CN108761755A - 一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法，其中，第一纳秒脉冲激发光光源所述系统包括第一纳秒脉冲激发光光源、均匀空间光束调制部件、第二纳秒脉冲消激发光光源、网格状空间光束调制部件、二向色镜组件、显微镜镜体、微纳米平移台、镜头组件、图像采集相机、同步器以及计算机。本申请提供的受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法，能够在提高稳定性和成像速度的同时，减少系统的成本。

Description

一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法

技术领域

本发明涉及受激辐射损耗显微镜领域，特别涉及一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法。

背景技术

受激发射损耗(STED,stimulated emission depletion)显微镜是一种新型的基于荧光的光学显微技术，可以在远场的情况下突破衍射极限的限制，进行高分辨率的测量。该技术旨在利用一束激光作为激发光(excitation beam)令荧光分子产生荧光。随后，通过使用另外一束激光作为消激发光(depletion beam)，将激发光产生的荧光光斑的周围荧光抑制，只让荧光光斑的中心区域发光，从而实现突破衍射极限尺寸的荧光光斑，进而实现超分辨成像。

目前，为实现基于相机的快速超分辨成像，人们希望借鉴相机成像原理，通过光束调制，将激发光调制成均匀的面光源，将消激发光调制成均匀的网格状光斑，再将两束激光进行空间同轴和时间同步，从而实现点阵状的超越衍射极限的光斑分布，也叫点阵式STED光斑。随后，通过使用高灵敏度相机，对点阵式STED光斑所成的荧光图像进行拍摄和采样，从而得到二维STED超分辨图像。

现有STED技术中，实现快速成像的方法主要是两种：一种是基于快速扫描振镜系统的成像技术，另一种就是基于点阵成像结合相机实现。

基于快速扫描振镜系统的成像技术最早被应用于共聚焦成像，随后被应用于STED成像。该技术具有结构简单，成像速度较快的特点。但由于其单点成像的特点，一幅图的起始图像点和最终图像点之间存在明显的时间差，因此难以被应用于需要有较高时间分辨率或者时间变化较快的图像样本的采样中。

而基于点阵成像的STED成像技术，目前主要是基于皮秒激光器结合 EMCCD相机来实现的。在该系统中，皮秒脉冲激光器的激发光和消激发光通过精确同步，且消激发光的脉冲宽度大于激发光的脉冲宽度，确保多余的荧光被消除。然后，通过EMCCD相机的曝光，来采集STED的点阵列图像。在该技术中，由于EMCCD的曝光时间较长，消激发光的照射时间也较长，由于消激发光一般功率很大，因此该系统对生物样本的光毒性较大，不适用于活体生物成像或长时间生物成像。且皮秒脉冲宽度对激发光和消激发光的时间同步要求很高，对控制精度和系统稳定性都提出了很高的要求，导致系统实际稳定性降低，成本增高。

发明内容

本申请的目的在于提供一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法，能够在提高稳定性的同时，减少系统的成本。

为实现上述目的，本申请提供一种受激辐射损耗显微镜系统，所述系统包括第一纳秒脉冲激发光光源、均匀空间光束调制部件、第二纳秒脉冲消激发光光源、网格状空间光束调制部件、二向色镜组件、显微镜镜体、微纳米平移台、镜头组件、图像采集相机、同步器以及计算机，其中：

所述第一纳秒脉冲激发光光源发出的激发光，经所述均匀空间光束调制部件产生均匀宽场的激发光光束；所述第二纳秒脉冲消激发光光源发出的消激发光，经所述网格状空间光束调制部件生成网格状均匀的消激发光光束；所述激发光和所述消激发光通过所述二向色镜组件进行合束，形成平行且同轴的两束激光；所述两束激光被导入基于倒置荧光显微镜开发的所述显微镜镜体内，并对样本进行照射并产生点阵状分布的荧光光斑，其中，通过所述微纳米平移台来对照射点进行控制；所述显微镜镜体导出的荧光信号经过所述镜头组件由所述图像采集相机收集，其中，所述图像采集相机的曝光过程和时间由所述同步器控制，并与所述激发光和所述消激发光进行同步；所述图像采集相机产生的图像被输出到所述计算机进行处理。

进一步地，所述第一纳秒脉冲激发光光源的工作波长必须比所述第二纳秒脉冲消激发光光源的工作波长短。

进一步地，所述图像采集相机包括ICCD相机或者条纹相机或者SCMOS 相机或者CMOS相机。

为实现上述目的，本申请还提供一种控制方法，所述方法包括：

同步器在第一时刻开启第一纳秒脉冲激发光光源，并使得所述第一纳秒脉冲激发光光源发射第一脉冲宽度的激光；所述第一脉冲宽度的激光经过均匀空间光束调制部件后生成均匀激发光束；

所述同步器在第二时刻控制第二纳秒脉冲消激发光光源发出第二脉冲宽度的激光，所述第二脉冲宽度的激光经过网格状空间光束调制部件后形成网格状消激发光；

所述均匀激发光束和所述网格状消激发光经过二向色镜组件后形成平行且同轴的两束激光；

所述两束激光通过入射光孔进入显微镜镜体，并通过所述显微镜镜体的内部光路后经显微物镜照射至样本上；在所述第二脉冲宽度的时长内，形成受激辐射损耗图像；

所述受激辐射损耗图像通过所述显微镜镜体的相机接口传出，并通过镜头组件后在第三时刻由图像采集相机在指定曝光时长内进行曝光接收；其中，当所述指定曝光时长结束后，所述图像采集相机停止曝光，并将曝光接收到的图像存储至计算机或者内部存储器中。

进一步地，在同步器在第一时刻开启第一纳秒脉冲激发光光源之前，所述方法还包括：

计算机向微纳米平移台发送控制信号，以使得所述微纳米平移台移动至采样位置；

所述计算机生成触发信号，并将所述触发信号发送至同步器，以使得在当前的采样位置进行采样工作。

进一步地，所述图像采集相机停止曝光之后，所述方法还包括：

所述计算机控制所述微纳米平移台在指定迁移时长内移动至下一个探测位置处，在所述指定迁移时长内，所述图像采集相机将曝光接收到的图像存储至计算机或者内部存储器中。

进一步地，在所述微纳米平移台移动至所述下一个探测位置处之后，所述方法还包括：

重新拍摄所述下一个探测位置处的受激辐射损耗图像，并在拍摄完成之后，将新的受激辐射损耗图像存储至所述计算机或者所述图像采集相机的存储器中；

当各个位置处的受激辐射损耗图像均拍摄完成之后，通过所述计算机对各个受激辐射损耗图像进行合成和重构，以生成完整的受激辐射损耗图像。

进一步地，所述第一纳秒脉冲激发光光源和所述第二纳秒脉冲消激发光光源发出的两束激光之间的重合时间大于所述指定曝光时长的指定倍数，其中，所述指定倍数为大于或者等于1。

进一步地，所述第一脉冲宽度大于所述第二脉冲宽度，并且所述第二脉冲宽度大于所述指定曝光时长的所述指定倍数。

进一步地，所述方法还包括：

min{Δt_exc-(t₂-t₁)，Δt_dep}≥NΔt_camera

其中，t₁表示所述第一时刻，t₂表示所述第二时刻，Δt_exc表示所述第一脉冲宽度，Δt_dep表示所述第二脉冲宽度，N表示所述指定倍数，Δt_camera表示所述指定曝光时长。

由上可见，为解决快速成像与光毒性的问题，本申请提出用纳秒脉冲激光作为激发光和消激发光，结合ICCD相机(或者条纹相机或者SCMOS相机或者CMOS相机)，实现点阵STED成像的技术方法。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、成像曝光时间快，仅需要10-100纳秒即可成像；

2、单个激光脉冲照射，光毒性弱；

3、较之于皮秒脉冲激光STED系统，纳秒脉冲激光STED系统的控制精度要求较低，系统稳定性更好，成本更低。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明实施例中受激辐射损耗显微镜系统的结构示意图；

图2为本发明实施例中受激辐射损耗显微镜系统的控制方法流程图；

图3为本发明实施例中的第一时序图；

图4为本发明实施例中的第二时序图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

请参阅图1，本申请提供一种受激辐射损耗显微镜系统，所述系统包括第一纳秒脉冲激发光光源1、均匀空间光束调制部件3、第二纳秒脉冲消激发光光源2、网格状空间光束调制部件4、二向色镜组件5、显微镜镜体6、微纳米平移台7、镜头组件8、图像采集相机9、同步器11以及计算机10，其中：

所述第一纳秒脉冲激发光光源1发出的激发光，经所述均匀空间光束调制部件3产生均匀宽场的激发光；所述第二纳秒脉冲消激发光光源2发出的消激发光，经所述网格状空间光束调制部件4生成网格状均匀的消激发光；所述激发光和所述消激发光通过所述二向色镜组件5进行合束，形成平行且同轴的两束激光；所述两束激光被导入基于倒置荧光显微镜开发的所述显微镜镜体6内，并对样本进行照射并产生点阵状分布的荧光光斑，其中，通过所述微纳米平移台7来对照射点进行控制；所述显微镜镜体6导出的荧光信号经过所述镜头组件8由所述图像采集相机9收集，其中，所述图像采集相机9的曝光过程和时间由所述同步器11控制，并与所述激发光和所述消激发光进行同步；所述图像采集相机9产生的图像被输出到所述计算机10进行处理。

在本实施方式中，所述第一纳秒脉冲激发光光源的工作波长必须比所述第二纳秒脉冲消激发光光源的工作波长短。

在本实施方式中，所述图像采集相机包括ICCD相机或者条纹相机或者 SCMOS相机或者CMOS相机。

请参阅图2，本本申请还提供一种受激辐射损耗显微镜系统的控制方法，所述方法包括：

S1：同步器在第一时刻开启第一纳秒脉冲激发光光源，并使得所述第一纳秒脉冲激发光光源发射第一脉冲宽度的激光；所述第一脉冲宽度的激光经过均匀空间光束调制部件后生成均匀激发光束；

S2：所述同步器在第二时刻控制第二纳秒脉冲消激发光光源发出第二脉冲宽度的激光，所述第二脉冲宽度的激光经过网格状空间光束调制部件后形成网格状消激发光；

S3：所述均匀激发光束和所述网格状消激发光经过二向色镜组件后形成平行且同轴的两束激光；

S4：所述两束激光通过入射光孔进入显微镜镜体，并通过所述显微镜镜体的内部光路后经显微物镜照射至样本上；在所述第二脉冲宽度的时长内，形成受激辐射损耗图像；

S5：所述受激辐射损耗图像通过所述显微镜镜体的相机接口传出，并通过镜头组件后在第三时刻由图像采集相机在指定曝光时长内进行曝光接收；其中，当所述指定曝光时长结束后，所述图像采集相机停止曝光，并将曝光接收到的图像存储至计算机或者内部存储器中。

在本实施方式中，在同步器在第一时刻开启第一纳秒脉冲激发光光源之前，所述方法还包括：

计算机向微纳米平移台发送控制信号，以使得所述微纳米平移台移动至采样位置；

所述计算机生成触发信号，并将所述触发信号发送至同步器，以使得在当前的采样位置进行采样工作。

在本实施方式中，所述图像采集相机停止曝光之后，所述方法还包括：

所述计算机控制所述微纳米平移台在指定迁移时长内移动至下一个探测位置处，在所述指定迁移时长内，所述图像采集相机将曝光接收到的图像存储至计算机或者内部存储器中。

在本实施方式中，在所述微纳米平移台移动至所述下一个探测位置处之后，所述方法还包括：

重新拍摄所述下一个探测位置处的受激辐射损耗图像，并在拍摄完成之后，将新的受激辐射损耗图像存储至所述计算机或者所述图像采集相机的存储器中；

当各个位置处的受激辐射损耗图像均拍摄完成之后，通过所述计算机对各个受激辐射损耗图像进行合成和重构，以生成完整的受激辐射损耗图像。

在本实施方式中，所述第一纳秒脉冲激发光光源和所述第二纳秒脉冲消激发光光源发出的两束激光之间的重合时间大于所述指定曝光时长的指定倍数，其中，所述指定倍数为大于或者等于1。

在本实施方式中，所述第一脉冲宽度大于所述第二脉冲宽度，并且所述第二脉冲宽度大于所述指定曝光时长的所述指定倍数；

在本实施方式中，所述方法还包括：

min{Δt_exc-(t₂-t₁)，Δt_dep}≥NΔt_camera

亦即，Δt_exc-(t₂-t₁)和Δt_dep中较小的那个必须大于或等于所述指定曝光时长的所述指定倍数。这里，t₁表示所述第一时刻，t₂表示所述第二时刻，Δt_exc表示所述第一脉冲宽度，Δt_dep表示所述第二脉冲宽度，N表示所述指定倍数，Δt_camera表示所述指定曝光时长。

在一个具体的应用场景中，可以有多种不同的实现方案：

方案一

由于基于不同的应用，超分辨显微镜系统所使用的激发光、消激发光、荧光剂等可以有很大不同，相机的参数亦有所区别，因而以405nm亚微秒脉冲激发光、532nm纳秒脉冲消激发光、Coumarin 102荧光剂和Andor iStar 312T系列ICCD相机为例，介绍此发明所陈述内容的具体实施方式。

系统主要由光学系统和控制系统两部分构成。

光学系统由405nm亚微秒脉冲激光器、532nm纳秒脉冲激光器、均匀空间光束调制组件、网格状空间光束调制组件、二向色镜、Olympus IX-70倒置荧光显微镜系统、镜头组件和Andor iStar 312T系列ICCD相机构成。

控制系统由计算机、控制板、微纳米平台控制器(三部分统称为计算机和控制系统)、高速同步器及微纳米平移台系统等构成。由于Andor iStar 312T系列ICCD相机内部集成了一个同步器，因而无需额外的同步器。微纳米平台可以选择集成在Olympus IX-70显微镜上。

具体工作流程为：

计算机和控制系统发送信号给微纳米平移台，移动到待采样位置。

计算机和控制系统生成触发信号，发送给同步器，开始在当前位置的采样工作。

同步器首先在t₁时刻打开405nm亚微秒脉冲激光器(简称405光)并发射激光，持续Δt₄₀₅(即脉冲宽度)，如图3所示。405光经过均匀空间光调制组件，生成直径与显微物镜光圈相匹配的均匀激发光束。

随后，在t₂时刻，同步器控制532nm脉冲消激发光(简称532光)发射，脉冲宽度为Δt₅₃₂，如图3所示。532光经过网格状空间光调制组件，生成直径与显微物镜光圈相匹配的网格状消激发光，例如101乘101网格。

405光的均匀光束和532光的网格光束通过二向色镜进行合束，并精确校准同轴。

合束后的光束通过Olympus IX-70显微镜的入射光孔，进入到显微镜，并通过显微镜内部光路，最后经显微物镜照射到样本上。

在Δt₅₃₂时间内，形成受激辐射损耗图像。

受激辐射损耗图像经倒置荧光显微镜的相机接口传出，通过一系列镜头组件进行放大或缩小，最后在t₃时刻控制ICCD相机进行曝光接收，曝光时间为Δt_camera。

经过曝光时间Δt_camera后，结束ICCD相机曝光。

在t₂+Δt₅₃₂时刻，532光脉冲结束。

在t₁+Δt₄₀₅时刻，405光脉冲结束。

随后，计算机和控制系统控制微纳米平移台移动到下一个探测位置，耗时Δt_trans。在这个过程中，ICCD相机将图像或者存储到计算机上，或者存储到ICCD 内部存储器上。

若需要像素数量较大的图像，可以在t₁+Δt₄₀₅+Δt_trans时刻，重复上述步骤，拍摄新位置上的受激辐射损耗图像。

在所有要求的位置上的受激辐射损耗图像都拍完以后，通过计算机和控制系统，对受激辐射损耗图像进行合成和重构，最后生成完整的大范围的高分辨率的受激辐射损耗图像。

方案二

方案二与方案一的工作原理和控制时序基本相同。不同的是，在方案二中，用亚微秒量级405nm脉冲激光作为激发光，亚微秒量级532nm脉冲激光作为消激发光，并用SCMOS相机，取代方案一中的亚微秒量级405nm脉冲激光、纳秒量级532nm脉冲激光和ICCD相机。

相较于方案一，方案二的时间和空间分辨率均较低，而系统价格更低、可靠性更高，有更高的性价比。

方案三

方案三与方案一的工作原理基本相同。不同的是，在方案三中，不限定激发光脉冲和消激发光脉冲的时间量级，仅要求两束脉冲之间的重合时间大于相机曝光时间的N倍，这里，N≥5。

当控制时序按照图3进行时，我们要求Δt₄₀₅>Δt₅₃₂>NΔt_camera且 t₃-t₂≈(N-1)Δt_camera/2。

当控制时序按照图4进行时，要求Δt₄₀₅-(t₂-t₁)>NΔt_camera且 t₃-t₂≈(N-1)Δt_camera/2。在图4时序中，405光和532光可对调。

相较于方案一，方案三的同步精度要求不高，可适用于匹配低曝光速度相机，配置更为灵活多样。

由上可见，为解决快速成像与光毒性的问题，本申请提出用纳秒脉冲激光作为激发光和消激发光，结合ICCD相机(或者条纹相机或者SCMOS相机或者CMOS相机)，实现点阵STED成像的技术方法。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、成像曝光时间快，仅需要10-100纳秒即可成像；

2、单个激光脉冲照射，光毒性弱；

3、较之于皮秒脉冲激光STED系统，纳秒脉冲激光STED系统的控制精度要求较低，系统稳定性更好，成本更低。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种受激辐射损耗显微镜系统，其特征在于，所述系统包括第一纳秒脉冲激发光光源、均匀空间光束调制部件、第二纳秒脉冲消激发光光源、网格状空间光束调制部件、二向色镜组件、显微镜镜体、微纳米平移台、镜头组件、图像采集相机、同步器以及计算机，其中：

所述第一纳秒脉冲激发光光源发出的激发光，经所述均匀空间光束调制部件产生均匀宽场的激发光光束；所述第二纳秒脉冲消激发光光源发出的消激发光，经所述网格状空间光束调制部件生成网格状均匀的消激发光光束；所述激发光和所述消激发光通过所述二向色镜组件进行合束，形成平行且同轴的两束激光；所述两束激光被导入基于倒置荧光显微镜开发的所述显微镜镜体内，并对样本进行照射并产生点阵状分布的荧光光斑，其中，通过所述微纳米平移台来对照射点进行控制；所述显微镜镜体导出的荧光信号经过所述镜头组件由所述图像采集相机收集，其中，所述图像采集相机的曝光过程和时间由所述同步器控制，并与所述激发光和所述消激发光进行同步；所述图像采集相机产生的图像被输出到所述计算机进行处理。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一纳秒脉冲激发光光源的工作波长比所述第二纳秒脉冲消激发光光源的工作波长短。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述图像采集相机包括ICCD相机或者条纹相机或者SCMOS相机或者CMOS相机中的至少一种。

4.一种应用于如权利要求1至3中任一所述的受激辐射损耗显微镜系统的控制方法，其特征在于，所述方法包括：

同步器在第一时刻开启第一纳秒脉冲激发光光源，并使得所述第一纳秒脉冲激发光光源发射第一脉冲宽度的激光；所述第一脉冲宽度的激光经过均匀空间光束调制部件后生成均匀激发光束；

所述同步器在第二时刻控制第二纳秒脉冲消激发光光源发出第二脉冲宽度的激光，所述第二脉冲宽度的激光经过网格状空间光束调制部件后形成网格状消激发光；

所述均匀激发光束和所述网格状消激发光经过二向色镜组件后形成平行且同轴的两束激光；

所述两束激光通过入射光口进入显微镜镜体，并通过所述显微镜镜体的内部光路后经显微物镜照射至样本上；在所述第二脉冲宽度的时长内，形成受激辐射损耗图像；

所述受激辐射损耗图像通过所述显微镜镜体的相机接口传出，并通过镜头组件后在第三时刻由图像采集相机在指定曝光时长内进行曝光接收；其中，当所述指定曝光时长结束后，所述图像采集相机停止曝光，并将曝光接收到的图像存储至计算机或者内部存储器中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在同步器在第一时刻开启第一纳秒脉冲激发光光源之前，所述方法还包括：

计算机向微纳米平移台发送控制信号，以使得所述微纳米平移台移动至采样位置；

所述计算机生成触发信号，并将所述触发信号发送至同步器，以使得在当前的采样位置进行采样工作。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述图像采集相机停止曝光之后，所述方法还包括：

所述计算机控制所述微纳米平移台在指定迁移时长内移动至下一个探测位置处，在所述指定迁移时长内，所述图像采集相机将曝光接收到的图像存储至计算机或者内部存储器中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述微纳米平移台移动至所述下一个探测位置处之后，所述方法还包括：

重新拍摄所述下一个探测位置处的受激辐射损耗图像，并在拍摄完成之后，将新的受激辐射损耗图像存储至所述计算机或者所述图像采集相机的存储器中；

当各个位置处的受激辐射损耗图像均拍摄完成之后，通过所述计算机对各个受激辐射损耗图像进行合成和重构，以生成完整的受激辐射损耗图像。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一纳秒脉冲激发光光源和所述第二纳秒脉冲消激发光光源发出的两束激光之间的重合时间大于所述指定曝光时长的指定倍数，其中，所述指定倍数大于或者等于1。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一脉冲宽度大于所述第二脉冲宽度，并且所述第二脉冲宽度大于所述指定曝光时长的所述指定倍数。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

min{Δt_exc-(t₂-t₁),Δt_dep}≥NΔt_camera

其中，t₁表示所述第一时刻，t₂表示所述第二时刻，Δt_exc表示所述第一脉冲宽度，Δt_dep表示所述第二脉冲宽度，N表示所述指定倍数，Δt_camera表示所述指定曝光时长。