DE112014002748T5

DE112014002748T5 - Spektral kodiertes Hoch-Extinktions-Polarisationsmikroskop

Info

Publication number: DE112014002748T5
Application number: DE112014002748.0T
Authority: DE
Inventors: Martin Poenie; Thomas Milner; Biwei YIN
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2016-03-03
Also published as: WO2014200928A1; US20160154229A1; JP2016521866A

Abstract

Beschrieben wird ein Polarisationsmikroskop, das eine Spektralcodierung des Polarisationszustands zum Abbilden von Zellen einsetzt. Das spektral kodierte Polarisationsmikroskop ist sowohl ausreichend schnell zum Abbilden von Zellen als auch mit Hochextinktions-Optik kompatibel, die erforderlich ist, um Molekülstrukturen und -verbände abzubilden. Das spektral kodierte Mikroskop ermöglicht es, mit dem Polarisationszustand des Lichts, das auf die Probe trifft, diskrete Zustände über die Gesamtheit der Poincaré-Kugel abzufragen, während gleichzeitig eine Null-Messung der beobachteten zellulären Doppelbrechung gegeben wird. Ein Abtasten über die gesamte Poincaré-Kugel erlaubt es dem Mikroskop, eine Phasenverzögerung durch die Probe aufgrund von sowohl linearer als auch zirkularer Doppelbrechung zu bestimmen. Das spektral kodierte Polarisationsmikroskop kann in einem leichten off-Null-Zustand betrieben werden, was das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert.

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein Polarisationsmikroskopie.
2. Beschreibung des relevanten Standes der Technik
Zellstrukturen wie beispielsweise Polymere, Membranen oder Vesikel sind doppelbrechend. Doppelbrechung lässt sich basierend darauf, wie diese Strukturen mit polarisiertem Licht in Wechselwirkung treten, feststellen und abbilden. Zur vollständigen Charakterisierung dieser Wechselwirkungen muss das polarisierte Licht jedoch moduliert werden, um zu ermöglichen, dass unterschiedliche Polarisationszustände auf die Probe treffen.
Modulations-Polarisationsmikroskopie (MPM) hat ihre Fähigkeit bewiesen, Zytoskelett-Elemente und andere Strukturen in lebenden Zellen abzubilden. Um diese Strukturen zu visualisieren, müssen Bilder erfasst werden, während der Polarisationszustand des auftreffenden Lichts im Zeitablauf moduliert oder variiert wird. Der Zustand des polarisierten Lichts, das mit der Probe interagiert, wird verändert. Ein Bilddetail wird als kleine Änderungen der Intensität kodiert, während der Polarisationszustand moduliert wird. Das Erfassen von Änderungen der Bildintensität, während der Polarisationszustand moduliert wird, ermöglicht es, spezifische Doppelbrechungssignale der Probe aus dem detektierten Signal zu bestimmen. Laterale Bewegungen der Zellobjekte über die Zeitspanne der Polarisationsmodulation vermindern allerdings den Wert der aufgezeichneten Daten. Solche Bewegungsartefakte werden am ehesten mit winzigen Strukturen beobachtet, die sich im Verlauf der Polarisationsmodulation um einen oder mehrere Bildpunkte bewegen können. Die Modulationsgeschwindigkeit und die Fähigkeit der Kamera, Bilder mit hoher Auflösung (sowohl in räumlicher Auflösung als auch in Bit-Tiefe) mit Geschwindigkeiten aufzuzeichnen, die schnell genug sind, um Bewegungsartefakte abzuschwächen, stellen daher einen wichtigen Faktor dar, der die Leistung der MPM begrenzt.
Verfahren zum Modulieren des Polarisationszustands waren daher bislang mit Vorrichtungen wie einer mechanischen Drehung von Polarisatoren oder Retarderplatten (z. B. ½ Welle), Flüssigkristall-Retardern (Verzögerungsmittel) oder Faraday-Rotatoren verbunden. Die mechanische Rotation von Polarisatoren oder ½-Wellenplatten wird durch die mechanische Trägheit des Elements begrenzt, ist ein langsamer Prozess und führt häufig zu Vibrationen und Bildunschärfe. Darüber hinaus kann eine mechanische Rotation eines einzigen Elements (z. B. eines Polarisators oder einer ½-Wellenplatte) keine ausreichende Abtastrate für die Poincaré-Kugel bieten; auch mag ein Bestimmen von sowohl linearer als auch zirkularer Doppelbrechung nicht möglich sein. Flüssigkristall-Retarder können ein vollständiges Abtasten der Poincaré-Kugel bieten, sie sind jedoch langsam und liefern eine schlechte Polarisationsreinheit (Kontrastverhältnisse). Eine schlechte Polarisationsreinheit vermindert die Intensitätsänderungen durch Zell-Doppelbrechung. Die niedrige Geschwindigkeit von Flüssigkristall-Retardern verhindert das Beobachten vieler Zellvorgänge in Echtzeit, während die schlechte Polarisationsreinheit die Arten von Zellstrukturen einschränkt, die beobachtet werden können. Faraday-Rotatoren sind schnell und mit einer hohen Polarisationsreinheit kompatibel. Faraday-Rotatoren führen jedoch technische Herausforderungen ein und bieten kein vollständiges Abtasten der Poincaré-Kugel; sie sind daher nicht in der Lage, lineare und zirkulare Doppelbrechung zu trennen.
Keine dieser Vorrichtungen ist in der Lage, die nötige Modulation des Polarisationszustands von Licht mit einer Geschwindigkeit bereit zu stellen, die ausreichend hoch ist, um sich bewegende lebende Proben zu visualisieren.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer Ausführungsform enthält ein Polarisationsmikroskop eine Lichtquelle mit variabler Wellenlänge, einen ersten Polarisator, der Licht in einem reinen Polarisationszustand (linear, zirkular, elliptisch, radial oder azimutal) weiterleitet und optisch mit der Lichtquelle mit variabler Wellenlänge gekoppelt ist. Der erste Polarisator ist optisch mit einem ersten Retarder (Verzögerungsmittel, linear, zirkular oder elliptisch) gekoppelt. Ein Objekttisch ist optisch mit dem ersten Retarder gekoppelt, wobei der Objekttisch eine Probe im Strahlengang des vom ersten Retarder empfangenen Lichts hält. Ein zweiter Retarder, der in Bezug auf den ersten Retarder ein entgegengesetztes Vorzeichen hat, ist optisch mit dem Objekttisch gekoppelt, um Licht zu empfangen, das durch den Objekttisch hindruch tritt. Ein zweiter Polarisator ist optisch mit dem zweiten Retarder gekoppelt und der zweite Polarisator ist senkrecht zum ersten Polarisator angeordnet. Ein optisches Erfassungssystem ist optisch mit dem zweiten Polarisator gekoppelt.
Die Lichtquelle mit variabler Wellenlänge ist in einer Ausführungsform dazu in der Lage, Licht erzeugen, das eine Wellenlänge von zwischen etwa 350 nm bis etwa 800 nm hat.
In einer Ausführungsform ist der erste Polarisator und/oder der zweite Polarisator ein Polarisationsprisma.
In einer Ausführungsform sind der erste und der zweite Retarder Kristall-Polarisationsrotatoren. Die Kristall-Polarisationsrotatoren können aus Tellurdioxid zusammengesetzt sein. In einer Ausführungsform weist das Polarisationsmikroskop einen ersten Kristall-Polarisationsrotator und einen zweiten Kristall-Polarisationsrotator auf, wobei der erste Kristall-Polarisationsrotator und der zweite Kristall-Polarisationsrotator aufeinander abgestimmte Kristall-Rotatoren sind. Der Grad der Rotation des ersten Polarisationsrotators und des zweiten Polarisationsrotators können teilweise auf der Wellenlänge des einfallenden Lichts basieren.
In einer Ausführungsform ist die optische Erfassungsvorrichtung eine ladungsgekoppelte Vorrichtung oder ein Scientific CMOS-Imager mit ausreichender Empfindlichkeit, Auflösung und Bilderfassungsgeschwindigkeit.
In Gebrauch tritt Licht vom ersten Polarisationsrotator durch die Probe, die auf dem Objekttisch gehalten wird. Alternativ wird Licht vom ersten Kristall-Polarisationsrotator von der Probe reflektiert, die auf dem Objekttisch gehalten wird.
In einer Ausführungsform sind die Retarder ein Paar aufeinander abgestimmter Rotatoren (zirkulare Retarder), die eine Phasenverzögerung zwischen links- und rechts-zirkular polarisiertem Licht bewirken. In einer Ausführungsform sind die Retarder (Verzögerungsmittel) aufeinander abgestimmte elliptische Retarder, die durch einen Rotator (zirkularer Retarder) und eine Wellenplatte (linearer Retarder) gebildet werden, die optisch miteinander gekoppelt sind. In einer anderen Ausführungsform sind die Retarder elliptische Retarder, die durch zwei Wellenplatten gebildet werden, die in Bezug aufeinander orientiert sind.
In einer Ausführungsform zählt zu einem Verfahren zur Visualisierung einer Probe mit einem Polarisationsmikroskop: die Probe auf einem Objekttisch eines Polarisationsmikroskops wie vorangehend beschrieben platzieren und Bilder der Probe bei einer oder mehreren Wellenlängen erhalten. Bilder der Probe erhalten kann erfolgen, indem periodisch die Wellenlänge des auf die Probe auftreffenden Lichtes geändert wird und Bilder der Probe nach jeder Änderung der Wellenlänge des Lichts erfasst werden. Jede Änderung der Wellenlänge kann in einem Abstand zwischen 1 Nanosekunde und 500 Mikrosekunden vollzogen werden, wogegen die Erfassung eines einzelnen Bildes in nur 10 Millisekunden durchgeführt werden kann. Die Bilderfassung der biologischen Probe kann fortlaufend oder in Abständen erfolgen, solange ein Satz an Bildern, der zum Berechnen des Polarisationszustands erforderlich ist, in der Zeit erhalten wird. In einer Ausführungsform wird ein Satz an Bildern (beispielsweise 2 bis 25 Bilder) erzeugt, indem aufeinanderfolgende Bilder erfasst werden (z. B. im Abstand von 10–20 Millisekunden).
In einer Ausführungsform weist das Verfahren weiterhin auf, den Polarisationszustand des Lichts auf der Poincaré-Kugel modulieren, um sowohl azimutale (um die Pole) als auch longitudinale (um eine äquatoriale Achse) Bewegung auf der Poincaré-Kugel zu erzeugen, indem die Wellenlänge des von der Lichtquelle mit variabler Wellenlänge erzeugten Lichts geändert wird.
In einer Ausführungsform weist das Verfahren weiterhin auf, die Orientierungsachse des ersten Polarisators in Bezug auf den zweiten Polarisator so anzupassen, dass der erste Polarisator und der zweite Polarisator nicht vollständig orthogonal sind, und Bilder von der Probe erfassen, während der ersten Polarisator und der zweiten Polarisator nicht vollständig orthogonal sind. Zum Verfahren kann es auch zählen, das Polarisationsmikroskop durch Bestimmen des Polarisationszustands des Lichtes zu kalibrieren, wenn der zweite Polarisationslicht-Rotator und die zweite Wellenplatte aus dem Strahlengang entfernt sind. Bestimmen des Polarisationszustands des Lichts kann in einer Ausführungsform durch Verfahren erfolgen, die im Gebiet der Analyse der Lichtpolarisation bekannt sind, wie ein Drehen des zweiten Polarisators um diskrete (diskontinuierliche) Winkel und Analysieren der Daten, die von der optischen Erfassungsvorrichtung gesammelt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen ersichtlich werden, in denen:
1 ein schematisches Diagramm eines Polarisationsmikroskops zeigt;
2 ein schematisches Diagramm einer Poincaré-Kugel zeigt und
3 ein schematisches Diagramm einer alternativen Ausführungsform eines Polarisationsmikroskops zeigt.
Es sind verschiedene Modifikationen und alternative Formen der Erfindung möglich und spezifische Ausführungsformen werden beispielhaft in den Zeichnungen gezeigt und werden hier im Detail beschrieben. Es sollte sich jedoch verstanden werden, dass nicht beabsichtigt ist, dass die Zeichnungen und die ausführliche Beschreibung die Erfindung auf die jeweilige offenbarte Form beschränken; es ist vielmehr im Gegenteil beabsichtigt, dass alle Modifikationen, Äquivalente und Alternativen abgedeckt sind, die unter den Geist und den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen und in den sich anschließenden Ansprüchen definiert sind.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Es soll verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf bestimmte Vorrichtungen oder Verfahren beschränkt ist, die selbstverständlich variieren können. Es soll auch verstanden werden, dass die hier verwendete Terminologie lediglich dem Zweck dient, bestimmte Ausführungsformen zu beschreiben und nicht als einzuschränkend vorgesehen ist. Die in dieser Beschreibung und den sich anschließenden Ansprüchen verwendete Singularformen „ein”, „eine” und „das” beinhalten den Singular und den Plural, sofern der Inhalt nicht eindeutig etwas anderes bestimmt. Darüber hinaus wird das Wort „kann” in dieser Anmeldung in einem ermöglichenden Sinne verwendet (d. h. ein Potenzial besitzend, zu etwas in der Lage) und nicht in einem verbindlichen Sinn (d. h. muss). Der Begriff „enthalten” und Ableitungen davon bedeutet „einschließlich, aber nicht darauf beschränkt”. Der Begriff „gekoppelt” bedeutet direkt oder indirekt verbunden.
Der Begriff „Retarder” bzw. „Verzögerungsmittel” bezieht sich hier auf ein optisches Element (aus einer oder mehreren optischen Komponenten zusammengesetzt); es ist ein optisches Element, das eine optische Phasenverzögerung (Δϕ) zwischen einem Paar orthogonaler Zustände bereitstellt. Die orthogonalen Zustände können lineare Zustände sein, die um neunzig Grad gedreht sind, links- und rechtszirkulare Polarisationszustände oder orthogonal-elliptische Zustände. Ein Retarder wird durch einen der beiden Polarisationszustände (manchmal Eigenzustände genannt), die sich ohne Phasenverzögerung durch das Retarder-Element ausbreiten, und durch die Phasenverzögerung (Δϕ) zwischen den beiden Eigenzuständen bestimmt. Beispielsweise ist eine Wellenplatte ein linearer Retarder und durch zwei lineare orthogonale Zustände bestimmt, die eine Phasenverzögerung erfahren, wenn sie sich durch den Retarder ausbreiten. Das Retarder-Paar ist im Mikroskop so konfiguriert, dass Licht keine Veränderung im Polarisationszustand erfahren würde, wenn diese beiden Elemente der Reihe nach angeordnet wären. Ein elliptischer Retarder kann beispielsweise durch eine sequentielle Kombination eines Rotators (zirkularer Retarder) und einer Wellenplatte (linearer Retarder) gebildet werden. Andere Kombinationen sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise kann ein elliptischer Retarder aus zwei Wellenplatten gebildet werden, die in Bezug aufeinander um 45 Grad gedreht sind.
Der hier verwendete Begriff „Polarisator” bezieht sich auf optische Elemente, die Licht in einem reinen Polarisationszustand (linear, zirkular oder elliptisch) mit hoher Abschwächung (Extinktion) für jede Lichtwellenlänge übertragen, die von der Lichtquelle emittiert wird. Eine Ausführungsform eines Polarisators ist ein linearer Retarder, der einen rein linearen Polarisationszustand überträgt.
Es wird hier ein neuer Ansatz beschrieben, um schnell den Polarisationszustand von Licht auf der Poincaré-Kugel zu modulieren, um sowohl azimutale (um die Pole) als auch longitudinale (um eine äquatoriale Achse) Bewegung auf der Poincarié-Kugel zu erzeugen. Hochgeschwindigkeitsmodulation des Polarisationszustands wird mit einem Imager mit einer relativ hohen Geschwindigkeit (100 Hz oder schnellere Bildfrequenz) kombiniert, der Bilder erfassen kann, die diskreten Polarisationszuständen des Lichts entsprechen, das mit der Probe interagiert. In dem Maße, in dem die Bewegung von Probenbestandteilen während der Dauer der Modulation eingefroren werden können, wird für einzelne Objekte ein viel besseres Doppelbrechungs-Signal-Rausch-Verhältnis erhalten. Der Aufbau des Mikroskops ist einfach und setzt Bestandteile ein, die hohe Polarisationskontrastverhältnisse beibehalten. Darüber hinaus ermöglicht der Aufbau, wie noch erläutert wird, das Gewinnen von Null- oder nahe-Null-Messungen von Polarisationszuständen. Der Aufbau des Mikroskops lässt sich leicht von anderen Laboratorien umsetzen, wodurch er für eine Vielzahl von Untersuchungen nützlich wird.
Die Mikroskopie ist in mehrerer Hinsicht vorangetrieben worden, um die Auflösung in Raum und Zeit zu verbessern. Eine bessere Z-Achsen-Auflösung wurde mittels konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie erreicht, während mit einer Vielzahl von Ansätzen nun die Beugungsgrenze durchbrochen wurde, um eine Superauflösung zu erhalten. Diese Techniken basieren allerdings weitgehend auf Fluoreszenz, was die Markierung spezifischen Proteine oder Strukturen erfordern kann. So leistungsfähig und wichtig die Fluoreszenzmikroskopie ist, Fluoreszenzsonden unterliegen dem Bleichen, wodurch der Beobachtungszeit Grenzen gesetzt sind.
Polarisationslichtmikroskopie stellt eine andere Art der Bildgebung bereit, mit einem Kontrast, der auf Molekülstruktur und -orientierung beruht. Polarisationsmikroskopie wurde seit langem zum Abbilden der Mikrotubuli der Spindel verwendet, basierend auf ihrer Doppelbrechung. Es gibt aber viele Zellstrukturen, die sich mit hohem Kontrast unter polarisiertem Licht detektieren lassen, inklusive diverser Filamentsysteme (Aktin, Mikrotubuli, Intermediärfilamente und Kollagen), Membrangrenzen, inklusive derer der Plasmamembran, von Zellvesikeln und verschiedenen Organelle und Zellstrukturen, die eine kristallartige Organisation zeigen. Membrangrenzen zeigen eine Kanten-Doppelbrechung, die mit einer höheren Genauigkeit bestimmt werden kann als an Hand traditioneller Auflösungsgrenzen vorhersagbar war. Tatsächlich deuten vorläufige Daten darauf hin, dass die Polarisationsmikroskopie für das Abbilden von Viruspartikeln in Zellen eingesetzt werden kann. Außerdem bieten Nanopartikel einen einzigartigen Ansatz, um Proteine zu markieren und Protein-Interaktionen mittels polarisierten Lichts zu beobachten. Schließlich können Zellen, anders als mit Fluoreszenz, über lange Zeiträume hinweg abgebildet werden.
Um das ganze Potential der Polarisationsmikroskopie verwirklichen zu können und zirkular oder linear doppelbrechende Strukturen sichtbar zu machen, kann man nicht einfach die Zelle mittels gekreuzter Polarisatoren abbilden. Die kleinen Verzögerungen biologischer Strukturen werden meist von Streulicht maskiert.
Kontrast entsteht in Bildern, die mit polarisiertem Licht erhalten werden, durch Änderungen der Phase und der Amplitude aufgrund unterschiedlicher Verzögerung oder Dämpfung von orthogonal polarisierten Strahlen auf ihrem Weg durch die Probe. Form-Doppelbrechung tritt in Zellen und Geweben verschiedener Polymere auf, inklusive Kollagen und dem Zytoskelett der Zelle. Das elektrische Feld des einfallenden Lichts, das senkrecht zu den Fasern oszilliert (E_⊥), induziert Oberflächenladungen, die innerhalb der Faser ein induziertes Feld (E_o) erzeugen. Das induzierte Feld (E_o) modifiziert Vorwärtsstreulicht anisotrop, so dass Phase und Amplitude von E_⊥ relativ zur Komponente des elektrischen Feldes verändert werden, die parallel zu den Fasern (E_∥) polarisiert ist. Die inkrementale Phasenverzögerung (δ_i), die durch die Vertikalkomponente (E_⊥) anfällt, bewirkt eine langsamere Lichttransmission und einen größeren Brechungskoeffizienten (n_s) als es das Licht erfährt, das parallel zur Faserachse (E_∥) mit einem Brechungsindex n_f polarisiert ist. Der numerische Unterschied zwischen den Brechungskoeffizienten der Lichtschwingungen, die entlang schneller und langsamer Achsen polarisiert sind, ist die Form-Doppelbrechung (Δn = n_s – n_f). Inkrementelle Phasenverzögerungen (δ_i) akkumulieren sich durch Faserstrukturen und die zusammengesetzte Phasenverzögerung (δ) zwischen Komponenten, die parallel (E_∥) und senkrecht (E_⊥) zu den Fasern polarisiert sind, nachdem sie sich über einen Abstand Z ausgebreitet haben, ist
wobei δ in Grad angegeben wird. Neben der Phasenverzögerung zwischen E_∥ und E_⊥ kann Vorwärtsstreulicht eine Streuungs-Anisotropie haben, was eine unterschiedliche Extinktion (auch optische Dichte, engl. attenuance) von Lichtamplituden zur Folge hat. Diese Größe ist durch die Form-Biextinktion (engl. form-biattenuance) (Δχ) gegeben. In ähnlicher Weise ist die zusammengesetzte relative Dämpfung (ε) zwischen den Komponenten, die nach dem Ausbreiten über eine Strecke Z parallel (E_∥) und senkrecht (E_⊥) zu den Fasern polarisiert sind,
wobei ε in Grad angegeben wird. Die Wirkung von Form-Doppelbrechung (Δn) und Form-Biextinktion (Δχ) zwischen parallelen (E_∥) und senkrechten (E_⊥) Feldkomponenten kann jeweils für reale (∆n) und imaginäre (∆χ) Teile der zusammengesetzten Differenz-Wellenzahl (β) berücksichtigt werden:
Die relative Amplitude und die Phase zwischen senkrechten (E_⊥) und parallelen (E_∥) Feldkomponenten kann mathematisch durch die zusammengesetzte relative Amplitude (E_⊥/E_∥) ausgedrückt werden. Nachdem Vorwärtsstreulicht sich über eine Strecke (Z) ausgebreitet hat, ist die zusammengesetzte relative Amplitude gegeben durch E_⊥(z)/E_∥(z) = exp(–β_im·Z)·exp(iβ_re·Z)
β_re ist hier proportional zur Form-Doppelbrechung (Δn) und β_im ist proportional zur Form-Biextinktion (Δχ). Genaue quantitative Messungen von Δχ in Zellen wurden nicht berichtet.
Eine andere Art von Doppelbrechung, die in Zellen beobachtet wird, ist als Kantendoppelbrechung bekannt; sie lässt sich an der Grenzfläche zwischen dielektrischen Schnittstellen wie zwischen Wasser und Zellmembranen beobachten. Kantendoppelbrechung ist ein nicht vollständig verstandenes Phänomen, von dem angenommen wird, dass es auf Störungen an Grenzen beruht, wo sich Licht aus drei verschiedenen Wegen mischt. Es wurde festgestellt, dass Kantendoppelbrechung mit höherer Genauigkeit als andere Formen der Mikroskopie eine Bestimmung von Grenzen ermöglicht. Dieses Merkmal der Kantendoppelbrechung steht im Einklang mit unseren eigenen Beobachtungen und ist in experimentellen Untersuchungen von beachtlichem Wert. Bestimmte kristalline Strukturen wie Knochen und Glykogengranula sind intrinsisch doppelbrechend. Aus Gründen, die derzeit nicht klar sind, sind große T-Zellsezernierende Vesikel stark doppelbrechend und können als Beispiel für intrinsische Doppelbrechung dienen. Eine andere Form der Doppelbrechungsänderung wird während neuronaler Aktionspotentiale beobachtet. Es scheint mehrere zelluläre Quellen dieser Doppelbrechung zu geben und sie sind nicht gut charakterisiert. Zumindest ein Teil der Signaländerung scheint auf Reaktionen von Membranproteinen und/oder Lipiden auf die Potentialänderung zurückzugehen. Basierend auf der Kinetik der Doppelbrechungsänderung wurde eine zweite Komponente der Calcium-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum zugeschrieben. Schließlich haben frühere Formen der zirkularen Doppelbrechung zum Beobachten dieser Art von Strukturen keinen Kontrast geliefert, obwohl angenommen wird, dass zirkulare Doppelbrechung an diversen Zellbestandteilen (z. B. Glucose) auftritt.
Zwar gibt es in Zellen viele Quellen für Doppelbrechung, diese Signale sind allerdings typischerweise recht klein und werden durch Hintergrundlicht und Abbildungsfehler überdeckt. Darüber hinaus hängt die Helligkeit von doppelbrechenden Objekten von der Ausrichtung der Probe in Bezug auf den Polarisationswinkel oder die Phase ab. Um die Probendoppelbrechung vom Hintergrund zu trennen, ist es erforderlich, den Polarisationszustand von Licht, das die Probe beleuchtet, zu modulieren und dann die Doppelbrechung quantitativ aus den gemessenen, sich ändernden Amplituden zu bestimmen. Wir bezeichnen dieses bildgebende Verfahren als Modulations-Polarisationsmikroskopie.
Es kann jede geeignete Kamera mit einer geeigneten Geschwindigkeit, Auflösung und geringem Rauschen verwendet werden, um die Bilder aufzuzeichnen. Um den Vorteile der hohen Modulationsgeschwindigkeit auszunutzen, muss auch die Bildrate der Kamera entsprechend schnell sein. Da die Berechnung der Doppelbrechung von kleinen Änderungen der Lichtintensität abhängt, sind gleichzeitig auch die numerische Genauigkeit (Bits pro Bildpunkt) und die Auflösung (Anzahl der Bildpunkte) wichtig. Die Kamera sollte auch ein geringes Rauschen und eine hohe Empfindlichkeit haben.
Zu beispielhafte Kamera, die dem Fachmann gegenwärtig zur Verfügung stehen und verwendet werden können, zählen die Hamamatsu Orca Flash 4, die Andor „Zyla” und ähnliche Kameras.
Um in einem bisherigen System die Ebene des polarisierten Lichts zu modulieren, wählten wir zwei aufeinander abgestimmte Faraday-Rotatoren, sodass die Ebene des polarisierten Lichts um 90 Grad, aber in entgegengesetzten Richtungen, gedreht wurde. Faraday-Rotatoren sind in der Lage, polarisiertes Licht mit Geschwindigkeiten von mehr als 1 KHz zu modulieren und Glasbasierte Systeme wie unseres behalten ein hohes Maß an Extinktion (~50.000), während Flüssigkristall-Retarder relativ langsam sind (0,1 Sekunden erfordernd um sich zu beruhigen, bevor ein Bild erhalten wird); und entsprechend dem schlechten Polarisations-Extinktionsverhältnis (< 1000) liefern sie einen geringen Doppelbrechungskontrast.
Während Flüssigkristall-Rotatoren statische Bilder mit gutem Kontrast produzieren, waren sie nicht für Bilder von Zytoskelett-Elementen in lebenden, sich schnell bewegenden Zellen geeignet. Faraday-Rotatoren ließen sich verwenden, um kleine Strukturen in lebenden Zellen sichtbar zu machen, sie sind jedoch dadurch begrenzt, dass sie nur linear polarisiertes Licht drehen und somit nicht die gesamte Poincaré-Kugel durchmustern können. Faraday-Rotatoren erfordern auch das Einspeisen großer Mengen an elektrischer Energie in die Magneten, wobei Erhitzung ein Problem für einen gleichbleibenden Betrieb der Geräteausstattung wird. Hochstrom-Faraday-Rotatoren müssen mit Wasser gekühlt werden und selbst unter Kühlung müssen ständig Temperaturänderungen kompensiert werden.
Angesichts der vielen Probleme mit früheren Ausgestaltungen haben wir einen neuen Ansatz zum Durchführen von Modulations-Polarisationsmikroskopie entwickelt. Eine Reihe wichtiger Merkmale leitete diese Ausgestaltung, die die Nutzung der Leistung der Polarisationsmikroskopie in bisher nicht gezeigter Weise ermöglicht. Das erste Merkmal war die Möglichkeit, den Polarisationszustand des einfallenden Lichts über die gesamte Poincaré-Kugel zu modulieren und Bilder mit hoher Geschwindigkeit aufzunehmen. Zweitens war es wichtig, Digitalbilder mit hoher numerischer Genauigkeit und hoher Auflösung zu erfassen. Drittens war es wichtig, ein optisches System und Komponenten einzusetzen, die eine hohe Polarisationsreinheit aufrecht erhalten. Viertens war es wichtig, dass der Modulationsansatz eine Nullmessung ermöglicht. Darunter verstehen wir, dass unabhängig davon, wie der Polarisationszustand vor der Probe moduliert wird, er nach der Probe demoduliert wird, sodass man die Probe so wie zwischen gekreuzten Polarisatoren sieht. Fünftens liefern wir einen Beleg dafür, dass eine Verbesserung im Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird, wenn der Polarisator und der Analysator nicht zueinander orthogonal sind. Vielmehr kann das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert werden, wenn der Polarisator und der Analysator von der orthogonalen Konfiguration verschieden ausgerichtet werden, was zu einem teilweisen Nullzustand führt. Schließlich suchten wir nach einem System, das leicht zu kommerzialisieren war und für viele Anwender zur Verfügung gestellt werden konnte.
Ein schematisches Diagramm eines Polarisationsmikroskops 100, das dazu geeignet ist, Modulations-Polarisationsmikroskopie durchzuführen, ist in 1 gezeigt. Das Polarisationsmikroskop 100 enthält eine Lichtquelle mit variabler Wellenlänge 110. Die Lichtquelle mit variabler Wellenlänge 110 ist dazu geeignet, Licht bei mehreren Wellenlängen in einem Spektralbereich von etwa 300 nm bis etwa 1000 nm zu emittieren. In einigen Ausführungsformen ist Lichtquelle mit variabler Wellenlänge 110 in der Lage, Licht mit einer Wellenlänge von zwischen ungefähr 350 nm bis ungefähr 800 nm zu produzieren. Die Lichtquelle mit variabler Wellenlänge 110 kann eine schnelle Schaltzeit zwischen den spektralen Emissionen haben. In einigen Ausführungsformen ist die Schaltzeit kürzer als die Austastlücke zwischen aufeinanderfolgenden Bildern. In einigen Ausführungsformen ist die Lichtquelle mit variabler Wellenlänge 110 dazu in der Lage, Emissionswellenlängen mit einer maximalen Geschwindigkeit von zwischen 1 Mikrosekunde/Wellenlänge und 5000 Mikrosekunden/Wellenlänge zu ändern. Die Lichtquelle mit variabler Wellenlänge 110 kann schnell zwischen Emissionswellenlängen umgeschaltet werden und eine ausreichende Strahlungsleistung bereitstellen, die über ein schmales Band an Wellenlängen auf die Probe auftrifft. Zu Beispielen für eine Lichtquelle mit variabler Wellenlänge, die verwendet werden können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Superkontinuumquellen; Bogenlampen; Plasmalampen; Induktionslampen; eine Kombination von Diodenlasern; abstimmbare Lasern, Leuchtdioden (LED); auf der digitalen Lichtprojektion (DLP, Digital Light Projection) basierende Geräten; usw.
Zu Lichtquellen mit variabler Wellenlänge, die verwendet werden können, zählen zwei Typen von Lichtquellen: 1) Lichtquellen, die gleichzeitig eine Vielzahl von Wellenlängen emittieren können, kombiniert mit einem spektral einstellbaren Filter, oder 2) Lichtquellen, die diskrete Emissionswellenlänge emittieren und die im Laufe der Zeit eingeschaltet oder eingestellt werden. Für Quellen, die eine Vielzahl von Wellenlängen gleichzeitig emittieren, wird ein einstellbarer Spektralfilter (z. B. ein Monochromator, ein Fabry-Perot-Filter, ein akustisch-optischer Filter) verwendet, um bestimmte Emissions-Wellenlängen auszuwählen. Zu Lichtquellen, die gleichzeitig eine Vielzahl von Wellenlängen emittieren, zählen Superkontinuumquellen, Lichtbogenlampen und Leuchtdioden (LEDs). Für Laserquellen, die zwischen Emissionswellenlängen umschalten, wäre eine beispielhafte Ausführungsform ein schnell einstellbarer Laser oder eine Lichtquelle, welche sich aus einer Vielzahl an Diodenlaserelementen zusammensetzt, jede mit einer kleinen M²-Zahl, die beispielsweise in einer Multimode-Faser kombiniert sind. Der Zweck der Multimode-Faser ist es, Licht räumlich zu dekorrelieren oder räumlich inkohärent zu machen. Eine beispielhafte Lichtquelle variabler Wellenlänge, die eine Lampe und einen einstellbaren Filter verwendet, ist die OL490 Agile Lichtquelle von Optronic Laboratories (Orlando, Florida). Ebenso kann eine hellgrüne LED in Kombination mit einem einstellbaren spektralen Filter als Lichtquelle dienen. Beispielhafte Superkontinuumquellen werden von NKT hergestellt. Ein akustisch-optischer Filter kann verwendet werden, um schnell ein schmales Band (1–5 nm) spektraler Emission auszuwählen. Da das von der Superkontinuumquelle emittierte Licht einen hohen Grad an räumlicher Kohärenz hat, kann Licht in eine Multimode-Faser gekoppelt sein, um räumlich inkohärentes Licht bereitzustellen, das auf die Probe fällt. Eine beispielhafte Lichtquelle, die einzelne Laserdioden verwendet, die mittels dichroitischer Elemente kombiniert werden, wird von Lumencor (Beaverton, Oregon) hergestellt. Auch einstellbare Laserquellen können eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform hat eine Laserquelle ein Verstärkungsmedium, das den interessierenden Spektralbereich abdeckt, und sie enthält ein einstellbares Element im Laserresonator. Die verschiedenen Lichtemissionswellenlängen werden von dem einstellbaren Element im Laserresonator ausgewählt. Licht, das vom einstellbaren Laser emittiert wird, wird in eine optische Multimodenfaser gekoppelt, um räumliche Kohärenz zu vermindern.
Das Polarisationsmikroskop 100 enthält einen ersten Polarisator 120, der eine erste Polarisationsachse hat. Der erste Polarisator 120 ist optisch mit der Lichtquelle mit variabler Wellenlänge 110 gekoppelt und fungiert somit für die Lichtquelle als Polarisator. Der erste Polarisator 120 empfängt Licht von der Lichtquelle mit variabler Wellenlänge und konvertiert das Licht zu linear polarisiertem Licht mit einer Orientierung, die zur ersten Polarisationsachse gleich ist (in 1 willkürlich dargestellt). Der erste Polarisator 120 kann ein Polarisationsprisma sein, dessen Leistung vorzugsweise nicht von der Wellenlänge des eingesetzten Lichts abhängt. Zu Beispielen für ein Polarisationsprisma zählen, sind aber nicht beschränkt darauf, Glan-Thompson-Prismen, Glan-Taylor-Prismen und Glan-Foucault Prismen. Ein zweiter Polarisator 160, der eine zweite Polarisationsachse hat (in 1 willkürlich dargestellt), fungiert als Analysator (Messgerät). Der zweite Polarisator 160 ist so orientiert, dass die zweite Polarisationsachse orthogonal auf der ersten Polarisationsachse steht. Der zweite Polarisator 160 ist ebenfalls ein wellenlängenunabhängiger Polarisator. Der zweite Polarisator 160 kann ein Polarisationsprisma sein. Vorzugsweise sind der erste Polarisator 120 und der zweite Polarisator 160 aufeinander abgestimmte Polarisatoren mit ähnlichem Aufbau und ähnlichen optischen Eigenschaften.
Zwischen dem ersten Polarisator 120 und dem zweiten Polarisator 160 befinden sich zwei Licht-Retarder (Licht-Verzögerungsmittel) 130, 150. Ein erster Retarder 130 ist optisch an den ersten Polarisator 120 gekoppelt. Der zweite Retarder 150 hat in Bezug auf den ersten Retarder ein entgegengesetztes Vorzeichen.
In einer Ausführungsform sind die Retarder Rotatoren (ein zirkularer Retarder), die eine Phasenverzögerung zwischen links- und rechts-zirkular polarisiertem Licht bewirken. In einer anderen Ausführungsform kann ein optisches Element, das sich aus einem Rotator (zirkularer Retarder) und einer Wellenplatte (linearer Retarder) zusammensetzt, als ein elliptischer Retarder verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein optisches Element, das sich aus zwei Wellenplatten zusammensetzt, die in Bezug aufeinander um 45 Grad ausgerichtet sind, als elliptischer Retarder eingesetzt werden.
In einer beispielhaften Ausführungsform können Retarder Kristall-Polarisationsrotatoren sein, die aus Quarz oder TeO₂-Kristallen hergestellt sind. In einer Ausführungsform sind die Kristall-Polarisationsrotatoren aus links- und rechts-drehenden Versionen von TeO₂-Kristallen gebildet. Kristall-Polarisationsrotatoren können linear polarisiertes Licht unabhängig von der Winkelausrichtung des Kristalls drehen, so dass zirkular polarisiertes Licht zirkular polarisiert bleibt. Der Winkel der Drehung (Δϕ) durch den Kristall-Polarisationsrotator um den Pol auf der Poincaré-Kugel ist eine Funktion der Wellenlänge (λ), der Dicke (d) und der zirkularen Doppelbrechung (Δn(λ)) des Rotators gemäß der folgenden Gleichung. Δϕ(λ) = 2π·d·Δn(λ) / λ
Der erste und der zweite Kristall-Polarisationsrotator sind aufeinander abgestimmte Licht-Rotatoren (äquivalente Dicke (d) und zirkulare Doppelbrechung (Δn(λ)), so dass die durch den ersten Rotator erzeugte Drehung durch den zweiten Rotator aufgehoben wird.
Retarder können auch aus links- und rechtsdrehenden optisch aktiven organischen Verbindungen (Enantiomeren), oder Enantiomorphen gebildet sein. Retarder können aus feststehenden Magneten oder elektromagnetischen Faradayrotatoren hergestellt sein. In einigen Ausführungsformen können Retarder aus Dünnfilm-Polymerbeschichtungen oder durch geeignete Nanostrukturierung aus optisch transparentem Material gebildet sein.
Das Polarisationsmikroskop 100 enthält auch einen Objekttisch 140, der optisch an den ersten Retarder 130 gekoppelt ist. Der Objekttisch 140 hält eine Probe im Strahlengang des vom ersten Polarisationsrotator empfangenen Lichts. Ein optisches Erfassungssystem ist optisch an den zweiten Polarisator (Analysator/Messgerät) 160 gekoppelt, um Licht zu erfassen, das durch den zweiten Polarisator tritt. Das optische Erfassungssystem enthält einen Detektor und einen Prozessor. Der Detektor kann eine ausreichend schnelle, empfindliche und geringe ladungsgekoppelte Vorrichtung mit geringem Rauschen oder eine Scientific CMOS-Kamera sein. Ein geeigneter Detektor ist der Orca-Flash 4.0 von Hamamatsu Photonics K. K. (Japan). Vorzugsweise sollte der Detektor dazu in der Lage sein, bis zu 100 Bildern pro Sekunde bei einer Auflösung von bis zu 2048×2048 zu erfassen. Höhere Bildraten und Auflösung wären ebenfalls brauchbar.
In der Konfiguration von 1 wird, wenn die Wellenlänge der Lichtquelle mit variabler Wellenlänge 110 geändert wird, linear polarisiertes Licht, das durch den erste Retarder 120 tritt, als Funktion der Wellenlänge zu einem neuen Polarisationswinkel gedreht, so dass kleine Änderungen der Emissionswellenlänge den Polarisationszustand um den Äquator der Poincaré-Kugel bewegen (2). Licht tritt dann durch die Probe, wo es aufgrund der Doppelbrechung der Probe verändert werden kann. Wenn das Licht durch den zweiten Retarder 150 tritt, wird die Drehung um einen gleichen Betrag zurück gedreht. Wenn der erste Polarisator 120 horizontal ausgerichtet ist, wird Licht nach dem Passieren durch den zweiten Retarder 150 zurück zum horizontalen Polarisationszustand gebracht werden. Licht tritt dann durch den zweiten Polarisator (Analysator/Messgerät) 160 mit vertikaler Orientierung, was horizontal polarisiertes Licht blockiert, das nicht durch die Doppelbrechung der Probe verändert wurde. Dies ist das Prinzip dessen, was wir hier als „Null-Messung” bezeichnen.
Die von einem linear doppelbrechenden Objekts erzeugte maximale Lichtintensität wird erhalten, wenn die Ebene des linear polarisierten Lichts in Bezug auf die Achse des doppelbrechenden Objekts zu 45° ausgerichtet ist. Da diese Objekte in der Zelle in jedem beliebigen Winkel ausgerichtet sein können, muss man den Polarisationswinkel durch ein Minimum von 90° drehen, um das maximale Doppelbrechungs-Lichtintensitätssignal zu erkennen. Dieser Drehbereich von 90° kann durch das Aufnehmen von Bildern erreicht werden, die mit Licht erhalten werden, das aus einer Quelle variabler Wellenlängen emittiert wird, die kürzere und längere Wellenlängen emittiert. Für einen TeO₂-Kristall-Rotator fällt der Wert der Drehung/mm Dicke (Δϕ/d) über den Bereich von 450–600 nm steil ab. Durch einen Wechsel von einer längeren zu einer kürzeren Wellenlänge kann man somit den Betrag der Drehung um mehr als 90° ändern. Mit zunehmender Dicke eines TeO₂-Kristall-Rotators (d wird größer) wird des Weiteren der Wellenlängenbereich kleiner, der erforderlich ist, um eine 90° Drehung um die Polachse auf der Poincaré-Kugel zu erzielen. Dies ermöglicht einen gewissen Spielraum, um den Wellenlängen-Arbeitsbereich maßzuschneidern.
Unter Verwendung der in 1 gezeigten Konfiguration, kann ein Anwender in einer Ausführungsform eine Reihe an voreingestellten Wellenlängen auswählen und bei jeder Wellenlänge ein Bild aufnehmen. Unter Verwendung einer Schaltzeit in der Größenordnung von 20 Mikrosekunden kann ein Anwender in einer Ausführungsform leicht zwischen dem Aufzeichnen jedes Bildes die Wellenlänge wechseln. Das Verarbeiten der Daten kann mit Hilfe eines einzigen Frequenz-Fourier-Filteralgorithmus nach Kuhn et al., ”Modulated Polarization Microscopy: A Promising New Approach to Visualizing Cytoskeletal Dynamics in Living Cells” Biophysics Journal, 80 (2001) 972–985, durchgeführt werden, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Es kann eine Kalibrierung erforderlich sein, um die Beleuchtungsintensität konstant zu halten und um den genauen Drehwinkel zu bestimmen, der für eine gegebene Wellenlänge erreicht wurde. In einigen Ausführungsformen erlaubt die Lichtquelle mit variabler Wellenlänge eine Computersteuerung der Beleuchtungsintensität. Die Bestimmung des Drehwinkels kann unter Verwendung einer rotierenden Polarisators erfolgen.
Die vorgeschlagene Konfiguration stellt ein Ausführungsbeispiel eines Polarisationsmikroskops dar. Eines der Probleme beim einfachen Drehen von linear polarisiertem Licht mittels eines zirkularen Retarders besteht darin, dass man zirkular oder elliptisch doppelbrechende Strukturen in der Probe nicht messen und abbilden kann. Zur Messung einer beliebigen Proben-Doppelbrechung ist es notwendig, die Probe sowohl linear als auch zirkular polarisiertem Licht, oder Kombinationen davon, auszusetzen. In einer alternativen Ausführungsform, die schematisch in 3 gezeigt ist, wird die Fähigkeit hinzugefügt, die Probe sowohl linear, zirkular als auch elliptisch polarisiertem Licht auszusetzen, während die Möglichkeit erhalten bleibt, eine Nullmessung durchführen zu können. In 3 ist der Retarder ein optisches Element, das aus einem Rotator (zirkularer Retarder) und einer Wellenplatte (linearer Retarder) zusammengesetzt ist. Wie in 3 gezeigt, ist die erste Wellenplatte 225 optisch mit ersten Polarisator 220 und dem ersten Rotator 230 gekoppelt. Auf die erste Wellenplatte 225 trifft polarisiertes Licht vom ersten Polarisator 220 und sie wandelt einfallendes linear polarisiertes Licht in zirkular polarisiertes Licht und elliptisch polarisiertes Licht um. Die erste Wellenplatte 225 lässt linear, zirkular oder elliptisch polarisiertes Licht (abhängig von der Wellenlänge) unterschiedlich zum ersten Rotator 230 passieren. Der erste Rotator 230 ändert die Orientierung des linear oder elliptisch polarisierten Lichts. Eine zweite Wellenplatte 255 ist optisch mit dem zweiten Polarisator 260 und dem zweiten Rotator 250 gekoppelt. Die zweite Wellenplatte 255 macht die Änderungen rückgängig, die durch die Passage durch die erste Wellenplatte 225 erzeugt wurden, indem sie zur ersten Wellenplatte 225 zu 90 Grad orientiert ist. Auf die zweite Wellenplatte 255 trifft zirkular oder elliptisch polarisiertes Licht vom zweiten Rotator von linear polarisiertem Licht 250 und sie wandelt das einfallende zirkular polarisierte Licht oder elliptisch polarisierte Licht zu linear polarisiertem Licht um. Das linear polarisierte Licht wird auf den zweiten Rotor 250 weitergeleitet, der dann linear polarisiertes Licht zurück auf seinen ursprünglichen Winkel, basierend auf dem ersten Polarisator, dreht. In einigen Ausführungsformen sind die Wellenplatten in Bezug auf die Polarisationsachse des ersten Polarisators 220 um +45° und –45° orientiert. Die Wellenplatten können aus jedem beliebigen geeigneten doppelbrechenden Material gefertigt sein wie Quarz, Glimmer und Polymere. Der erste und die zweite Wellenplatte sind aufeinander abgestimmte Wellenplatten (äquivalente Dicke (d) und zirkulare Doppelbrechung (Δn(λ))), so dass die von der ersten Wellenplatte erzeugten Änderungen durch die zweite Wellenplatte aufgehoben werden.
Während die Polarisationsrotatoren (zirkulare Retarder) den Polarisationszustand um die Polachse der Poincare-Kugel (als Funktion der Wellenlänge) drehen, um polarisiertes Licht zu geben, das unter verschiedenen Winkeln gedreht ist, ist es dagegen die Wirkung der Wellenplatten, den Polarisationszustand um eine Äquatorialachse auf der Poincaré-Kugel zu drehen. Wenn die Wellenlänge geändert wird, ermöglicht es die Wirkung der linearen und zirkularen Retarder zusammen, dass der Polarisationszustand sowohl azimutale (um die Pole) als auch longitudinale (um eine äquatoriale Achse) Bewegung auf der Poincaré-Kugel erzeugt und sich spiralartig um die Poincaré-Kugel bewegt, während er sich von einem Pol zum anderen bewegt. Die Gesamtverzögerung und damit die Zirkularität der Polarisation wird eine Funktion der Wellenlänge und der Dicke der Wellenplatten sein. Beispielsweise wird eine etwa 0,5 mm dicke Quarzwellenplatte, die bei 500 nm 9,25λ verzögert, bei 539,6 nm 8,52λ verzögern und bei 420,9 nm 11,25λ. In Anbetracht der Tatsache, dass man Verzögerungen voller Wellenlängen nicht detektieren kann, können wir uns willkürlich für eine gegebene Wellenlänge auf eine 9λ-Wellenplatte als bei dieser Wellenlänge mit 0 verzögernd beziehen. Bei 500 nm wirkt daher eine 9,25 Wellenplatte als Viertelwellenplatte. Was sich dann erkennen lässt, ist, dass sich beim Bewegen von 539 nm (8,5λ Verzögerung) zu 500 nm (9,25λ Verzögerung), die Verzögerung von ½λ zu ¾λ zu 0 zu ¼λ ändert. Bemerkenswerterweise ist Licht bei ½λ und 0λ eben polarisiert, während wir bei ¾λ und ¼λ links- bzw. rechtszirkular polarisiertes Licht haben. Auf der Poincaré-Kugel wird ein Wechsel von links- zu rechtszirkular polarisiertem Licht durch eine Bewegung von einem Pol zum anderen dargestellt. Für Wellenlängen zwischen denen, die eine zirkulare oder lineare Polarisation des Lichts ergeben, hätten wir elliptisch polarisiertes Licht mit verschiedenen Graden der Elliptizität. Nachdem Licht durch die Probe getreten ist, bringen der verbliebene Kristall-Rotator und die verbliebene Wellenplatte den Polarisationszustand zurück zu linear polarisiertem Licht mit horizontaler Orientierung. Das Ergebnis ist, dass das Feld ohne eine Probendoppelbrechung dunkel ist. Somit ermöglicht diese Anordnung wiederum eine Nullmessung.

Die optischen Elemente im in 3 gezeigten Mikroskop können jeweils durch eine Jones-Matrix widergegeben werden (Tabelle 1) und bei entsprechender Multiplikation zeigt die Matrix die Änderungen im Polarisationszustand, wenn Licht durch jedes Element des optischen Systems tritt. Der Polarisationszustand wurde für verschiedene Wellenlängen hinsichtlich der Verzögerungsplatten untersucht und ergab Verzögerungen von 0, 22,5 (1/8λ) und 45° (¼λ). Die Ergebnisse zeigen, dass unabhängig von der Wellenlänge des einfallenden Lichts das Licht nach dem letzten Retarder horizontal polarisiert ist, was eine Nullmessung ergibt. Tabelle 1

Wellenlängen-abhängige Verzögerung
	0°		22,5°		45°
horizontaler Polarisator	1	0	1	0	1	0
horizontaler Polarisator	0	0	0	0	0	0
Wellenplatte (45°)	1	0	0,938	0	0,707	0
Wellenplatte (45°)	0	0	0,346i	0	0,707i	0
Rotator (L)	0,707	0	0,663 + 0,245i	0	0,5 + 0,5i	0
Rotator (L)	–0,707	0	–0,663 + 0,245i	0	–0,5 + 0,5i	0
Rotator (R)	1	0	0,938	0	0,707	0
Rotator (R)	0	0	0,346i	0	0,707i	0
Wellenplatte (–45°)	1	0	1	0	1	0
Wellenplatte (–45°)	0	0	0	0	0	0
vertikaler Polarisator	0	0	0	0	0	0
vertikaler Polarisator	0	0	0	0	0	0

Die Gründe für die Verwendung einer Nullmessung liegen darin, dass sie ohne große Schwankungen in der Helligkeit der Hintergrundbeleuchtung die Detektion schwacher Signalen ermöglicht. Beim Betrachten beispielsweise zirkular polarisierten Lichts durch einen linearen Polarisator wäre das Bild sehr hell. Beim Betrachten einer schwachen Doppelbrechung zwischen gekreuzten Polarisatoren wäre das Bild andererseits relativ dunkel. Um beides zu tun, ist es wünschenswert, die Helligkeit der Beleuchtung zu begrenzen, so dass das hellste Bild auf der Skala liegt. Dies wiederum begrenzt die Empfindlichkeit der Kamera gegenüber den schwachen Signalen, die wir detektieren müssen. Mit einer Null-Messung wird die Helligkeit des einfallenden Lichts durch die Helligkeit der schwach doppelbrechenden Signale begrenzt.
Zur Detektion von Doppelbrechung in verschiedenen Formen wird linear polarisiertes Licht (0°) bei einer Wellenlänge (λ_i) nach seiner Ausbreitung durch eine Kombination von Wellenplatte (45°) und Rotator (θ) (3) in einen vorkalibrierten elliptischen Polarisationszustand umgewandelt. Elliptisch polarisiertes Licht fällt auf die Probe, nachdem es sich durch den Kondensator ausgebreitet hat. Um die Polarisationstransformationen im Mikroskop mit einem beliebigen Polarisationszustand zu analysieren, wird die Poincaré-Kugel verwendet und die Bezeichnung mit azimutalen (φ) und polaren (θ) Winkel auf einer Kugel mit dem Radius 1 vorgenommen. Wir betrachten eine beliebige elliptische Probendoppelbrechung (d. h. lineare und zirkulare Doppelbrechung), definiert durch (φ_o, θ_o) mit einer Phasenverzögerung δ_i bei einer Wellenlänge λ_i. Für eine Nullmessung ergeben Probenpositionen mit Nicht-Null-Doppelbrechung bei einer Wellenlänge λ_i eine Signalintensität (S_i), die proportional zum Quadrat der Phasenverzögerung (δ_i) ist, wobei (φ_o, θ_o) die Orientierung der Doppelbrechungsachse relativ zum Polarisationszustand des auf die Probe einfallenden Lichts bei λ_o angibt und Δφ_i, Δθ_i orthogonale Transformationen auf der Poincaré-Kugel sind, die den Polarisationszustand beim Eintreffen auf die Probe bei einer Wellenlänge λ_i in den Referenzzustand bei einer Wellenlänge λ_o abbilden.
Diese Gleichungen decken ein Problem bei der Durchführung einer Nullmessung auf. Da die Signalintensität (S_i) proportional zum Quadrat der Phasenverzögerung (δ²) ist, kann das Vorzeichen von δ nicht ermittelt werden – gleichbedeutend damit, dass die Richtung der Doppelbrechungsachse entartet ist. Wenn das Vorzeichen von δ (positive oder negative Doppelbrechung) mittels einer Nicht-Null-Messung bestimmt wird, wie wir nachfolgend zeigen, lässt sich eine 11-fache Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses erzielen.
Bei der vorgeschlagenen Nicht-Null-Messung wird der Polarisator vom Analysator (Messgerät) um einen kleinen Winkel verschoben, so dass nach dem Ausbreiten durch die Probe und die Rotator-Retarder-Kombination der Polarisationszustand (α_i, β_i) des auf den Analysator einfallenden Lichts bei jeder Wellenlänge (λ_i) leicht aus dem horizontalen Polarisationszustand (α = 0, β = π/2) versetzt ist. Im Fall einer nicht Nicht-Null-Messung ist die Signalstärke (S_i) für jede Wellenlänge (λ_i):
Um drei Parameter zu bestimmen – Phasenverzögerung (δ_o) und Achsen der Doppelbrechung (φ_o, θ_o), muss der Satz von nichtlinearen Gleichungen für die Nicht-Null-Messung gelöst werden. Das Verhältnis von zirkularer zu linearer Doppelbrechung (Δn_circ/Δn_lin) ist durch Δn_circ/Δn_lin = tan(θ_o) gegeben, während die Richtung der linearen Doppelbrechung der Probe im Laborsystem durch 2φ_o gegeben ist. Wenn beispielsweise N einfallende Wellenlängen (λ_i) eingesetzt werden, dann erfordert eine Bildgebung in Echtzeit eine Berechnung dieser drei Parameter zu vier Millionen Bildpunkten in N/F Sekunden, wobei F die Bildfrequenz der Kamera in Hz ist. Wenn N = 7 und F = 100, dann beträgt diese Zeit N/F = 0,07 Sekunden. Wir haben gezeigt, dass eine einzelne Radeon R9-290-Grafikkarte Messwerte mit der erforderlichen Geschwindigkeit verarbeiten kann. Mit einer gegebenen Anzahl an Kamera-Bildpunkten (beispielsweise 2048×2048 Pixel) beim Aufzeichnen von Daten mit der Signalstärke (S_i) bei sieben Wellenlängen beträgt die Datenmenge, die von der Videokarte verarbeitet werden muss, um eine Phasenverzögerung und Doppelbrechungs-Bilder zu berechnen, 2,8×10 Proben. Es gibt also etwa 15.000 FLOPs pro Bildpunkt, um die Nicht-Null-Gleichungen zu lösen. Es kann zum Beispiel ein optimierter Levenberg-Marquardt-Algorithmus verwendet werden, um die Signalintensitäts-Gleichungen zu lösen und Echtzeitbilder der Doppelbrechungseigenschaften der Probe an jeder Bildpunktstelle zur Verfügung zu stellen.
Die Gleichungen für die Signalintensität (S_i) bei jeder Wellenlänge enthalten Größen, die kalibriert werden sollen, darunter: der Nicht-Null-Zustand (α_i, β_i) bei jeder Wellenlänge λ_i und die orthogonalen Transformationen (Δφ_i, Δθ_i) auf der Poincaré-Kugel, die den auf die Probe treffenden Polarisationszustand bei der Wellenlänge λ_i dem Referenzzustand bei der Wellenlänge λ_o zuordnen oder in diesen abbilden. Für die Kalibrierungen ist es das Ziel, den Eingangszustand für auf die Probe einfallendes Licht zu bestimmen, so dass der zweite Kristall-Rotator und die zweite Wellenplatte aus dem Strahlengang entfernt werden. In einer Ausführungsform kann der Eingangszustand des zweiten Polarisators (Analysator/Messgerät) durch Drehen des Polarisators um diskrete Winkel bestimmt werden, indem er auf einem durch einen Pico-Motor angetriebenen Drehtisch (z. B. Newport AG-PR100, Newport Corporation, Irvine, Kalifornien) montiert wird und entweder in der zweiten Turmposition (engl. turret position) oder vor der Kamera platziert wird. Bilder, die erhalten werden, wenn der Polarisator gedreht wird, werden für die Bestimmung Bildpunkt für Bildpunkt der Elliptizität (tan(X_i,j)) und der Orientierung (Ψ_i,j) der Hauptachse der Polarisationsellipse verwendet. Weitere auf dem Gebiet der Lichtpolarisation bekannte Verfahren können zur Bestimmung des Eingangs-Polarisationszustands von Licht verwendet werden. Für eine zirkulare Polarisation sollte die Händigkeit aus dem Eingangszustand offensichtlich sein, sie könnte aber auch einfach durch Wiederholen der Messung mit dem Analysator (Messgerät) und einer zusätzlichen achromatischen λ/4-Platte und Bestimmung der Achse des sich ergebenden linear polarisierten Zustands bestimmt werden. Jede dieser Größen wird kalibriert und während des Betriebs des Mikroskops festgelegt. Ein nützliches Merkmal von Grafikkarten ist es, dass sie mit großen Mengen an Arbeitsspeicher zum Speichern von Bilddaten erhältlich sind. Diese Kalibrierungsbilder berücksichtigen Abbildungsfehler in den Linsen, die den Polarisationszustand verändern, und gleichen diese im Ergebnis aus.
Für Proben, die schnelle Bewegungen zeigen, ermöglicht die derzeitige Leistungsfähigkeit mit einer 4-Megapixel-Kamera das Aufnehmen von Bildern polarisierten Lichts bei 100 Bildern/Sekunde.
Mit einem früheren Modulations-Polarisationsmikroskop (1) haben wir Null-Messungen von Daten, die mit 30 Bildern/Sekunde mit Hilfe einer analogen Kamera und einer relativ schwachen Lichtquelle aufgezeichnet wurden. Trotzdem war mehr als genug Licht vorhanden. Da vorstellbar ist, dass wir Bildpunkte auf etwas Gleichwertiges wie eine analoge Kamera auslagern könnten, könnte es möglich sein, einen Punkt zu finden, wo ausreichend Licht vorhanden ist. Das Signal/Rausch-Verhältnis hängt allerdings von der Helligkeit des Leuchtflecks auf der Probe ab.
Bei Verwendung einer Nicht-Null-Messung, wo die Polarisatoren nicht genau gekreuzt sind, erhöht sich die Menge an Licht für den Detektor. Außerdem erhöht eine Nicht-Null-Messung tatsächlich das Signal/Rausch-Verhältnis, indem sie eine Signalgröße addiert, die in der Phasenverzögerung (δ) linear ist. Im Nicht-Null-Fall ist SNR_linear gegeben durch
Basierend auf der obigen Gleichung kann SNR durch den Einsatz einer helleren Lichtquelle erhöht werden.
Eine mögliche Wirkung des im vorangehenden beschriebenen Ansatzes ist es, dass der Spektralbereich an Wellenlängen, der nötigt ist, um alle spektralen Messungen zu erhalten, breit genug ist, dass Artefakte Eingang in die Daten finden können. Zu diesen Artefakten zählen Unterschiede in der Auflösung, unterschiedliche Streuung und Unterschiede in der Absorption. Es ist daher wünschenswert, den Wellenlängenbereich zu minimieren, der erforderlich ist, um alle spektralen (z. B. 7) Messungen zu erhalten. Unsere Daten zeigen, dass eine spektrale Bandbreite von 5 nm für jede Wellenlänge für eine genaue Berechnung der Doppelbrechung hinreichend ist. Größere Bandbreiten haben eine geringere Genauigkeit zur Folge. Eine höhere Genauigkeit kann durch die Verwendung schmaler Bandbreiten erreicht werden. Dies kann durch Beleuchtung mit einem Laser erreicht werden, wo die spektrale Emissionsbandbreite (nm) einzelner Laserlinien in der Größenordnung von 2 nm liegt. Angesichts der engen Bandbreite bei einer Beleuchtung mit einem Laser könnte man alle 7 Messungen über einen Wellenlängenbereich von weniger als 20 nm erhalten. Dieser enge Wellenlängenbereich mindert nachweisbare Unterschiede in der Auflösung, Streuung oder Absorption.
Der Einsatz eines engen Bereichs an Emissionswellenlängen, wie er beispielsweise von Lasern bereitgestellt wird, wird bevorzugt, wenn es das Ziel ist, die zusätzliche Leistungsfähigkeit bereitzustellen, die gleiche Probe mittels polarisiertem Licht oder mittels Fluoreszenz abzubilden. Die helle Beleuchtung durch die Quelle polarisierten Lichts kann fluoreszierende Moleküle ausbleichen, die bei den Wellenlängen absorbieren, die für die Bildgebung mit polarisiertem Licht verwendet werden. Der Einsatz eines engen Bereichs an Wellenlängen für die Bildgebung mit polarisiertem Licht lässt eine Fluoreszenz-Bildgebung von Molekülen zu, deren Absorptionsspektrum außerhalb der für die Bildgebung mit polarisierten Licht verwendeten Wellenlängen liegt.
Eine weitere Fähigkeit, die der vorgeschlagene Polarisationsmikroskopie-Ansatz erlaubt, ist eine strukturierte Beleuchtung an jeder spektralen Emissionswellenlänge. Bei einigen der Strahlungsquellen (z. B. Laser) kann die Abstrahlung in diskrete Emitter wie optische Fasern getrennt werden, die in der vorderen Ebene der Kondensorlinse angeordnet sind. Durch das Anordnen der diskreten Emitter in der vorderen Brennebene der Kondensorlinse kann der Winkel der auf die Probe einfallenden Strahlung gesteuert werden. Die Lichtemission von jedem der diskreten Emitter kann beispielsweise mit einem MEMS-Schalter verschlossen werden, so dass jede Kombination von Winkeln auf die Probe einfallenden Lichts für jede Wellenlänge erhalten werden kann. Dieser Ansatz ermöglicht eine Polarisationsmikroskopie mit Superauflösung. Obwohl Ansätze für superauflösende Mikroskopie bekannt sind, bietet die Kombination von spektral kodierter Hochextinktions-Polarisationsmikroskopie mit Superauflösung eine Reihe von einzigartigen Einsatzmöglichkeiten. Alternative Ansätze zur Verwendung mehrerer diskreter Fasern können verwendet werden, um die räumliche Beleuchtung von auf die Probe auftreffendem Licht zu steuern. Beispielsweise kann ein DLP-Chip an der vorderen Brennebene der Kondensorlinse angeordnet oder abgebildet werden, um den Beleuchtungswinkel auf der Probe steuern.
Es mag sinnvoll sein, bestimmte Moleküle und Strukturen zu identifizieren, um in den Genuss der vollen Leistungsfähigkeit der Bildgebung mit polarisiertem Licht zu kommen. Infolgedessen kann jede der Ausführungsformen des Polarisationsmikroskops die Fähigkeit zu Fluoreszenz-Aufnahmen besitzen. In einer Ausführungsform sind die optischen Polarisatoren, Wellenplatten und Rotatoren kompakt und lassen sich in den Strahlengang hinein und daraus heraus bewegen, um das Einführen optischer Komponenten für Fluoreszenz-Aufnahmen (z. B. ein dichroitischer Spiegel und geeignet Filter) in den Strahlengang zu ermöglichen. In einer Ausführungsform können die optischen Komponenten für die Polarisation an die Stelle eines dichroitischen Filtersatzes in Mikroskopen eingesetzt werden, die dazu ausgelegt ist, mehrere dichroitische Filtersätze zu halten. Dies kann die Verwendung des Standard-Epifluoreszenz-Strahlengangs in zum Beispiel dem Nikon Eclipse Ti inverted Mikroskop zu ermöglichen. Die Fluoreszenzbeleuchtung wird in diesem Fall einfach über einen Verschluss ein- oder ausgeschaltet. Statt eine separate Lichtquelle für Fluoreszenzbeleuchtung zu haben, kann alternativ ein Umschaltspiegel (z. B. von Newport Corporation, Irvine, Kalifornien) verwendet werden, um zwei alternative Strahlengänge zu beschicken, einen für Fluoreszenzanregung und eine für übertragenes (polarisiertes) Licht. Diese können umgeschaltet werden, je nachdem, welcher Bildgebungs-Modus vom Mikroskop-Anwender gewünscht wird.
Alternativ kann eine Lichtquelle, wie sie von einer Reihe von Lasern bereitgestellt wird, für Bildgebung mit polarisiertem Licht eingesetzt werden und eine zweite Breitbandlichtquelle (Lampe oder Superkontinuum) kann für Fluoreszenz eingesetzt werden. Hier würde die Laserbasierte Quelle in den vertikalen Strahlengang bzw. den für übertragenes Licht eintreten, während die Breitbandquelle den Standard-Epifluoreszenz-Strahlengang beleuchten würde (typischerweise durch die Rückseite des Mikroskops). Geeignete Kontrollen wie Klappen oder eine Stromeinspeisung in den Laser würden es ermöglichen, die Beleuchtung zwischen den Quellen abwechseln zu lassen. Die Kamera, die unter dem Mikroskop in einem linearen Pfad montiert sein kann, kann dazu verwendet werden, sowohl Bilder mit polarisiertem Licht als auch mit Fluoreszenz aufzufangen. Alternativ können zwei verschiedene Kameras eingesetzt werden, indem das Ausgangssignals von einem Anschluss des Mikroskops zu einem anderen abgeleitet würde.
Der Einsatz eines schmalen Bands (oder eines eng beieinander liegenden Satzes) spektraler Emissionswellenlängen für die Bildgebung mit polarisiertem Licht ermöglicht eine gewisse Flexibilität bei der Auswahl, welches Band verwendet wird. Für unterschiedliche spektrale Emissionswellenlängen kann die gleiche Optik verwendet werden, allerdings müsste das System für jeden Satz an Wellenlängen kalibriert werden (wie oben beschrieben). Alternativ könnte der Anwender verschiedene Retarder und Rotatoren für verschiedene Wellenlängenbänder einsetzen, um die Anordnung einzustellen. In jedem Fall gestattet die Verwendung von bestimmten Wellenlängenbändern die Bildgebung mit polarisiertem Licht bei einem Satz von spektralen Emissionswellenlängen, das ein Anregen und damit Bleichen von Fluorophoren außerhalb des Wellenlängenbandes vermeidet, das für die Bildgebung mit polarisiertem Licht verwendet wird.
Das offenbarte Polarisationsmikroskop kann dazu verwendet werden, biologische Ereignisse zu untersuchen, sobald sie auftreten. Zum Beispiel kann das neue Polarisationsmikroskop verwendet werden, um die Dynamik des Zytoskeletts in lebenden Zellen zu untersuchen. In einem Beispiel hat die Bildgebung mit polarisiertem Licht das Verständnis davon erleichtert, wie T-Zellen funktionieren. Helfer- und zytotoxischen T-Zellen wirken durch gezielte und fokussierte Sekretion von Molekülen in Richtung einer anderen Zelle. Dies wird vor allem durch die Bewegung des MTOC (engl. microtubule organizing center, Mikrotubuli-organisierendes Zentrum) bis zu der Kontaktstelle zwischen einer T-Zelle und seinem zugehörigen Zielobjekt bewerkstelligt sowie dem Fokussieren von sekretorischen Vesikeln um das MTOC herum. In einer Ausführungsform kann die Modulations-Polarisationsmikroskopie eingesetzt werden, um Mikrotubuli und das MTOC sowie sekretorische Vesikel in T-Zellen zu verfolgen. Das MTOC organisiert das Mikrotubuli-Zytoskelett in T-Zellen. In beispielsweise zytotoxischen T-Zellen aktiviert die zytotoxische T-Zelle (CTL) eine Zielzelle und die Signalübermittlung durch den T-Zell-Rezeptor führt zur T-Zellaktivierung. Dies führt zu einer drastischen Umorganisation der Oberflächenmoleküle an der Zielkontaktstelle als auch des zugrunde liegenden Zytoskeletts. Diese Umordnungen definieren das, was als immunologische Synapse bezeichnet wird. An einem bestimmten Punkt während der Synapsenbildung wird das MTOC bis zur Synapse gezogen. Entweder vor oder nach der Bewegung des MTOC bewegen sich sekretorische Vesikel entlang der Mikrotubuli in Richtung des MTOC, wo sie sich konzentrieren. Diese Kombination von MTOC-Translokation und Bewegungen sekretorischer Vesikel konzentriert schließlich die sekretorischen Vesikel an der Synapse, wo sie sezerniert werden. Das Verständnis des Mechanismus der MTOC-Translokation ist entscheidend, weil sie im Zentrum der T-Zell-Effektorfunktionen liegt. Darüber hinaus haben Untersuchungen gezeigt, dass Faktoren in der Tumorumgebung die MTOC-Translokation blockieren können, trotz der Tatsache, dass T-Zellen aktiviert werden. Dies kann zu einer Tumorhemmung führen.
Zu spezifischen Anwendungen der hier offenbarten Polarisationsmikroskope zählen die Visualisierung des Zytoskeletts, die Visualisierung von Vesikeln, Membranen, Zellorganellen, Viruspartikeln und organisierten Proteinansammlungen wie Kollagen. Alle diese Strukturen können nun in Echtzeit sichtbar gemacht werden. Polarisiertes Licht kann auch die Visualisierung von molekularen Wechselwirkungen ermöglichen. Nanostäbchen (Nanorods) sollten auf der Grundlage ihrer Wechselwirkung mit polarisiertem Licht sichtbar sein. Nanosphären (Nanokügelchen), wenn auch als Monomere unsichtbar, würden in dimerisierter Form sichtbar werden. Als Markierungen für individuelle Proteine oder Rezeptoren ließe sich eine Dimerisierung nachweisen, wenn zwei markierte Proteine in einer Bindungsreaktion zusammenkommen oder mit anderen Mitteln vernetzt werden.
Gold-Nanopartikel haben ein enormes Potenzial als Markierungen, da sie als Lichtstreuer um Größenordnungen heller als Fluorophore sind und sie nicht bleichen. Man kann somit leicht einzelne Goldnanopartikel abbilden. Darüber hinaus können Molekül-Bindungsereignisse die Emission verschieben, typischerweise zu längeren Wellenlängen. Beim Einsatz der Bildgebung mit polarisiertem Licht gibt es außerdem einen Unterschied zwischen kugelförmigen und stabförmigen Nanopartikeln oder wenn zwei kugelförmige Nanopartikel nahe aneinander kommen. Stabförmige Partikel depolarisieren die Beleuchtung und zeigen Anisotropie, während einzelne kugelförmige Nanopartikel dies nicht tun. Wenn jedoch zwei kugelförmige Nanopartikel zusammen kommen, verhalten sie sich in Bezug auf polarisiertes Licht wie Stäbchen und zeigen Anisotropie. Einzelne mit kleinen Nanopartikeln markierte Moleküle können somit abgebildet werden, um festzustellen, ob sie gebunden oder frei vorliegen.
In diesem Patent wurden bestimmte US-Patente, US-Patentanmeldungen und anderes Material (z. B. Artikel) durch Bezugnahme aufgenommen. Der Wortlaut solcher US-Patente, US-Patentanmeldungen und anderen Materials ist jedoch nur in dem Maß durch Bezugnahme aufgenommen, wie kein Widerspruch zwischen solchem Text und den hier enthaltenen anderen Angaben und Zeichnungen besteht. Im Falle eines solchen Widerspruchs ist dieser widersprüchliche Text in derartigen durch Bezugnahme aufgenommen US-Patenten, US-Patentanmeldungen und anderem Material spezifisch nicht durch Bezugnahme in diese Patentschrift aufgenommen.
Weitere Modifikationen und alternative Ausführungsformen verschiedener Aspekte der Erfindung werden sich im Hinblick auf diese Beschreibung für den Fachmann ergeben. Dementsprechend ist diese Beschreibung nur als veranschaulichend auszulegen; sie dient dem Zweck, dem Fachmann die allgemeine Art und Weise zu lehren, wie die Erfindung durchgeführt wird. Es soll verstanden werden, dass die Formen der Erfindung, die hier gezeigt und beschrieben sind, als Beispiele von Ausführungsformen zu verstehen sind. Elemente und Materialien können durch hier dargestellte und beschriebene ersetzt werden, Teile und Prozesse können umgekehrt werden, und bestimmte Merkmale der Erfindung können unabhängig voneinander verwendet werden – alles so wie es sich für einen Fachmann nach Erfassen der Beschreibung der Erfindung erschließt. Änderungen an den hier beschriebenen Elementen können vorgenommen werden, ohne von Geist und Umfang der Erfindung, wie in den folgenden Ansprüchen beschrieben, abzuweichen.

Claims

Polarisationsmikroskop, aufweisend: eine Lichtquelle mit variabler Wellenlänge; einen ersten Polarisator, der optisch mit der Lichtquelle mit variabler Wellenlänge gekoppelt ist, wobei der erste Polarisator einfallendes Licht in einem reinen Polarisationszustand weiterleitet; ein erstes Verzögerungsmittel, das optisch an den ersten Polarisator gekoppelt ist; einen Objekttisch, der optisch mit dem ersten Verzögerungsmittel gekoppelt ist, wobei der Objekttisch eine Probe im Strahlengang des vom ersten Verzögerungsmittel empfangenen Lichts hält; ein zweites Verzögerungsmittel, das optisch mit dem Objekttisch gekoppelt ist, wobei das zweite Verzögerungsmittel in Bezug auf das erste Verzögerungsmittel ein Verzögerungsmittel mit entgegengesetztem Vorzeichen ist; einen zweiten Polarisator, der optisch mit dem zweiten Verzögerungsmittel gekoppelt ist, wobei der zweite Polarisator senkrecht zum ersten Polarisator ausgerichtet ist; eine optische Erfassungsvorrichtung, die optisch mit dem zweiten Polarisator gekoppelt ist, wobei die optische Erfassungsvorrichtung Licht erfasst, das durch den zweiten Polarisator tritt.
Polarisationsmikroskop nach Patentanspruch 1, wobei die Lichtquelle mit variabler Wellenlänge dazu ausgelegt ist, Licht mit einer Wellenlänge von zwischen etwa 350 nm bis etwa 800 nm zu erzeugen.
Polarisationsmikroskop nach Patentanspruch 1 oder 2, wobei der erste Polarisator und/oder der zweite Polarisator ein Polarisationsprisma ist.
Polarisationsmikroskop nach einem der Patentansprüche 1–3, wobei das erste Verzögerungsmittel und das zweite Verzögerungsmittel Rotatoren sind.
Polarisationsmikroskop nach Patentanspruch 4, wobei das erste Verzögerungsmittel und das zweite Verzögerungsmittel Kristall-Polarisationsrotatoren sind.
Polarisationsmikroskop nach Patentanspruch 5, wobei der erste Kristall-Polarisationsrotator und der zweite Kristall-Polarisationsrotator aus Tellurdioxid zusammengesetzt sind.
Polarisationsmikroskop nach Patentanspruch 4, wobei der erste Kristall-Polarisationsrotator und der zweite Kristall-Polarisationsrotator aufeinander abgestimmte Kristall-Rotatoren sind.
Polarisationsmikroskop nach Patentanspruch 4, wobei der Grad der Verzögerung der Rotatoren zum Teil auf der Wellenlänge des einfallenden Lichts basiert.
Polarisationsmikroskop nach einem der Patentansprüche 1–3, wobei das erste Verzögerungsmittel und das zweite Verzögerungsmittel elliptische Verzögerungsmittel sind, die aus einem Rotator und einer Wellenplatte zusammengesetzt sind.
Polarisationsmikroskop nach einem der Patentansprüche 1–3, wobei das erste Verzögerungsmittel und das zweite Verzögerungsmittel elliptische Verzögerungsmittel sind, die aus zwei Wellenplatten zusammengesetzt sind, die in Bezug aufeinander um 45 Grad gedreht sind.
Polarisationsmikroskop nach einem der Patentansprüche 1–10, wobei die optische Erfassungsvorrichtung eine ladungsgekoppelte Vorrichtung ist.
Polarisationsmikroskop nach einem der Patentansprüche 1–11, wobei das Licht aus dem ersten Verzögerungsmittel durch die Probe tritt, die auf dem Objekttisch gehalten wird.
Polarisationsmikroskop nach einem der Patentansprüche 1–11, wobei das Licht vom ersten Verzögerungsmittel von der Probe reflektiert wird, die auf dem Objekttisch gehalten wird.
Verfahren zum Visualisieren einer Probe mittels eines Polarisationsmikroskops, aufweisend: die Probe auf einem Objekttisch eines wie in einem der Ansprüche 1–13 beschriebenen Polarisationsmikroskop platzieren und Bilder der Probe bei einer oder mehreren Wellenlängen erhalten.
Verfahren nach Patentanspruch 14, wobei Bilder der Probe erhalten aufweist, periodisch die Wellenlänge des auf die Probe auftreffenden Lichtes zu ändern und nach jeder Änderung der Wellenlänge des Lichts Bilder der Probe erfassen.
Verfahren nach Patentanspruch 15, wobei jede Änderung der Wellenlänge in einem Abstand zwischen 10 und 500 Mikrosekunden auftritt.
Verfahren nach einem der Patentansprüche 14–16, wobei Abbilden der biologischen Probe fortlaufend über einen Zeitraum von mindestens etwa 2 Sekunden ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Patentansprüche 14–17, wobei das Verfahren weiterhin aufweist: durch Ändern der Wellenlänge des von der Lichtquelle mit variabler Wellenlänge erzeugten Lichts den Polarisationszustand des Lichts über die gesamten Poincaré-Kugel modulieren.
Verfahren nach einem der Patentansprüche 14–18, des Weiteren aufweisend: die Orientierungsachse des ersten Polarisators in Bezug auf den zweiten Polarisator so anpassen, dass der erste Polarisator und der zweite Polarisator achsenversetzt (Off-Axis) sind; und von der Probe Bilder erfassen während der ersten Polarisator und der zweiten Polarisator achsenversetzt (Off-Axis) sind.
Verfahren nach einem der Patentansprüche 14–19, des Weiteren aufweisend: das Polarisationsmikroskop durch Bestimmen des Orientierungszustands des Lichtes kalibrieren, wenn der zweite Polarisationslicht-Rotator und die zweite Wellenplatte aus dem Strahlengang entfernt sind.
Verfahren nach Patentanspruch 20, wobei Bestimmen des Orientierungszustands des Lichts aufweist: den zweiten Polarisator um diskrete Winkel drehen und die Daten analysieren, die von der optischen Erfassungsvorrichtung gesammelt sind.