CN103364345A - 基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法，首先在数字微镜元件上建立环形图像扫描序列；激发光通过均匀、扩束处理后入射至数字微镜元件，然后经数字微镜元件反射并通过全内反射显微物镜照射至样品上；根据所述的环形图像扫描序列，完成对样品的环形扫描。本发明还公开了一种基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置，包括沿光路依次布置的激光光源、偏振转换器、耦合透镜组、方棒、照明透镜、数字微镜元件、成像透镜和全内反射显微物镜。本发明结构简单，扫描速度快，系统适用性强，可适用于激发光为任意波长的情况。

Description

基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法和装置

技术领域

本发明属于微观观测测量领域，具体涉及一种基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法和装置。

背景技术

显微镜泛指可以将微小不可见或难见物品的影像放大，使其能够被肉眼或其他成像仪器观察的工具。作为显微镜家族中最早出现也是最为庞大的一支，光学显微镜通常由几个透镜或透镜组加上必要的机械结构组合而成，对于生物、医学、材料等领域的发展具有十分重要的推动作用。随着科学技术的进步，光学显微镜日趋专门化，出现了针对某些特殊应用领域的专门显微镜产品和技术。在这些产品之中，全内反射荧光显微镜（totalinternal reflection fluorescent microscope，TIRFM）由于具有极低的背景光噪声而被广泛应用于细胞表面物质的动态观察。其基本原理是利用光线全反射后在介质另一面产生倏逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标记样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。因此，全内反射荧光显微镜具有很好的切片观察效果。

然而，荧光分子具有很强的分子极性，因此，其荧光受激发射响应表现出很强的偏振和方向选择性。这种特异选择性对于入射激发光提出了较高的要求，如处理不当，很容易造成观察图像的失真。在全内反射荧光显微镜中，为了克服上述问题，通常要求从全内反射显微物镜出射的激发光能够以观察区域为中心绕系统光轴旋转，从而实现全角度的全反射照明，进而避免图像失真。常规的作法是使用一个二维振镜组配合一个大口径透镜将入射激发光聚焦在全内反射显微镜物的后焦面上并使其绕光轴环状扫描，进而达到全角度的全反射照明的目的。这种作法对于二维振镜组的控制电路要求极高，不仅要求其具有很高的同频和响应速度，同时其输出波形也非常复杂。因此，全内反射荧光显微镜中扫描模块往往设计复杂。即便如此，现有的扫描模块仍具有功能单一、通用性不足等技术缺陷。

发明内容

为了克服现有技术的不足，同时降低制造成本，本发明提供了一种基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法和装置。

一种基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法，包括以下几个步骤：

1）在数字微镜元件上建立环形图像扫描序列，所述的环形图像扫描序列为依次显示在数字微镜元件上的图像，且所有图像围成一个环形；

2）激发光通过均匀、扩束处理后入射至数字微镜元件，然后经数字微镜元件上的图像显示区域反射并通过全内反射显微物镜照射至样品上；

3）根据所述的环形图像扫描序列，完成对样品的环形扫描。

在步骤1）中，首先根据全内反射荧光显微镜的扫描速度、成像面深度和系统所用激发光的波长参数，在数字微镜元件上生成环形图像扫描序列。环形扫描图形序列，是指一系列依次显示的图像，每一帧图像显示形状完全相同，对应于一个圆环区域上对应于圆环圆心张角相同的片断，在位置上沿角向依次排布，将所有图像叠加上能够形成一个完整的圆环，圆环半径由成像面深度和系统所用激发光的波长参数决定，图形序列刷新频率由系统扫描速度决定。

在所述的步骤2）中，所述的激发光为单色圆偏振光，其波长和输入功率由标记样品的荧光染料的性质决定。

所述的数字微镜元件，其图像分辨率应至少为1024像素×768像素，图像刷新率应至少达到10000帧/秒，优选为德州仪器(TI)的

4100。

在步骤2）中，入射至数字微镜元件的光束与所述数字微镜元件反射的光束的光轴夹角为24度。数字微镜元件上的反射镜倾斜角度为10～12°，在反射镜倾斜12°时，入射光与反射光的光轴夹角为24度。

本发明的工作原理是：

为了实现全内反射荧光显微镜中激发光的环形扫描，需要将激发光聚焦在全内反射显微物镜的后焦面上并使其在后焦面上匀角速度做环形移动才可以实现。为了达到上述效果，可以利用成像透镜使数字微镜元件与全内反射显微物镜后焦面呈光学共轭位置，并控制数字微镜元件所显示的图形信息。当数字微镜元件所显示的图形信息与预期的环形扫描光斑移动轨迹完全重合时，即可以通过该模块实现预期的环形扫描功能。理论上，在后焦面上光斑的环形运动轨迹半径应于全内反射显微物镜的入瞳半径相等。但是，由于在实际系统中全内反射显微物镜不可避免存在色差，因此，为了使得不同波长（颜色）的激发光在样品表面上满足齐焦条件，需要对于环形运动轨迹半径进行微调。因满足成像关系，这种微调可以通过调整数字微镜元件上所显示环形扫描图形序列图像的半径来实现。当激发光波长（颜色）不变时，通过相同的微调处理，则可以改变出射激发光的全反射角，从而实现对于样品的纵向扫描。

一种基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置，包括沿光路依次布置的激光光源、偏振转换器、耦合透镜组、方棒、照明透镜、数字微镜元件、成像透镜和全内反射显微物镜。

所有光学元件，包括光源、透镜（组）、方棒、数字微镜元件和显微物镜均处于同轴光路上。其中，激光光源出射端与方棒入射端通过耦合透镜组处于共轭位置；方棒出射端与数字微镜元件通过照明透镜处于共轭位置；数字微镜元件与全内反射显微物镜后焦面通过成像透镜处于共轭位置。

激光光源的其波长和输出功率由标记样品的荧光染料的性质决定。

所述的偏振转换器用于调制激发光偏转状态，将激发光调制成圆偏振光，它有多种现有技术可供选择，如玻片组、液晶光阀等，优选为二分之一玻片和四分之一玻片组成的玻片组。

耦合透镜组用于将调制后的激发光耦合进方棒。

方棒用于对激发光均匀化，其既可以是实心方棒也可以是空心方棒，优选为空心方棒，且方棒的长度应不小于5cm。

照明透镜用于对均匀后的激发光进行扩束，然后入射至数字微镜元件。

所述的数字微镜元件用于显示环形扫描图形序列，其图像分辨率应至少为1024像素×768像素，图像刷新率应至少达到10000帧/秒，优选为德州仪器(TI)的

4100。

其中，所述的成像透镜，其放大倍率等于全内反射显微物镜入瞳半径除以环形扫描图形序列显示环形图像的半径。

本发明具有以下有益的技术效果：

（1）结构简单；

（2）扫描速度快；

（3）系统适用性强，可适用于激发光为任意波长的情况；

（4）设计灵活，具有多种功能。

附图说明

图1为本发明的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置的系统原理图；

图2为本发明环形扫描图形序列的示意图；

图3为本明通过改变扫描轨迹半径实现纵向扫描的原理图。

图中，激光光源1，偏振转换器2，耦合透镜组3，方棒4，照明透镜5，数字微镜元件6，成像透镜7，全内反射显微物镜8，样品9。

具体实施方式

下面对照附图对本发明内容进行具体说明，但本发明并不仅限于此。

图1为本发明的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置的系统原理图，包括：

激光光源1，偏振转换器2，耦合透镜组3，方棒4，照明透镜5，数字微镜元件6，成像透镜7，全内反射显微物镜8。所有光学元件均处于同轴光路上。

从激光光源1出射的激发光，通过偏振转换器2转换为圆偏振光。其中，激光光源1的波长和输出功率由标记样品9的荧光染料的性质决定。偏振转换器2有多种现有技术可供选择，如如玻片组、液晶光阀等，优选为二分之一玻片和四分之一玻片组成的玻片组，在降低成本的同时提高偏振转换效率。

通过偏振转换器2的激发光，将进一步通过耦合透镜组3耦合进方棒4内。在光学上，激光光源1出射端与方棒4入射端通过耦合透镜组3处于共轭位置，以保证耦合效率。方棒4既可以是实心方棒也可以是空心方棒，优选为空心方棒。方棒4主要通过激发光在其内部传导时的多次反射制造多个子光源，以达到均匀光强分布的目的。为保证出射光线的均匀性，方棒4的长度不应短于5cm。

在激发光从方棒4出射端出射后，将进一步通过照明透镜5后，照射在数字微镜元件6上。方棒4出射端与数字微镜元件6通过照明透镜5处于共轭位置，以保证照明效率。通过数字微镜元件6反射后，激发光将依次通过成像透镜7，全内反射显微物镜8，最终达到样品9。为保证系统匹配效率，经过数字微镜元件6后，系统光轴将折转24°。

数字微镜元件6与全内反射显微物镜8后焦面通过成像透镜7处于共轭位置。这样，在数字微镜元件6上所显示的图像，将被成像透镜7成像至全内反射显微物镜8后焦面上。二者显示的图像除由成像透镜7造成的放大（缩小）倍率M外，将完全相同。为了实现环形扫描，需要激发光光斑在全内反射显微物镜8后焦面一个环形路径上做匀速环形运动，由此运动轨迹进行反算即可以得到数字微镜元件6需要显示的环形扫描图形序列。所述的环形扫描图形序列，是指一系列依次显示的图像，每一帧图像显示形状完全相同，对应于一个圆环区域上对应于圆环圆心张角相同的片断，在位置上沿角向依次排布，将所有图像叠加上能够形成一个完整的圆环，圆环半径由成像面深度和系统所用激发光的波长参数决定，图形序列刷新频率由系统扫描速度决定，如图2所示。在标准情况下，当激发光波长与全内反射显微物镜8的工作中心波长相等且全内反射显微物镜8工作在最大角度时，数字微镜元件6需要显示的环形扫描图形序列的半径由公式r＝R/M，其中R为全内反射显微物镜8入瞳半径。图形序列刷新频率与系统扫描速度要求相等。

当工作在非标准情况下时，激发光波长与全内反射显微物镜8的工作中心波长不相等，此时因为色差的存在，全内反射显微物镜8实际焦点与理想焦点存在轴向差异。为了补偿这种差异，只需要根据实际情况将环形扫描图形序列的半径略微调大或调小即可。一般而言，调大半径可以增大出射角度，从而使得实际焦点向全内反射显微物镜8靠近；而调小半径则可以使实际焦点与全内反射显微物镜8远离。因此，利用相同的原理和调整方法，也可以实现系统的轴向扫描，如图3所示。

除上述过程外，还可以通过改变数字微镜元件6所显示图像来更为灵活地改变系统的扫描方式和照明方式。如可以通过在数字微镜元件6上显示环形图像来实现全角度照明，或是通过显示其它图像来实现更为复杂的结构光照明或扫描方式等等。

Claims (10)

1.一种基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1）在数字微镜元件上建立环形图像扫描序列，所述的环形图像扫描序列为依次显示在数字微镜元件上的图像，且所有图像围成一个环形；

2）激发光通过均匀、扩束处理后入射至数字微镜元件，然后经数字微镜元件上的图像显示区域反射并通过全内反射显微物镜照射至样品上；

3）根据所述的环形图像扫描序列，完成对样品的环形扫描。

2.如权利要求1所述的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法，其特征在于，在所述的步骤2）中，所述的激发光为单色圆偏振光。

3.如权利要求1所述的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法，其特征在于，所述的数字微镜元件，其图像分辨率应至少为1024像素×768像素，图像刷新率应至少达到10000帧/秒。

4.如权利要求3所述的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法，其特征在于，在步骤2）中，入射至数字微镜元件的光束与所述数字微镜元件反射的光束的光轴夹角为24度。

5.一种基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置，其特征在于，包括沿光路依次布置的激光光源、偏振转换器、耦合透镜组、方棒、照明透镜、数字微镜元件、成像透镜和全内反射显微物镜。

6.如权利要求5所述的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置，其特征在于，所述的偏振转换器为玻片组或液晶光阀。

7.如权利要求6所述的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置，其特征在于，所述的偏振转换器为由二分之一玻片和四分之一玻片组成的玻片组。

8.如权利要求5所述的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置，其特征在于，所述的方棒为实心方棒或空心方棒，且方棒的长度应不小于5cm。

9.如权利要求8所述的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置，其特征在于，所述的数字微镜元件，其图像分辨率应至少为1024像素×768像素，图像刷新率应至少达到10000帧/秒。

10.如权利要求5所述的基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描装置，其特征在于，所述的成像透镜的放大倍率等于全内反射显微物镜入瞳半径除以环形扫描的半径。

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