IT201600079558A1 - Apparato e metodo per l'analisi della denaturazione di collagene strutturato in materiali membranacei - Google Patents

Description

“Apparato e metodo per l’analisi della denaturazione di collagene strutturato in materiali membranacei”

DESCRIZIONE

La presente invenzione è relativa ad un apparato e ad un metodo per l’analisi della denaturazione idrotermica del collagene strutturato in materiali membranacei. In particolare, la presente invenzione è relativa ad un tale apparato e relativo metodo che rilevano il livello di deterioramento del collagene in base alla misura della trasmissione ottica in funzione della temperatura. In dettaglio, la presente invenzione è relativa ad un tale apparato e relativo metodo che integrano due sistemi, uno di misurazione della luce trasmessa (LTA) ed uno di microscopia ottica in luce polarizzata, che operano simultaneamente e che sono a loro volta integrati in un sistema programmabile più ampio che consente il controllo automatico delle misure eseguite in funzione della temperatura, la presente invenzione essendo finalizzata a valutare oggettivamente il livello di deterioramento del campione di materiali membranacei, come pergamena e/o pelle.

Stato deirarte.

Sono noti nell’arte apparati e metodi suN’argomento oggetto della presente invenzione.

In particolare, gli studi di denaturazione idrotermica del collagene strutturato riportati in letteratura risultano condotti fino ad oggi con tre diversi metodi definiti come micro-hot table (MHT), analisi del segnale di “shrinkage” (SA) e calorimetria differenziale (DSC).

La tecnica MHT fornisce immagini del processo, ma non è in grado di fornire dati oggettivi in quanto si basa sull’osservazione visiva. La tecnica SA fornisce immagini e la registrazione oggettiva di un segnale sensibile alla cinetica di shrinkage ma presenta alcuni limiti fondamentali, come: i) la cinetica di shrinkage non è riproducibile e di conseguenza non lo è neanche il profilo delle curve registrate dalle quali l’unico dato riproducibile ed oggettivamente ricavabile è la temperatura di massima attività di denaturazione (temperatura di shrinkage), ii) non fornisce informazioni su specifiche popolazioni di collagene con diversa stabilità idrotermica né sulla loro omogeneità.

Infine, la tecnica DSC fornisce una descrizione del processo di denaturazione del collagene basata su misure puramente termiche (entalpia di trasformazione) e, ad oggi, ancora mai ottenuta con immagini simultanee che supportino l’interpretazione delle curve.

Scopo della presente invenzione è quindi quello di superare od almeno minimizzare gli inconvenienti riscontrati nei sistemi e metodi per l’analisi della denaturazione idrotermica del collagene strutturato in materiali membranacei secondo l’arte nota e riassunti brevemente in precedenza.

Di conseguenza, in questo contesto, la presente invenzione è concepita per far fronte all’esigenza di fornire un apparato e metodo alternativo che sia in grado di ottenere con misure puramente ottiche risultati più completi di quelli ottenuti fino ad oggi, in particolare grazie all’integrazione di misure di proprietà ottiche con immagini simultanee.

Sommario dell'invenzione.

In un primo aspetto, la presente invenzione è relativa ad un apparato per l’analisi della denaturazione idrotermica del collagene in un campione di materiali membranacei, l’apparato comprendente:

una sorgente in grado di emettere un fascio di luce monocromatica;

una cella porta-campione per il campione da analizzare,

un ambiente termoregolato atto ad ospitare la cella porta-campione;

- un rivelatore del segnale di luce trasmessa che fuoriesce da detta cella quando detto campione è sottoposto a detto fascio di luce monocromatica;

un sistema di microscopia ottica in luce polarizzata, atto ad emettere e rivelare un fascio di luce polarizzata, in grado di acquisire immagini di detto campione da analizzare;

un dispositivo di controllo in grado di permettere la misura delle variazioni delle proprietà di diffusione ottica in funzione della differente temperatura di detto campione e di variare la temperatura stessa del campione;

mezzi di orientazione del fascio monocromatico per rendere collineari il fascio di luce monocromatica e il fascio di luce polarizzata su uno stesso asse ottico;

mezzi di movimentazione del campione per posizionare una porzione del campione in coincidenza di detto asse ottico in modo che detta porzione intercetti il fascio di luce monocromatica e il fascio di luce polarizzata;

in cui detta cella è configurata in modo da permettere al campione di ricevere detto fascio di luce monocromatica e detto fascio di luce polarizzata,

per cui l’apparato è configurato in modo che la stessa porzione di detto campione è atta ad essere simultaneamente sottoposta a detto fascio di luce monocromatica per la generazione di detto segnale di luce trasmessa ed osservata tramite detto sistema di microscopia ottica in luce polarizzata.

Pertanto, secondo la presente invenzione, in questo modo è possibile valutare oggettivamente il livello di deterioramento del campione, mediante l’analisi del processo di denaturazione idrotermica indotta durante la misura.

Inoltre, è anche possibile integrare due sistemi, uno di misurazione della luce trasmessa (LTA) ed uno di microscopia ottica in luce polarizzata, che operano simultaneamente e che sono a loro volta integrati in un sistema programmabile più ampio che consente il controllo automatico delle misure eseguite in funzione della temperatura.

Secondo una forma di realizzazione, detto campione di materiali membranacei è un campione di manufatti derivati da pelle animale, come pergamena, pelle conciata, cuoio, e simili.

Secondo una forma di realizzazione, detto campione è costituito da un volume con fibre meccanicamente destrutturate dal tessuto nativo, in condizioni di idratazione satura e con densità di fibre sufficientemente elevata da minimizzare gli effetti della luce che potrebbe attraversare zone della cella senza campione o scarse in fibre.

In questo modo viene impedita o ridotta al minimo la possibilità che il segnale di luce trasmessa venga alterato in modo artificioso, segnale che deve dipendere solo dal processo di denaturazione delle fibre e non dalla disposizione geometrica.

Secondo una forma di realizzazione, detta sorgente di luce emette un fascio laser espanso, regolabile in sezione e collimabile su una porzione di campione con alta densità di fibre.

In questo modo, è possibile ottenere misure di luce trasmessa senza contributi, o con un contributo minimo, da luce diretta (che dipende in modo non riproducibile/controllabile dalla cinetica di shrinkage), ma ottenute per trasmissione della sola luce diffusa le cui variazioni dipendono direttamente dal processo di denaturazione idrotermica.

Secondo una forma di realizzazione, detti fasci di luce monocromatica, per l’indagine di luce trasmessa, e di illuminazione in luce bianca polarizzata, per le indagini di microscopia, si propagano in direzioni opposte e sono resi collineari e sovrapponibili sulla stessa porzione del campione.

In questo modo, la posizione di detti fasci di luce è stata quindi resa fissa per evitare di alterare il loro allineamento reciproco.

Secondo una forma di realizzazione, detta sorgente di luce è una sorgente di laser ad HeNe, ad esempio di 5mW di potenza e di 632,8 nm di lunghezza d’onda, modulato in ampiezza da un modulatore acusto-ottico ad una frequenza tipicamente di qualche decina di Hertz.

Secondo una forma di realizzazione, l’apparato della presente invenzione comprende inoltre un disco, ad esempio di plexiglass, interposto tra la sorgente di luce e la cella porta campione, detto disco essendo fornito di facce satinate e ruotante ad una velocità di qualche decina di giri al secondo, per fare variare continuamente e casualmente la coerenza nei diversi punti della sezione del fascio ed, al tempo stesso, per migliorarne l’omogeneità nella distribuzione dell’intensità.

In questo modo la radiazione del fascio risulta essere priva di coerenza in modo da minimizzare effetti di interferenza ottica, originati dalle parti del fascio parzialmente riflesse dalle superfici della cella.

Secondo una forma di realizzazione, l’apparato della presente invenzione comprende inoltre una lente atta a convogliare il fascio di luce sul campione da analizzare.

In questo modo il fascio di luce viene convogliato sul campione da analizzare in maniera sufficientemente collimata.

Secondo una forma di realizzazione, l’apparato della presente invenzione comprende inoltre un diaframma ad apertura regolabile posizionato davanti al campione da analizzare.

In questo modo, è possibile variare l’area della sezione incidente sul campione in modo tale da poterne indagare un’area di dimensione variabile (tipicamente da 1 a 5 mm).

Secondo una forma di realizzazione, detto campione viene sigillato all’interno di detta cella porta campione.

In questo modo il campione viene mantenuto nella cella in condizioni di umidità satura.

Secondo una forma di realizzazione, detta cella che porta il campione da analizzare ha un fondo semitrasparente accessibile otticamente da entrambi i lati lungo lo stesso asse ottico per permettere il passaggio sia di detto fascio di luce monocromatica che di detto fascio di illuminazione per la microscopia.

In questo modo, è possibile effettuare la registrazione di immagini microscopiche in luce bianca riflessa della stessa porzione di campione attraversata dal fascio di luce monocromatica, che genera simultaneamente il segnale dell’analisi della luce trasmessa.

Secondo una forma di realizzazione, detto fondo semitrasparente di detta cella lascia passare una percentuale, ad esempio da 20 a 30%, del fascio di luce monocromatica.

In questo modo, tale percentuale del fascio di luce monocromatica è sufficiente a garantire un buon rapporto segnale-rumore e permette al tempo stesso la riflessione della luce bianca di illuminazione del campione, incidente dal lato opposto della cella, necessaria per la registrazione delle immagini microscopiche del campione stesso.

Secondo una forma di realizzazione, detta cella, in grado di contenere un campione di circa 100 pm di spessore, è realizzata in quarzo, misura circa 25 mm di diametro e si compone di una base porta-campione spessa circa 1 mm sul cui fondo è stato depositato uno strato di metallo semi-trasparente, ad esempio titanio, avente pochi decimi di micron di spessore.

Secondo una forma di realizzazione, detta cella è chiusa da un coperchio di quarzo che la sigilla grazie ad un sottile strato di grasso di silicone.

Secondo una forma di realizzazione, detto ambiente termoregolato è costituito da un involucro sostanzialmente cubico, preferibilmente in rame, riscaldato attraverso un avvolgimento di filo resistivo percorso da corrente erogata da un generatore di corrente.

In questo modo è possibile variare la temperatura del campione in maniera controllata ed automatica.

Secondo una forma di realizzazione, a detto involucro è fissato ad un sistema di movimentazione lungo due direzioni ortogonali nel piano perpendicolare all’asse ottico.

In questo modo viene resa possibile la selezione della zona del campione da indagare.

Secondo una forma di realizzazione, detto sistema di microscopia ottica in luce polarizzata è costituito da un obiettivo a focale lunga, ad esempio di circa 10 cm, con ingrandimento regolabile e da una telecamera a CCD.

Secondo una forma di realizzazione, la luce bianca di illuminazione è ottenuta da una lampada alogena ed è convogliata sul campione da un sistema di fibre ottiche.

Secondo una forma di realizzazione, detto sistema di microscopia ottica in luce polarizzata è fornito inoltre di un divisore di fascio semi-trasparente e di un fotodiodo.

In questo modo, il fascio di luce trasmessa viene deviato dal divisore semitrasparente verso il fotodiodo ed, al tempo stesso, attraverso detto divisore può passare verso il campione detto fascio di illuminazione per la microscopia e poi venire riflesso indietro verso detta telecamera.

Secondo una forma di realizzazione, l’apparato della presente invenzione comprende inoltre una lente posta in corrispondenza del fotodiodo, ad esempio di circa 5 cm di apertura.

In questo modo il fascio di luce monocromatica, dopo aver attraversato il campione, viene raccolto da detta lente e viene focalizzata su detto fotodiodo.

Secondo una forma di realizzazione, l’apparato della presente invenzione comprende inoltre un filtro interferenziale, posizionato davanti a detto fotodiodo, che permette il passaggio pressoché esclusivo del fascio di luce monocromatica.

Il questo modo viene aumentata notevolmente la sensibilità della rilevazione delle variazioni della luce trasmessa dal campione.

Secondo una forma di realizzazione, il segnale modulato rivelato da detto fotodiodo viene letto da un amplificatore del tipo “lock-in” che garantisce un rapporto segnale/rumore sufficientemente elevato.

Secondo una forma di realizzazione, detto dispositivo di controllo è collegato ad un rilevatore della temperatura del campione posizionato neN’ambiente termoregolato in stretta vicinanza col campione stesso.

Secondo una forma di realizzazione, detto rilevatore della temperatura è una termo-resistenza, il cui valore viene letto da un multimetro e convertito in valori di temperatura secondo una curva di taratura.

In questo modo, è possibile impostare l'intervallo di temperatura in cui effettuare la misura e controllare la rapidità con cui la temperatura viene variata.

Secondo una forma di realizzazione, l’apparato della presente invenzione è controllato da remoto mediante un computer che, impiegando un software appositamente sviluppato, provvede alla gestione automatica delle misure.

Secondo una forma di realizzazione, è gestita automaticamente, attraverso opportune interfacce, la strumentazione per il controllo della variazione della temperatura (multimetro), dell’acquisizione del valore di ampiezza segnale (amplificatore lock-in) e dell’acquisizione delle immagini (telecamera).

L’apparato per l’analisi della denaturazione idrotermica del collagene in un campione di materiali membranacei della presente invenzione permette pertanto di ottenere dei considerevoli vantaggi rispetto agli apparati di tecnica nota. Infatti, permette di valutare oggettivamente, mediante l’analisi del processo di denaturazione, il livello di deterioramento del campione di pergamena e/o pelle; ottenere informazioni sulle singole popolazioni di collagene con misure da curve riproducibili, originate dalla stessa porzione di campione visualizzata nelle immagini registrate simultaneamente; ottenere una descrizione del processo di denaturazione basata sulla misura di proprietà puramente ottiche (intensità di luce diffusa) complementare a quella ottenibile dall’analisi di altre proprietà (ad esempio termiche); di integrare due sistemi, uno di misurazione della luce trasmessa (LTA) ed uno di microscopia ottica in luce polarizzata, che operano simultaneamente e che sono a loro volta integrati in un sistema programmabile più ampio che consente il controllo automatico delle misure eseguite in funzione della temperatura.

Tali vantaggi permettono all’apparato della presente invenzione di trovare numerose applicazioni in svariati campi, come ad esempio la produzione di prodotti derivati dalla pelle animale e la conservazione di beni storico-artistici realizzati con materiali derivati dalla pelle, nonché lo studio di proteine non strutturate con interesse nel settore di produzione farmaceutico e cosmetico.

In un secondo aspetto, la presente invenzione è relativa ad un metodo secondo la rivendicazione 10.

La presente invenzione scaturisce infatti dalla considerazione generale secondo la quale il problema tecnico sopra evidenziato può essere risolto in modo efficace ed affidabile mediante un metodo per l’analisi della denaturazione idrotermica del collagene in un campione di materiali membranacei, metodo che comprende le seguenti fasi:

a) preparare il campione,

b) sottoporre il campione ad un fascio di luce monocromatica emesso da una sorgente di luce,

c) permettere a detto campione di trasmettere parte della luce incidente;

d) rilevare detta luce trasmessa per mezzo di un rilevatore;

e) registrare i dati rilevati da detto rilevatore,

f) elaborare ed interpretare detti dati registrati,

in cui una stessa porzione di detto campione è simultaneamente sottoposta a detto fascio di luce monocromatica per la generazione di detto segnale di luce trasmessa ed osservata tramite detto sistema di microscopia ottica in luce polarizzata.

Pertanto, per mezzo del metodo della presente invenzione, è possibile valutare oggettivamente il livello di deterioramento del campione.

Infatti, il deterioramento dei materiali a base collagene, come ad esempio pelle e pergamena, porta ad una riduzione del loro grado di stabilità (livello di crosslinking). Pertanto, analizzare la stabilità ed il modo in cui varia a causa di trattamenti o del degrado naturale consente di valutare lo stato di deterioramento del collagene e gli effetti di azione deteriogene.

Inoltre, dal livello di deterioramento del collagene e daN’omogeneità della sua distribuzione in campioni di pelle e pergamena dipendono le caratteristiche del cosiddetto processo di denaturazione idrotermica che trasforma il collagene, naturalmente ordinato in una struttura nativa gerarchicamente organizzata, in un gel amorfo.

Quindi l’analisi del processo di denaturazione idrotermica e la misura dei suoi parametri caratteristici fornisce dati che caratterizzano in modo quantitativo lo stato di degrado del collagene e la sua omogeneità.

Il metodo della presente invenzione proposto per l’analisi della denaturazione idrotermica di un campione di collagene è basato sulla misura della trasmissione ottica in funzione della temperatura. Infatti, un campione non denaturato è caratterizzato da una struttura ordinata con unità strutturali (fibrille, tropocollagene, ecc.) dalle dimensioni caratteristiche comparabili con la lunghezza d’onda del fascio di luce impiegato (ad esempio di 632,8 nm).

La trasmissione della luce attraverso un campione non denaturato è quindi fortemente limitata da fenomeni di diffusione ottica. A partire da questa situazione, aumentando la temperatura di un campione pienamente idratato intervengono processi che portano alla denaturazione idrotermica del collagene e lo trasformano in un gel amorfo. La nuova microstruttura del campione risulta caratterizzata da unità strutturali di dimensione inferiori a quelle del materiale ordinato, meno efficienti nel diffondere la luce. Il processo di denaturazione quindi altera rilevantemente le proprietà di diffusione ottica.

Pertanto, misurare le variazioni delle proprietà di diffusione ottica consente di determinare il processo indotto di denaturazione dalle cui caratteristiche si possono ricavare i parametri che definiscono lo stato di deterioramento del collagene nel campione di partenza.

Secondo una forma di realizzazione, la misura viene effettuata su un campione costituito da fibre di collagene in sospensione acquosa.

Secondo una forma di realizzazione, il campione, durante la fase a) sopra indicata, viene preparato sfibrando con una lama una sua porzione bagnata e mantenendo le fibre separate immerse in abbondante acqua (saturazione).

Secondo una forma di realizzazione, il campione viene inserito in una cella porta campione, preferibilmente di quarzo, che a sua volta viene alloggiata in un forno con controllo automatico della temperatura per indurre la denaturazione idrotermica. Durante la denaturazione idrotermica indotta, la quantità di luce del fascio incidente diffusa dal campione diminuisce e, conseguentemente, aumenta la quantità di luce trasmessa che viene raccolta da una lente che la focalizza sul rivelatore facendo registrare un aumento deN’ampiezza del segnale rilevato.

Pertanto, le variazioni d’intensità della luce trasmessa sono quindi direttamente generate dalla trasformazione del collagene in gel.

In questo modo, il metodo della presente invenzione fornisce, insieme alle immagini del processo di denaturazione, dati oggettivi che non erano ottenibili con la semplice analisi MHT nota nell’arte. Inoltre, consente, a differenza della tecnica SA nota nell’arte, di ottenere informazioni sulle singole popolazioni di collagene sulla base di dati estratti da curve riproducibili, originate dalla stessa porzione di campione visualizzata nelle immagini registrate simultaneamente. Infine, fornisce una descrizione del processo di denaturazione basata sulla misura di proprietà puramente ottiche (intensità di luce diffusa) del tutto nuova e complementare a quella ottenibile dall’analisi di altre proprietà (ad esempio termiche).

Eventuali ulteriori forme di realizzazione della presente invenzione sono specificate nelle rivendicazioni.

La presente invenzione viene illustrata qui di seguito in maggior dettaglio mediante descrizione dettagliata della forma di realizzazione esemplificativa e non limitativa illustrata nella tavole di disegno in allegato, dove

- la Figura 1 mostra un diagramma di flusso del metodo secondo la presente invenzione;

- la Figura 2 mostra una curva del segnale registrato (A) e curve di denaturazione (B) ottenute tramite il metodo descritto in Figura 1 ;

- la Figura 3 mostra una vista schematica di un apparato secondo una prima forma di realizzazione della presente invenzione;

- la Figura 4 mostra uno schema dettagliato del posizionamento del campione nella cella porta campione dell’apparato mostrato in Figura 3;

- la Figura 5 mostra curve di denaturazione del collagene (A e B) ottenute dall’elaborazione del segnale di luce trasmessa attraverso un campione di fibre idratate di collagene ed immagini (C e D) della porzione di campione analizzata nella misura B, registrate durante la misura a diverse temperature.

Descrizione dettagliata

Con riferimento alle Figure 3-4 viene qui di seguito descritta una forma di realizzazione dell’apparato per poter effettuare l’analisi della denaturazione idrotermica del collagene e la misura dei parametri caratteristici del suo stato di deterioramento. Come meglio mostrato in Fig. 3, l’apparato (100) è composto da una sorgente di luce monocromatica (1) per misura di luce trasmessa, un rivelatore di luce trasmessa (2), un ambiente termoregolato (3), otticamente accessibile, in cui è alloggiato il campione, un sistema di microscopia (4) in luce polarizzata per acquisire le immagini del campione ed un apparato di controllo (5) per esecuzione automatica delle misure variando in maniera controllata la temperatura del campione.

In particolare, in Figura 4 viene riportato uno schema del posizionamento del campione in una cella (6) porta campione e di quest’ultima neN’ambiente termoregolato (3), in particolare per quel che riguarda il suo orientamento rispetto ai fasci di luce per l’analisi LTA e per quella microscopica morfologica in luce polarizzata.

La sorgente di luce (1), fornisce il fascio di luce (schematizzato in Figura 3 con una linea tratteggiata) che attraversa il campione e genera il segnale di luce trasmessa. Nell’esempio specifico è stato utilizzato un fascio di luce di una laser del tipo Fle-Ne Spectra Physics, di 5mW di potenza e di 632,8 nm di lunghezza d’onda (rosso), modulato in ampiezza da un modulatore acusto-ottico del tipo Isomet mod. 1201 E-1 , ad una frequenza tipicamente di qualche decina di Flertz.

Il campione è costituito da fibre di collagene in sospensione acquosa. Il campione viene perciò preparato sfibrando con una lama una porzione bagnata di circa 1mm<2>di foglio di pergamena e mantenendo le fibre separate immerse in abbondante acqua (saturazione). Il campione, tipicamente di circa 100 pm di spessore, viene poi sigillato all’interno della cella (6) porta campione di quarzo di 25 mm di diametro, e mantenuto in condizioni di umidità satura. Sul fondo della cella (6), su cui incide il fascio di luce rosso, è stato applicato uno strato semiriflettente (7) di un paio di decimi di micron di metallo, ad esempio titanio.

Tale strato semiriflettente (7) lascia passare una percentuale (20-30%) del fascio stesso sufficiente a garantire un buon rapporto segnale-rumore e che permette al contempo la riflessione della luce bianca di illuminazione del campione, incidente dal lato opposto della cella, necessaria per la registrazione delle immagini microscopiche del campione stesso. La cella (6) è chiusa da un coperchio (8) con chiusura ermetica di quarzo che la sigilla grazie ad un sottile strato di grasso di silicone.

La cella (6) viene quindi inserita in un ambiente termoregolato (3), che ne varia la temperatura in maniera controllata ed automatica, con due finestre trasparenti su due lati opposti, per permettere l’accesso al campione dei due fasci ottici sopracitati di luce monocromatica (ad esempio rosso) e di luce per la microscopia (tipicamente bianca). L’ambiente termoregolato (3) consiste in un involucro cubico di circa 6-7 cm di lato, in rame, riscaldato attraverso un avvolgimento di filo resistivo percorso da corrente erogata da un generatore di corrente e controllata automaticamente. Le due finestre trasparenti, montate sui lati superiore ed inferiore deN’ambiente termoregolato (3) sono costituite da due dischi in vetro di 25 mm di diametro ed 1 mm di spessore. I due fasci, che si propagano in verso opposto, sono resi collineari e sovrapponibili sulla stessa zona del campione. La loro posizione viene quindi resa fissa per evitare di alterare il loro allineamento reciproco, e la selezione della zona del campione da indagare è resa possibile applicando all’involucro (3) di rame un sistema di movimentazione (9) lungo due direzioni ortogonali nel piano perpendicolare all’asse ottico.

La luce del fascio viene fatta passare attraverso un disco di plexiglass (10) con le facce satinate, ruotante ad una velocità di qualche decina di giri al secondo (10-30), per fare variare continuamente e casualmente la coerenza nei diversi punti della sezione del fascio, ed, al contempo, per migliorarne l’omogeneità nella distribuzione dell’intensità. La luce del fascio viene poi raccolta da una lente (11) per convogliarla, in maniera sufficientemente collimata, sul campione da analizzare. Un diaframma ad apertura regolabile (12) è posizionato davanti al campione in modo da poterne variare l’area della sezione del fascio di luce che incide sul campione e quindi da poterne indagare un’area di dimensione variabile (tipicamente da 1 a 5 mm).

La zona del campione interessata dalle prove di trasmissione viene simultaneamente osservata attraverso un sistema di microscopia (4) in luce polarizzata, per la ripresa delle immagini del campione durante le fasi della denaturazione, costituto da un obiettivo a focale lunga (10 cm) con ingrandimento regolabile, ad esempio del tipo Navitar 7x, ed una telecamera a CCD Pixera Pro 150 ES. La sorgente di luce (13) per il sistema di microscopia (4) è costituita da una lampada alogena e la luce bianca di illuminazione da essa emessa viene convogliata sul campione da un sistema di fibre ottiche (non mostrate nelle figure).

Davanti al sistema di microscopia (4) sono previsti mezzi di ripartizione, ad esempio un divisore di fascio (14). Preferibilmente, il divisore di fascio è semitrasparente e comprende una lastra di vetro dello spessore di circa 0,2 mm inclinato, ad esempio a circa 45° rispetto ai fasci ottici, per deviare il fascio utilizzato nelle prove di trasmissione verso il rivelatore di luce trasmessa (2), ad esempio un fotodiodo, e nel contempo per lasciare passare la luce bianca, prima verso il campione e poi riflessa indietro verso la telecamera. La luce del fascio rosso, dopo aver attraversato il campione viene raccolta da una lente di 5 cm di apertura (15) e focalizzata sul fotodiodo (2) davanti al quale è posizionato un filtro interferenziale (non mostrato nelle figure), che permette il passaggio pressoché esclusivo della luce rossa stessa. In questo modo si aumenta notevolmente la sensibilità della rilevazione delle variazioni della luce trasmessa dal campione. Il segnale modulato rivelato dal fotodiodo (2) viene letto da un amplificatore del tipo lock-in Stanford mod. SR 830, che garantisce un rapporto segnale rumore sufficientemente elevato.

Il segnale rilevato dal fotodiodo (2) viene automaticamente registrato in funzione della temperatura del campione e visualizzato su un grafico. I dati della curva ottenuta mostrata in Figura 2 A, vengono elaborati secondo quanto descritto qui di seguito e si ottengono altre curve mostrate in Figura 2 B, caratteristiche del processo di denaturazione idrotermica, dalle quali è possibile estrarre i valori dei parametri caratteristici dello stato di deterioramento del campione.

L’elaborazione dei dati consiste nel ridurre il grado di dispersione dei dati causato dal rumore e nel convertire, attraverso un’operazione di derivata del segnale in funzione della temperatura, la curva dei dati registrati, Figura 2A, in una curva che descrive le fasi e la rapidità con cui avviene la denaturazione, Figura 2B - curva 2. In particolare, da questa curva è possibile ricavare, tramite procedimenti di regressione matematica, il profilo di diverse curve gaussiane Figura 2B - curve 3, ciascuna associata ad una specifica popolazione di collagene, di cui alcune caratteristiche come posizione e larghezza sono direttamente correiabili al grado ed aN’omogeneità del deterioramento che caratterizza il collagene delle singole popolazioni. Per quanto riguarda l’interpretazione delle curve ottenute, le loro caratteristiche possono essere associate a specifiche fasi della denaturazione grazie al confronto con le immagini simultaneamente registrate tramite un sistema di microscopia a focale lunga in luce polarizzata in grado di visualizzare i cambiamenti della morfologia del campione in corrispondenza della medesima zona irradiata per le misure di trasmissione. Un programma gestisce automaticamente la registrazione simultanea sia del segnale di trasmissione ottica sia delle immagini. Si rende così possibile, ad ogni temperatura, associare ad ogni specifica caratteristica delle curve di denaturazione una corrispondente immagine che visualizza la morfologia assunta dalle fibre in quella data fase della denaturazione.

Tramite il dispositivo di controllo (5), è possibile impostare l’intervallo di temperatura in cui effettuare la misura e controllare la rapidità con cui la temperatura viene variata. Il controllo di temperatura viene effettuato tramite una termometro posizionato nell’involucro (3) in stretta vicinanza col campione, come ad esempio una termo-resistenza, il cui valore viene letto da un multimetro del tipo HP mod. 3478Ae convertito in valori di temperatura secondo una curva di taratura.

L’intero apparato di misura è controllato da remoto mediante un computer che, impiegando un software appositamente sviluppato, provvede alla gestione automatica delle misure. In particolare è gestita automaticamente, attraverso opportune interfacce, la strumentazione per il controllo della variazione della temperatura (multimetro), dell’acquisizione del valore di ampiezza segnale (amplificatore lock-in) e dell’acquisizione delle immagini (telecamera).

Sono stati analizzati due campioni distinti 1 e 2, prelevati da un foglio di pergamena rispettivamente in un’area B non attaccata da batteri ed in un’area A attaccata da batteri. I risultati ottenuti sono descritti qui di seguito con riferimento alla Figura 5. I dati sperimentali rappresentano un’elaborazione del segnale L di luce trasmessa e descrivono il processo generale di denaturazione idrotermica. Nelle fibre di pergamena sono presenti due popolazioni di collagene con diverso grado di stabilità: il collagene nativo che si trova nel nucleo e tra le fibre (N: meno stabile) e quello stabilizzato della guaina (G: più stabile). Elaborando i dati sperimentali è possibile separare i contributi di queste diverse popolazioni di collagene. Nel grafico la popolazione del nucleo è rappresentata della curva nera continua (N), quella della guaina dalla curva nera tratteggiata (G).

Il valore di temperatura di un picco è un indice del grado medio di stabilità di una data popolazione di collagene e diminuisce con l’aumento del degrado. La larghezza del picco a metà altezza (ΔΤ1/2) è un indice di disomogeneità del grado di stabilità di quella popolazione: più il valore è alto, più lo stato di deterioramento del collagene è disomogeneo.

Il grafico B mostra come un determinato fenomeno (in questo caso l’azione di un particolare tipo di batteri) porti a degradare rilevantemente la guaina, cioè la porzione più esposta delle fibre (TG diminuisce di circa 7°C rispetto al campione A) e ad aumentare la disomogeneità di questo collagene (ΔΤ1/2 aumenta di quasi un fattore 2). Per quanto riguarda il collagene (N), esso si trova nel nucleo ma anche tra le fibre. I batteri effettuano una rimozione selettiva di quello più esposto (tra le fibre) e lasciano sostanzialmente inalterato quello più protetto e meno disomogeneo (nel nucleo).

Le immagini C e D di Figura 5, registrate durante la misura riportata nel grafico B illuminando l’area racchiusa dal cerchio, rappresentano rispettivamente l’immagine del campione fibroso prima della denaturazione (35°C) e durante l’ultima fase della transizione (75°C) quando il campione è quasi del tutto trasformato in gel. NeN’immagine D, ottenuta in luce polarizzata a polarizzatori incrociati, il campione trasformandosi in gel amorfo cessa di essere birifrangente, quindi non più in grado di alterare la polarizzazione della luce ed appare quasi uniformemente nero. Diversamente neN’immagine C, registrata prima dell’inizio della denaturazione, il campione è ancora composto da collagene ordinato, la struttura fibrosa è ben evidente e luminosa grazie alle proprietà di birifrangenza delle fibre costituite da collagene ancora integro.

Con la presente invenzione è quindi possibile valutare oggettivamente il livello di deterioramento del campione, mediante l’analisi del processo di denaturazione idrotermica indotta durante la misura.

La presente invenzione è stata qui descritta con riferimento a sue forme di realizzazione preferite, ma si comprenderà che potranno essere apportate modifiche equivalenti senza uscire daN'ambito della tutela accordata ad essa. Di conseguenza, l’ambito di protezione della presente invenzione non deve essere limitato alle forme di realizzazione particolari sopra descritte solo a scopo esemplificativo, ma deve essere considerato in base alle rivendicazioni qui allegate.

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Apparato (100) per l’analisi della denaturazione idrotermica del collagene in un campione di materiali membranacei, l’apparato comprendente: una sorgente (1) in grado di emettere un fascio di luce monocromatica; una cella (6) porta-campione per il campione da analizzare, un ambiente termoregolato (3) atto ad ospitare la cella (6) portacampione; un rivelatore (2) del segnale di luce trasmessa che fuoriesce da detta cella (6) quando detto campione è sottoposto a detto fascio di luce monocromatica; un sistema di microscopia ottica in luce polarizzata (4), atto ad emettere e rivelare un fascio di luce polarizzata, in grado di acquisire immagini di detto campione da analizzare; - un dispositivo di controllo (5) in grado di permettere la misura delle variazioni delle proprietà di diffusione ottica in funzione della differente temperatura di detto campione e di variare la temperatura stessa del campione; mezzi di orientazione (16) del fascio monocromatico per rendere collineari il fascio di luce monocromatica e il fascio di luce polarizzata su uno stesso asse ottico; mezzi di movimentazione (9) del campione per posizionare una porzione del campione in coincidenza di detto asse ottico in modo che detta porzione intercetti il fascio di luce monocromatica e il fascio di luce polarizzata; in cui detta cella (6) è configurata in modo da permettere al campione di ricevere detto fascio di luce monocromatica e detto fascio di luce polarizzata, per cui l’apparato è configurato in modo che la stessa porzione di detto campione è atta ad essere simultaneamente sottoposta a detto fascio di luce monocromatica per la generazione di detto segnale di luce trasmessa ed osservata tramite detto sistema di microscopia ottica in luce polarizzata (4).
2. 2. Apparato secondo la rivendicazione 1 , in cui detta cella (6) portacampione ha un fondo semitrasparente e accessibile otticamente da entrambi i lati lungo lo stesso asse ottico per permettere il passaggio del fascio di luce monocromatica da un primo lato e del fascio di luce polarizzata da un secondo lato.
3. 3. Apparato secondo la rivendicazione 2 configurato in modo che detti fasci di luce monocromatica e detto fascio di luce polarizzata sono atti a provenire da direzioni opposte.
4. 4. Apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto ambiente termoregolato comprende un involucro riscaldato attraverso un avvolgimento di filo resistivo atto ad essere percorso da corrente erogata da un generatore di corrente e controllata automaticamente, per cui detto ambiente termoregolato è atto a variare la temperatura del campione in maniera controllata ed automatica.
5. 5. Apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto sistema di microscopia ottica in luce polarizzata è fornito di una telecamera a CCD e di un divisore di fascio in grado di deviare verso detto rivelatore del segnale di luce detto fascio di luce trasmessa ed al tempo stesso di lasciare passare detto fascio di luce di illuminazione per la microscopia verso il campione e poi riflessa indietro verso detta telecamera.
6. 6. Apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto dispositivo di controllo è collegato ad un rilevatore della temperatura del campione posizionato neN’ambiente termoregolato in stretta vicinanza col campione stesso.
7. 7. Apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, che comprende inoltre un disco di polimetilmetacrilato interposto tra la sorgente di luce e la cella porta campione, detto disco essendo fornito di facce satinate e atto a ruotare per fare variare continuamente e casualmente la coerenza nei diversi punti della sezione del fascio.
8. 8. Apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, che comprende inoltre una lente atta a convogliare in maniera collimata il fascio di luce sul campione da analizzare.
9. 9. Apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, che comprende inoltre un diaframma ad apertura regolabile posizionato davanti al campione da analizzare.
10. 10. Metodo per l’analisi della denaturazione idrotermica del collagene in un campione di materiali membranacei mediante un apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, che comprende le seguenti fasi: a) preparare il campione, b) sottoporre il campione ad un fascio di luce monocromatica emesso da una sorgente di luce, c) permettere a detto campione di emettere una luce trasmessa; d) rilevare detta luce trasmessa per mezzo di un rilevatore; e) registrare i dati rilevati da detto rilevatore; f) elaborare ed interpretare detti dati registrati, in cui una stessa porzione di detto campione è simultaneamente sottoposta a detto fascio di luce monocromatica per la generazione di detto segnale di luce trasmessa ed osservata tramite detto sistema di microscopia ottica in luce polarizzata.
11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10 in cui detto campione è costituito da fibre di collagene in sospensione acquosa ed in detta fase a) viene dapprima preparato sfibrando una porzione bagnata del campione, mantenendo le fibre separate e saturate in acqua, e poi sigillato in una cella porta campione di quarzo.
12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 10 od 11 in cui in detta fase b) detta cella porta campione di quarzo viene alloggiata in un forno con controllo automatico della temperatura per indurre la denaturazione idrotermica, durante la quale diminuisce la quantità di luce del fascio incidente diffusa dal campione e, conseguentemente, aumenta la quantità di luce trasmessa.