CN103439305A - 全内反射荧光显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像方法及装置。所述装置包括激光器，发出激光束；针孔滤波器，对激光器发出的激光束进行空间滤波；准直透镜，将经过空间滤波的激光束准直为平行光束；偏振转换系统，对所述平行光束进行偏振态转换，获得高级次轴对称偏振光束；光瞳滤波器和环形光阑，对获得的高级次轴对称偏振光束进行振幅及相位调制；反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场；反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上，光电探测器用于探测信号，以及信号分析处理系统。

Description

全内反射荧光显微成像方法及装置

技术领域

本发明涉及全内反射荧光显微成像技术，具体涉及一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像方法及装置。

背景技术

全内反射荧光显微技术(Total Internal Reflection FluorescenceMicroscopy,TIRFM)是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的倏逝场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比很高。这种方法的成像装置简单,极易和其它成像技术、探测技术相结合。目前已成功的实现了100nm甚至更低的空间分辨率，被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。

全内反射荧光显微技术的提出应该追溯到20世纪80年代中期。到目前,科学家们已发展了多种全内反射荧光显微成像系统，其中棱镜型和物镜型是最为普遍的两种类型。棱镜型系统在实现上更加容易,它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上,它也不容易受到入射光信号的干扰,但是放置样品的空间受到棱镜的限制。物镜型系统中样品的放置则非常方便,并且在对样品的控制上可与多种其它技术相结合,例如纳米操纵、光镊技术等,展现出更加诱人的生物应用前景。

作为一种光学显微镜，如何进一步提高成像的空间分辨率和时间分辨率依然是全内反射荧光显微技术的关键问题之一。

发明内容

本发明将高级次轴对称偏振光束引入到全内反射荧光显微技术中，通过灵活的调控入射光束的偏振及相位分布，可以灵活调控“荧光探针”的空间分布，从而实现高分辨率的显微成像。

本发明提供一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像装置，包括：激光器，发出激光束；针孔滤波器，对激光器发出的激光束进行空间滤波；准直透镜，将经过空间滤波的激光束准直为平行光束；偏振转换系统，对所述平行光束进行偏振态转换，获得轴对称偏振分布；光瞳滤波器和环形光阑，对获得的轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，其中环形光阑的作用是阻挡低于全反射临界角的光束入射到聚焦物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声；反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场，该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，因此只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制；反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上；光电探测器，布置于针孔阵列板后，以探测信号；信号分析处理系统，对信号进行分析处理。

可选的，所述偏振转换系统包括：棱镜，将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；和一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏转角度以及光斑大小与两透镜的焦距比值有关，使满足偏转方向和光斑大小的光束入射进聚焦物镜。

可选的，所述光束偏转系统包括：电控偏转器，用于将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束。

可选的，所述高级次轴对称偏振光束的偏振级次小于5，聚焦系统透镜数值孔径高于0.95。

本发明提供一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像方法，包括如下步骤：激光器发出激光束；针孔滤波器对激光器发出的激光束进行空间滤波；准直透镜将经过空间滤波的激光束准直为平行光束；偏振转换系统对所述平行光束进行偏振态转换，获得轴对称偏振分布；光瞳滤波器和环形光阑对获得的轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，其中环形光阑用于阻挡低于全反射临界角的光束入射到聚焦物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声；反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场，该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，因此只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制；反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上；光电探测器，布置于针孔阵列板后，以探测信号；信号分析处理系统，对信号进行分析处理。

附图说明

图1(a)是初始偏振方位角为-45°的柱矢量光束(P=1)，图1(b)是径向偏振光，图1(c)是切向偏振光，图1(d)是P=2的柱矢量光束，图1(e)是P=3的柱矢量光束，图1(f)是P=4的柱矢量光束，其中箭头表示对应位置线偏振的方位。

图2(a)是基于轴对称偏振光束的全内反射荧光显微技术结构示意图，图2(b)是差动共焦检测系统，图2(c)是基于旋转棱镜的光束偏转系统，以及图2(d)是基于电控偏转器的光束偏转系统。

图3(a)和图3(b)是生成高级次轴对称偏振光束的两种典型方法。

图4(a)-图4(b)是偏振级次为4的两种高级次轴对称偏振光束在玻璃-样品界面附近的倏逝场强度分布，图4(c)-图4(d)是偏振级次为10的两种高级次轴对称偏振光束在玻璃-样品界面附近的倏逝场强度分布。

图5是针孔阵列板的结构示意图。

具体实施方式

在本发明中，通过采用具有空间偏振变化的轴对称偏振光束，调控入射激光光束的振幅、相位及偏振分布，可调控倏逝场的分布，获得更小的“荧光探针”，提高探测的空间分辨率，实现了三维超分辨聚焦。

轴对称偏振光束是一类具有轴对称偏振分布特性的矢量光束，对称轴为光束的传播轴。在光束横截面上任意一点（中心点除外）都为线偏振，沿圆周方向的偏振方位变化满足如下关系，

Φ(r,φ)=P×φ+φ₀   (P≠0))    (1)

其中，P称为偏振级次，表示光束沿圆周方向变化360°时偏振方位变化的周期数；φ₀是当φ=0时对应的初始偏振方位角，其值与x轴的选取有关。当偏振级次P大于1时，通常称之为高级次轴对称偏振光束。不同的偏振级次和初始偏振方位角对应不同形式的轴对称偏振光束，其光束横截面上的偏振分布形式也不同，如图1(a)－图1(f)所示。其中，图1(a)是初始偏振方位角为-45°的柱矢量光束(P=1)，图1(b)是径向偏振光，图1(c)是切向偏振光，图1(d)是P=2的柱矢量光束，图1(e)是P=3的柱矢量光束，图1(f)是P=4的柱矢量光束，其中箭头表示对应位置线偏振的方位。

高级次轴对称偏振光束因为独特的偏振分布，具有一些独特的聚焦特性，例如在高数值孔径聚焦的情况下，可以获得多个超小聚焦光斑，具体可参考文献“高偏振级次轴对称偏振光束的聚焦（Focusing of highpolarization order axially-symmetric polarized beams），Chin OptLett,2009，7(10):938-940.”。

基于高级次轴对称偏振光束这种独特的聚焦特性，本发明建立了如图2(a)所示的全内反射荧光显微系统。

本发明的全内反射荧光显微系统是一种物镜型系统结构，工作原理为：激光器201发出的激光束首先经过一针孔滤波器202进行空间滤波，然后被准直透镜203准直为平行光束；该平行光束入射进一偏振转换系统204中进行偏振态转换，获得高级次轴对称偏振分布；获得的高级次轴对称偏振光束进一步通过光瞳滤波器205和环形光阑206进行振幅及相位调控，其中环形光阑的作用是阻挡低于全反射临界角的光束入射到油浸物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声。被调制的轴对称偏振光束被二向色分束镜207反射，经过光束偏转系统208和油浸物镜209聚焦到玻璃210与样品211界面上。

因为只有高于全反射临界角的光束发生聚焦，因此在玻璃-样品界面上因为全反射产生了倏逝场。该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，穿透深度在百纳米量级，因此倏逝场只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制。倏逝场激发的荧光信号经过二向色分束镜207和滤波片212后被一聚光镜213聚焦到一针孔阵列板214上，针孔阵列板后放置一光电探测器215，探测的信号进一步输送到计算机中进行后续分析处理。基于该探测针孔可实现一种共焦成像关系，即激发样品的聚焦光束的聚焦点与聚光镜聚焦荧光信号的聚焦点形成共轭成像关系，可进一步提高全内反射荧光显微系统成像的轴向分辨率和灵敏度。

在上述系统中，可利用多种方法将准直光束转换为高级次轴对称偏振光束，这里列举2种典型的方法：(a)基于4f系统和空间光调制器的自相干分解与合成生成方法，具体可参考Xilin Wang等人的文献“通过空间光调制器和公共光路干涉构造来生成任意矢量光束（Generation ofarbitrary vector beams with a spatial light modulator and a commonpath interferometric arrangement）.Opt.Lett.,32:3549,2007”。(2)基于空间偏振转换器的生成方法。设计一种由多个半波片组成的分块光学器件，使每个半波片沿着圆周方向的快轴呈一定规律变化，可将入射的线偏振光转换为振动方向空间变化的线偏振光，具体可参考中国发明专利申请CN201210562648.9——“偏振转换器、矢量光束生成系统及方法。上述两篇文献在此引入，并入本申请中。

另外，采用如图2(b)所示的差动共焦检测系统，则可以进一步提高系统轴向分辨率和灵敏度。关于差动共焦检测技术，可参考J B Tan等人的文献“基于差动共焦显微技术对光学聚焦检测进行理论分析和特性研究（Theoretical analysis and property study of optical focusdetection based on differential confocal microscopy），MeasurementScience and Technology,13(88):1289-1293,2002”。上述文献在此引入，并入本申请中。

进一步，为了实现样品的三维扫描，系统引入了如图2(c)和图2(d)所示的光束偏转系统，以调控聚焦光束的聚焦位置，从而控制玻璃-样品表面产生的倏逝场的区域，进而控制荧光分子的激发区域。

在图2(c)中，基于棱镜233的光束偏转功能，将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束，然后采用一对透镜231和232组成的望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏转角度以及光斑大小与两透镜的焦距比值有关。最终，使满足偏转方向和光斑大小的光束入射进油浸物镜。

与图2(c)不同，图2(d)所示的光束偏转系统使用一电控偏转器236进行光束偏转，如基于声光效应或磁光效应的光束偏转器，将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束，然后采用一对透镜234和235组成的望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束，

通常情况下，高级次轴对称偏振光束具有如下的光场复振幅分布，

${\stackrel{\→}{E}}_{\mathrm{in}}(r,\mathrm{\φ},z)=\mathrm{AP}\left(r\right)\left\{\cos \right[(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0]{\stackrel{\→}{e}}_r+\sin [(P-1)\mathrm{\φ}+{\mathrm{\φ}}_0\left]{\stackrel{\→}{e}}_{\mathrm{\φ}}\right\}---\left(2\right)$

其中，A是一常数，代表光场的平均振幅大小；P(r)为光束的光瞳函数，表征了光束的相对振幅及相位分布；P为光束的偏振级次；

分别为沿着径向和切向的单位矢量。

基于矢量衍射理论，可推导出高级次轴对称偏振光束在玻璃-样品界面产生的倏逝场分布为，

$\stackrel{\→}{E}(r_S,{\mathrm{\φ}}_S,z_S)=\left[\begin{array}{c}{E}_r^{\left(S\right)}\\ E_{\mathrm{\φ}}^{\left(S\right)}\\ E_z^{\left(S\right)}\end{array}\right]$

$=-i^{(3P+1)}A\underset{{\mathrm{\α}}_0}{\overset{\mathrm{\α}}{\∫}}P\left(\mathrm{\θ}\right)A\left(\mathrm{\θ}\right)T\left(\mathrm{\θ}\right)\sin \mathrm{\θexp}\left(\mathrm{ik}{z}_S\cos \mathrm{\θ}\right)$

$\×\left[\begin{array}{c}\cos [(P-1){\mathrm{\φ}}_S+{\mathrm{\φ}}_0]t_p\left(\mathrm{\θ}\right)\left\{\cos \mathrm{\θ}\right[J_P\left({\mathrm{kr}}_S\sin \mathrm{\θ}\right)-J_{P-2}\left({\mathrm{kr}}_S\sin \mathrm{\θ}\right)]+J_P\left({\mathrm{kr}}_S\sin \mathrm{\θ}\right)+J_{P-2}\left({\mathrm{kr}}_S\sin \mathrm{\θ}\right)\}\\ \sin [(P-1){\mathrm{\φ}}_S+{\mathrm{\φ}}_0]t_s\left(\mathrm{\θ}\right)\left\{\cos \mathrm{\θ}\right[J_P\left({\mathrm{kr}}_S\sin \mathrm{\θ}\right)+J_{P-2}\left({\mathrm{kr}}_s\sin \mathrm{\θ}\right)]+J_P\left({\mathrm{kr}}_S\sin \mathrm{\θ}\right)-J_{P-2}\left({\mathrm{kr}}_S\sin \mathrm{\θ}\right)\}\\ 2i\cos [(P-1){\mathrm{\φ}}_S+{\mathrm{\φ}}_0]t_p\left(\mathrm{\θ}\right)\sin \mathrm{\θ}{J}_{P-1}\left({\mathrm{kr}}_S\sin \mathrm{\θ}\right)\end{array}\right]\mathrm{d\θ}---\left(3\right)$

其中S(r_s,φ_s,z_s)是玻璃-样品界面附近某一观察点，E_r、E_φ和E_z是径向、切向及轴向三个正交分量的光场复振幅；A是一个常数，P(θ)是光束的光瞳函数，表征入射光束相对的振幅及相位分布；A(θ)为聚焦透镜的切趾函数，与透镜类型有关，例如当透镜满足正弦条件时，A(θ)=cos^1/2θ，当透镜满足赫姆霍斯条件时，A(θ)=cos^-3/2θ；T(θ)为光瞳滤波器的滤波函数。K是波数，θ称为光束会聚角，即某一光束波矢与光轴的夹角，因此最大的会聚角α与聚焦透镜数值孔径的关系为α=sin^-1(NA/n_g)，其中n_g是玻璃基底的折射率；α₀对应最低的光束会聚角，由图2(a)中的环形光阑决定，为满足全反射条件，要求α₀>sin^-1(n_sa/n_g)，其中n_sa为样品的折射率。J_m(·)为级数为m的第一类贝塞尔函数。t_s(θ)和t_p(θ)分别是s分量和p分量光束在玻璃-样品界面的透射系数，根据菲涅耳公式有，

$t_s\left(\mathrm{\θ}\right)=\frac{{2n}_g\cos \mathrm{\θ}}{n_g\cos \mathrm{\θ}+\sqrt{n_{\mathrm{sa}}^2-n_g^2{\cos }^2\mathrm{\θ}}}---\left(4a\right)$

$t_p\left(\mathrm{\θ}\right)=\frac{2n_g\cos \mathrm{\θ}}{n_{\mathrm{sa}}\cos \mathrm{\θ}+n_g\sqrt{1-n_g^2{\sin }^2\mathrm{\θ}/n_{\mathrm{sa}}^2}}---\left(4b\right)$

假设入射光束的光瞳函数为

$P\left(\mathrm{\θ}\right)=\exp [-{\mathrm{\β}}^2{\left(\frac{\sin \mathrm{\θ}}{\sin \mathrm{\α}}\right)}^2]{\left(\sqrt{2}\mathrm{\β}\frac{\sin \mathrm{\θ}}{\sin \mathrm{\α}}\right)}^P{L}_p^l\left(2{\mathrm{\β}}^2\frac{{\sin }^2\mathrm{\θ}}{{\sin }^2\mathrm{\α}}\right)---\left(5\right)$

其中，

表示径向系数为p、切向系数为l的勒让德多项式，β为透镜填充因子，这里假定β=1,p=0,φ₀=0,A=1，玻璃基底折射率为1.518，样品折射率为1.35。同时假设选用的聚光镜满足正弦条件，为一种高数值孔径油浸物镜，透镜的数值孔径为1.49，其中油的折射率为1.518。

图3(a)和图3(b)是生成高级次轴对称偏振光束的两种典型方法。图3(a)是一种基于4f系统和空间光调制器的自相干分解与合成生成方法，具体可参考文献“Xilin Wang,Jianping Ding,Weijiang Ni,ChengshanGuo,and Huitian Wang.Generation of arbitrary vector beams witha spatial light modulator and a common path interferometricarrangement.Opt.Lett.,32:3549,2007”，其中SLM为空间光调制器，P1为偏振片1，L1为傅里叶变换透镜1，L2为傅里叶变换透镜2，F为空间滤波器，G为Ronchi光栅。图3(b)是一种基于空间偏振转换器的生成方法。设计一种由多个半波片组成的分块光学器件，使每个半波片沿着圆周方向的快轴呈一定规律变化，可将入射的线偏振光转换为振动方向空间变化的线偏振光，具体可参考专利“周哲海,谭峭峰,顾华荣,祝连庆.偏振转换器、矢量光束生成系统及方法.2012.12，中国发明专利,CN201210562648.9”。

图4(a)－图4(d)给出了高级次轴对称偏振光束的偏振级次分别为4和10时界面附近倏逝场的强度分布。

由计算结果可知，在本发明中，在玻璃－样品界面上获得多个聚焦光斑，光斑数量与光束的偏振级次有关，为2×(P-1)个。同时，倏逝场在轴向以指数形式衰减，探测深度均在亚波长范围。这里，当偏振级次为4时，光斑横向半高全宽度为0.27λ，轴向半高全宽度为0.12λ；当偏振级次为10时，光斑横向半高全宽度为0.35λ，轴向半高全宽度为0.13λ。因此，聚焦光斑的尺寸在三个方向均突破了衍射极限，即实现了三维超分辨聚焦。随着偏振级次的增加，焦斑数量增加，但光斑半高全宽度有所增加。但当偏振级次小于5时，透镜数值孔径高于0.95时，光斑的半高全宽度仍处于亚波长量级。当用这些超分辨的聚焦光斑探测样品时，实现了并行检测的同时，提高了成像空间分辨率。

事实上，利用光瞳滤波器对高级次轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，还可以进一步减小聚焦光斑的尺寸，提高检测的空间分辨率。特别地，为了实现共焦显微成像，需要设计特定的针孔阵列板来匹配聚焦光斑，使每个聚焦光斑对应一个特定的针孔，实现多个样片品探测点与多个聚焦光斑的一一共轭成像关系。如图5所示，在一平板上沿着圆环方向均匀设置多个针孔，圆环的半径与聚焦光斑的圆环半径相同，针孔数量及大小根据聚焦光斑数量及尺寸确定。基于该探测针孔可实现一种共焦成像关系，即激发样品的聚焦光束的聚焦点与聚光镜聚焦荧光信号的聚焦点形成共轭成像关系，可进一步提高全内反射荧光显微系统成像的轴向分辨率和灵敏度。

以上已对本发明实施例进行描述。然而，本领域技术人员将理解，在不背离由权利要求所确定的本发明的真实范围和精神的情况下，可对这些实施例进行更改和变型。

Claims (8)

1.一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像装置，包括：

激光器，发出激光束；

针孔滤波器，对激光器发出的激光束进行空间滤波；

准直透镜，将经过空间滤波的激光束准直为平行光束；

偏振转换系统，对所述平行光束进行偏振态转换，获得高级次轴对称偏振光束；

光瞳滤波器和环形光阑，对获得的高级次轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，其中环形光阑的作用是阻挡低于全反射临界角的光束入射到聚焦物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声；

反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场，该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，因此只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制，

反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上，

光电探测器，布置于针孔阵列板后，以探测信号，

信号分析处理系统，对信号进行分析处理。

2.如权利要求1所述的全内反射荧光显微成像装置，其中，所述偏振转换系统包括：棱镜，将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；和一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏转角度以及光斑大小与两透镜的焦距比值有关，使满足偏转方向和光斑大小的光束入射进聚焦物镜。

3.如权利要求1所述的全内反射荧光显微成像装置，其中，所述光束偏转系统包括：电控偏转器，用于将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束。

4.如权利要求1所述的全内反射荧光显微成像装置，其中，高级次轴对称偏振光束的偏振级次小于5，并且聚焦系统透镜数值孔径高于0.95。

5.一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像方法，包括如下步骤：

激光器发出激光束；

针孔滤波器对激光器发出的激光束进行空间滤波；

准直透镜将经过空间滤波的激光束准直为平行光束；

偏振转换系统对所述平行光束进行偏振态转换，获得高级次轴对称偏振光束；

光瞳滤波器和环形光阑对获得的高级次轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，其中环形光阑用于阻挡低于全反射临界角的光束入射到聚焦物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声；

反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场，该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制；

反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上；

光电探测器，布置于针孔阵列板后，以探测信号；

信号分析处理系统，对信号进行分析处理。

6.如权利要求5所述的全内反射荧光显微成像方法，其中，所述偏振转换系统包括：棱镜，将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；和一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏转角度以及光斑大小与两透镜的焦距比值有关，使满足偏转方向和光斑大小的光束入射进聚焦物镜中。

7.如权利要求5所述的全内反射荧光显微成像方法，其中，所述光束偏转系统包括：电控偏转器，用于将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束。

8.如权利要求5所述的全内反射荧光显微成像方法，其中，高级次轴对称偏振光束的偏振级次小于5，并且聚焦系统透镜数值孔径高于0.95。

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