchtungsgeometrie im Probenbereich für ein Detektionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur und
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3 die effektive Beleuchtungsgeometrie im Probenbereich bei einem verrechneten Ausgangsbild.
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In 1 ist ein Aufbau skizziert, mit dem ein optischer Schnitt durch eine Probe 1 auf Basis der LSFM-Technik erzeugt werden kann. Licht einer Beleuchtungsquelle 2 wird über eine Beleuchtungsoptik 3 in Richtung der Probe gelenkt. Die Beleuchtungsoptik 3 formt dabei aus dem Beleuchtungslicht ein Lichtblatt 4, welches hier durch seine Einhüllende dargestellt ist. Das Lichtblatt 4 ist in der Regel nicht vollständig eben, sondern seine axiale Ausdehnung ist im Bereich der optischen Achse eines Detektionsobjektivs 5 geringer als im Randbereich des von diesem Detektionsobjektiv 5 erfassten Gesichtsfelds. Die Variation in der Dicke ist zur Verdeutlichung in den Figuren übertrieben dargestellt. Typische Lichtblattdicken liegen im Bereich von 0,2 µm bis zu 20 µm. Mit dem Lichtblatt 4 wird ein Probenbereich 6 in einer Lichtblattebene 7 beleuchtet. Die Lichtblattebene 7 bildet die Mittenebene des Lichtblattes 4 und korrespondiert idealerweise zur Fokusebene des Detektionsobjektivs 5.
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In die Beleuchtungsoptik 3 sind außerdem Einstellmittel 8 zur Variation der axialen Ausdehnung des Lichtblattes angeordnet. Diese Einstellmittel 8 können beispielsweise als Zoomoptik ausgestaltet sein, die Dicke des Lichtblattes kann aber auch mit Hilfe eines räumlichen Lichtmodulators (SLM, Spatial Light Modulator) variiert werden. Im einfachsten Fall handelt es sich bei dem Lichtmodulator um eine ansteuerbare Blende, auch die Verwendung eines phasenmodulierenden Elements oder eines anderen Elements zur Formung von Gauss- oder Besselstrahlen, bei denen die Halbwertsbreite des im Querschnitt einer Gauss- oder Besselverteilung folgenden Intensitätsprofils variiert wird, sind denkbare Alternativen. Auch adaptive optische Elemente kommen als Einstellmittel 8 für die Lichtblattdicke in Frage.
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Der Probenbereich 6 wird in der Lichtblattebene 7 mit Licht in Form eines Lichtblattes 4 beleuchtet. Von diesem Probenbereich 6 abgestrahltes Licht wird entlang einer axialen Detektionsrichtung, die allgemein mit der Lichtblattebene 7 einen von Null verschiedenen Winkel, welcher bei der in 1 gezeigten Anordnung 90° beträgt, einschließt, über ein Detektionsobjektiv 5, dessen optische Achse mit der Detektionsrichtung 9 zusammenfällt, in den Strahlengang eines Weitfeld-Mikroskops eingekoppelt. Dort wird es auf einen flächenförmigen Detektor 10 geleitet. Im Detektor 10 wird pixelweise die Intensität registriert und in Sätze von Bilddaten von Bildern umgewandelt.
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Für ein hohes Auflösungsvermögen in der Fokusebene ist die Verwendung von Detektionsobjektiven mit einer hohen numerischen Apertur von 0,8 und mehr vorteilhaft. Das axiale Auflösungsvermögen ist bei solchen Objektiven jedoch geringer als bei Objektiven mit kleiner numerischer Apertur und liegt etwa in der Größenordnung der Lichtblattdicke. Die Lichtblattdicke, die axiale Ausdehnung des Lichtblatts 4, beträgt beispielsweise 2 µm und das axiale Auflösungsvermögen des Detektionsobjektivs 5 liegt zwischen 0,5 µm und 3 µm. Ein Lichtblatt mit einer geringeren axialen Ausdehnung als 2 µm ist zwar verwendbar, schränkt jedoch das nutzbare Gesichtsfeld zu sehr ein.
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2 zeigt eine typische Beleuchtungsgeometrie, bei der das Lichtblatt 4 an seiner dünnsten Stelle etwa eine Dicke von 2 µm aufweist. Das Detektionsvolumen, welches vom Detektionsobjektiv 5 grundsätzlich erfasst werden kann, wird von den punktgestrichelten Linien eingefasst. Das tatsächliche Detektionsvolumen wird durch die Schnittmenge von Lichtblatt 4 und Detektionsvolumen 11 gebildet. Die Kurven auf der rechten Seite von 2 zeigen zum einen die Lichtblattdicke (durchgezogene Linie) und zum anderen das axiale Auflösungsvermögen des Detektionsobjektivs 5 (punktgestrichelte Linie). Dies bedeutet, dass bei der Aufnahme eines einzelnen optischen Schnitts bei dieser Einstellung das Hintergrundsignal eher hoch ist, so dass der detektierbare Intensitätsumfang und die axiale Auflösung des Systems eher gering sind.
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Um das Hintergrundsignal zu reduzieren geht man nun wie folgt vor: Zunächst wird ein erster Satz von Bilddaten eines ersten Bildes bei einer ersten axialen Ausdehnung des Lichtblattes 4 erzeugt, beispielsweise mit der in 2 gezeigten Konfiguration. Auch ein Weitfeldbild kann erzeugt werden, bei dem eine fiktive Lichtblattdicke beispielsweise der Tiefe des insgesamt durchstrahlten Detektionsvolumens entspricht. Anschließend wird ein zweiter Satz von Bilddaten eines zweiten Bildes bei einer zweiten, von der ersten verschiedenen axialen Ausdehnung des Lichtblattes 4 erzeugt. Diese zweite axiale Ausdehnung ist größer als die erste axiale Ausdehnung, man kann aber auch umgekehrt vorgehen. Aus den beiden Sätzen von Bilddaten wird durch Verrechnung – beispielsweise durch pixelweise Subtraktion beider Bilddatensätze – ein Ausgabesatz von Ausgabebilddaten eines Ausgabebildes erzeugt, in welchem das Hintergrundsignal als Folge der Verrechnung gegenüber dem ersten und dem zweiten Bild reduziert ist. Das Ausgabebild ähnelt somit einem Bild, welches mit einer effektiv geringeren axialen Ausdehnung des Lichtblatts aufgenommen scheint, als im Falle des ersten und des zweiten Bildes, der konfokale Filter ist stärker.
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Eine solche effektive Beleuchtungsgeometrie ist 3 dargestellt ist. Hier ist die axiale Ausdehnung des fiktiven Lichtblattes 4, welches man für die Erzeugung des Ausgangsbildes benötigen würde, deutlich geringer als das axiale Auflösungsvermögen des Detektionsobjektivs 5, entsprechend wird nur ein kleiner Teil des axialen Detektionsvolumens 11 beleuchtet, wie auf der rechten Seite von 3 dargestellt. Das fiktive Lichtblatt 4 wirkt somit wie ein stärkerer konfokaler Filter, durch den das Hintergrundsignal reduziert wird. Auch der Umfang der Dynamik kann auf diese Weise erhöht werden.
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Die Verrechnung der Bilder kann beispielsweise in einer Auswerteeinheit 12, die an den Detektor 10 wie in 1 gezeigt angeschlossen ist, erfolgen. Dabei können die Bilddatensätze in der Auswerteeinheit 12 zunächst zwischengespeichert und verarbeitet werden, bevor nur das Ausgangsbild selbst an eine Ausgabeeinheit 13 weitergeleitet wird, wo es gespeichert, dargestellt und / oder weiterverarbeitet werden kann.
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Im einfachsten Fall werden nur zwei Bilddatensätze erzeugt, es können jedoch auch mehrere Bilder bei verschiedenen axialen Ausdehnungen des Lichtblattes 4 aufgenommen werden, die dann entsprechend gewichtet miteinander verrechnet werden. Die Verrechnung selbst in der Auswerteeinheit 12 nimmt nur wenig Zeit in Anspruch, sie kann beispielsweise erfolgen, während ein anderer Probenbereich 6 angefahren wird, an dem die gleiche Prozedur bei einem weiteren optischen Schnitt vorgenommen wird. Je nach Aufbau können auch mehrere Detektoren mit der Auswerteeinheit 12 verbunden sein, so dass beispielsweise der erste Bilddatensatz von einem ersten Detektor und der zweite Bilddatensatz von einem zweiten Detektor zur Auswerteeinheit 12 übertragen wird. Auch die Verwendung von zwei verschiedenen Beleuchtungsoptiken mit jeweils statischen Lichtblättern fester Dicke ist möglich, diese können beispielsweise einander gegenüber auf einer gemeinsamen Achse angeordnet sein. Auf Einstellmittel 8 zur Variation der axialen Ausdehnung des Lichtblattes, die bevorzugt automatisch erfolgt, kann in diesem Fall verzichtet werden.
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Aufgrund der unterschiedlichen Lichtblattdicken können die aufgenommenen Bilder unterschiedliche Helligkeiten aufweisen, dies kann korrigiert werden, indem beispielsweise eine Skalierung mit einem von der mittleren axialen Ausdehnung des jeweiligen Lichtblattes abhängigen Helligkeitsfaktor vorgenommen wird. Noch bessere Ergebnisse erhält man, wenn die Bilddatensätze pixelweise jeweils mit der lokalen axialen Ausdehnung des jeweiligen Lichtblattes am entsprechenden lateralen Probenort, also in der Lichtblattebene 7, als Helligkeitsfaktor skaliert werden.
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Mit Hilfe des vorangehenden Verfahrens lässt sich das Hintergrundsignal bei der Lichtblattmikroskopie verringern, was zu einer höheren Dynamik und einer höheren axialen Auflösung insbesondere bei der Verwendung von Detektionsobjektiven mit hoher numerischer Apertur führt.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Probe
- 2
- Beleuchtungsquelle
- 3
- Beleuchtungsoptik
- 4
- Lichtblatt
- 5
- Detektionsobjektiv
- 6
- Probenbereich
- 7
- Lichtblattebene
- 8
- Einstellmittel
- 9
- Detektionsrichtung
- 10
- Detektor
- 11
- Detektionsvolumen
- 12
- Auswerteeinheit
- 13
- Ausgabeeinheit
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 10257423 A1 [0002]
- WO 2004/0535558 A1 [0002]
- WO 97/31282 [0009]
