CN109313328A - 超分辨率显微术 - Google Patents

Abstract

本文描述被配置用于相对高的通量的示例超分辨率显微系统。所公开的显微系统可以产生用于成像的子衍射激活区域的阵列。显微系统可以利用采用时间延迟积分的成像技术来随时间构建超分辨率图像。所公开的显微系统可以利用长寿命荧光团结合宽场和图案化的照射来以相对高通量产生样品的超分辨率图像。

Description

超分辨率显微术

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年6月21日提交的第62/352,892号的美国临时专利申请的优先权权益，其全部内容由此通过引用明确并入。

背景

相关技术的描述

光学显微术是用于以亚微米分辨率研究样品的有力工具。例如，在生物学和医学中，适当的分子标签(诸如荧光和免疫荧光标签)用于标记单独的分子。然后通过光学显微镜检测来自标签的独特信号以识别它们在细胞或组织中和细胞或组织周围的或者在微阵列上的存在和位置。然而，光学显微术可以限于仅能够成像尺寸为几百纳米的特征。低于该尺寸，细胞或组织中的特征尺寸变得与光的物理波长相当或比其更小。当发生这种情况时，由于光通过小孔径或聚焦到微小点时它的衍射，细胞、组织或微阵列特征不能被分辨。这种无法分辨小特征的无能称为衍射极限。在一个示例中如由恩斯特阿贝(Ernst Abbe)定义的衍射极限是两个点源对象必须被分离以能够将对象彼此区分的距离。阿贝衍射极限等于0.5λ/NA，其中λ是光的波长，NA是收集光的物镜的数值孔径。

已经开发了几种光学显微技术以超过衍射极限。这些技术统称为超分辨率显微术。一些超分辨率显微技术涉及将可能无法分辨的光的较高空间频率移动到可以分辨的较低空间频率。某些超分辨率显微技术可以使用可被激活和去激活的荧光探针产生具有超过衍射极限的分辨率的图像。通过选择性地或随机地激活靶向探针并检测它们的荧光，这些超分辨率技术可被配置以区分位于衍射限制范围内的两个分子的发射。一般而言，这些超分辨率显微方法涉及在明亮和暗态之间切换荧光团，结合空间照射方案来隔离子衍射区域中的切换行为。

概述

本文提供的包括与光学显微系统有关的示例。

本文描述的实施例具有创新方面，其中没有一个是必不可少的或仅对其期望的属性负责。在不限制本公开和/或权利要求的范围的情况下，现在将概述一些有利特征。

在第一方面，提供超分辨率显微系统。该系统包括激发光源、损耗光源(depletionlight source)和光学路径。在一些实施例中，该系统包括产生区域阵列的光学组件，其中，每个区域包括由损耗区域围绕的包括来自激发光源的光的激活区域，该损耗区域包括来自损耗光源的光。在一些实施例中，该系统包括一个或更多个检测器，其随时间接收来自区域的信号并对其积分，并且为各个环形区域照射的各个点产生积分信号。在一些实施例中，处理器被编程为从积分信号确定各个点的荧光。

在第一方面的一些实施例中，各个点对应于固体支持物上的荧光核酸分子。在第一方面的一些实施例中，各个区域是圆的环形区域。在第一方面的一些实施例中，激发光源包括用于阵列中的每个区域的激发激光器，并且损耗光源包括用于阵列中的每个区域的损耗激光器，并且其中，对于环形区域阵列中的每个环形区域，光学路径用于引导来自相应的激发激光器和损耗激光器的光以产生环形区域。在另一实施例中，一个或更多个检测器包括用于区域阵列中的每个相应区域的检测器。

在第一方面的一些实施例中，光学路径包括偏转器，以按照时间依赖的方式引导来自激发光源的光并且引导来自损耗光源的光以产生区域阵列。在另一实施例中，一个或更多个检测器包括用于区域阵列中的每个区域的检测器。

在第一方面的一些实施例中，光学路径包括相位掩模，以将来自激发光源的光分成多个激发光束，并且将来自损耗光源的光分成多个损耗光束从而产生区域阵列。在第一方面的一些实施例中，光学路径包括波导，以在波导内利用来自激发损耗光源的光产生驻波。

在第一方面的一些实施例中，一个或更多个检测器包括检测来自样品的光的单个检测器。在另一实施例中，单个检测器包括多通道光子检测器。在另一实施例中，多通道光子检测器包括电荷耦合器件(CCD)图像传感器。

在第一方面的一些实施例中，区域阵列中的区域在第一方向上对准并且在相对于第一方向非正交且非平行的第二方向上跨样品扫描。在另一实施例中，第一方向垂直于第二方向。

在第一方面的一些实施例中，区域阵列中的区域分布在包括多个行和多个列的栅格中。在一些实施例中，样品在相对于区域阵列的方向上移动，该方向相对于多个行和多个列非正交且非平行。

在第一方面的一些实施例中，该系统包括扫描系统以移动样品，使得区域阵列相对于样品移动。在另一实施例中，处理器使用来自扫描系统的信息以将由一个或更多个检测器产生的信号与样品上的各个点相关联，使得样品上的各个点的积分信号是选择性地对由一个或更多个检测器产生的信号积分的结果，该检测器接收从样品上的各个点发射的光。

在第一方面的一些实施例中，光学路径包括产生区域阵列的一个或更多个光学组件，其中，阵列中的各个区域包括激活区域和围绕激活区域的损耗区域，使得在暴露于激活区域和损耗区域的组合以后，仅子衍射区域中的荧光团保持激活。

在第二方面，提供用于读取样品的超分辨率显微系统。该系统包括激发光源。该系统包括损耗光源。该系统包括光学路径，该光学路径包括产生图案化的损耗区域的一个或更多个光学组件，其中每个图案化区域包括来自激发光源的激发光和来自损耗光源的损耗光。该系统包括一个或更多个检测器，以接收来自被图案化区域照射的荧光团的信号并对其积分，并且产生关于样品上的各个点的积分信号。该系统包括处理器，该处理器接收来自一个或更多个检测器的积分信号并且基于积分信号确定荧光团的荧光。

在第二方面的一些实施例中，荧光团具有暗态，其寿命大于或等于约100ms。在第二方面的一些实施例中，荧光团包括具有稳定至少10秒的断开状态(off-state)的染料。在另一实施例中，染料包括罗丹明、恶嗪或羰花青染料或其组合。在第二方面的一些实施例中，荧光团在低氧浓度下光切换(photoswitched)。

在第二方面的一些实施例中，扫描系统移动图案化的损耗照射，使得在成像周期期间样品移动时它相对于样品是静止的。在另一实施例中，扫描系统移动图案化的损耗照射使得其在一个成像周期到另一个成像周期时移位。

在第二方面的一些实施例中，样品与定制的成像缓冲液一起使用，该成像缓冲液包括低氧或低氧化染料，使得荧光团保持去激活至少10秒。

在第二方面的一些实施例中，显微系统对每个成像周期使用单个饱和周期。在第二方面的一些实施例中，该系统包括扫描系统以移动样品，或扫描光学路径中的一个或更多个光学组件，使得宽场激活照射和图案化的损耗照射相对于样品移动。在另一实施例中，处理器使用来自扫描系统的信息以将由一个或更多个检测器产生的信号与样品上的各个点相关联，使得样品上的各个点的积分信号是选择性地对由一个或更多个检测器产生的信号积分的结果，该检测器接收从样品上的各个点发射的光。

在第二方面的一些实施例中，图案化的区域包括由第二损耗光区域围绕的第一激活光区域。

在第三方面，提供执行超分辨率显微术以读取样品的方法。该方法包括：通过(i)使用激发光源选择性地激活样品上的荧光团和(ii)使用损耗光源选择性地去激活样品上的荧光团来产生包括由损耗区域围绕的激活区域的区域阵列，使用一个或更多个检测器随时间接收来自区域的信号并对其积分，确定样品上各个点的积分信号，并且从积分信号确定样品上各个点的荧光。

在第三方面的一些实施例中，样品是固体支持物上的核酸特征阵列。在第三方面的一些实施例中，各个区域是圆的环形区域。在第三方面的一些实施例中，产生区域阵列包括，对于区域阵列中的每个区域引导来自激发激光器和损耗激光器的光以产生该区域，其中，激发光源包括用于阵列中的每个区域的激发激光器并且损耗光源包括用于阵列中的每个区域的损耗激光器。在另一实施例中，一个或更多个检测器包括用于区域阵列中的每个区域的检测器。

在第三方面的一些实施例中，产生区域阵列包括使用偏转器以时间依赖的方式偏转来自激发光源和损耗光源的光。在另一实施例中，一个或更多个检测器包括用于环形区域阵列中的每个区域的检测器。

在第三方面的一些实施例中，产生区域阵列包括将来自激发光源的光分成多个激发光束并且将来自损耗光源的光分成多个损耗光束。在第三方面的一些实施例中，产生区域阵列包括利用来自损耗光的光产生驻波。

在第三方面的一些实施例中，一个或更多个检测器包括检测来自样品的光的单个检测器。在另一实施例中，单个检测器包括多通道光子检测器。在另一实施例中，多通道光子检测器包括CCD图像传感器。

在第三方面的一些实施例中，该方法还包括在第一方向上跨样品扫描区域阵列，并且在相对于第一方向非平行的第二方向上跨样品扫描区域阵列。在另一实施例中，第一方向垂直于第二方向。

在第三方面的一些实施例中，区域阵列中的区域分布在包括多个行和多个列的栅格中，该方法还包括在相对于区域阵列的方向上移动样品，该方向相对于多个行和多个列是非正交且非平行。在第三方面的一些实施例中，该方法包括移动样品或扫描一个或更多个光学组件以相对于样品移动区域阵列。在另一实施例中，该方法包括使用来自扫描系统的信息将由一个或更多个检测器产生的信号与样品上的各个点相关联，使得样品上的各个点的积分信号是选择性地对由一个或更多个检测器产生的信号积分的结果，该检测器接收从样品上的各个点发射的光。

在第三方面的一些实施例中，阵列中的各个区域包括激活区域和围绕激活区域的损耗区域，使得在暴露于激活区域和损耗区域的组合以后，仅子衍射区域中的荧光团保持激活。

在第四方面，提供执行超分辨率显微术以读取样品的方法。该方法包括：产生宽场激活照射以激发照射区域内的荧光团，产生图案化的损耗照射以选择性地去激活照射区域的目标部分中的荧光团，使用一个或更多个检测器接收来自照射区域内的受激发荧光团的信号并对其积分，产生样品上的各个点的积分信号，并且从积分信号确定样品上各个点的荧光。

在第四方面的一些实施例中，荧光团具有暗态，其寿命大于或等于约100ms。在第四方面的一些实施例中，荧光团包括具有稳定至少10秒的断开状态的染料。在第四方面的一些实施例中，染料包括罗丹明、恶嗪或羰花青染料或其组合。在第四方面的一些实施例中，荧光团在低氧浓度下光切换。

在第四方面的一些实施例中，该方法包括使用扫描系统移动图案化的损耗照射，使得图案化的损耗照射相对于样品是静止的。在另一实施例中，该方法包括移动图案化的损耗照射，使得其在一个成像周期到另一个成像周期时移位。

在第四方面的一些实施例中，样品与定制的成像缓冲液一起使用，该成像缓冲液包括低氧或低氧化染料，使得荧光团保持去激活至少10秒。在第四方面的一些实施例中，单个饱和周期用于每个成像周期。

在第四方面的一些实施例中，该方法包括移动样品或扫描一个或更多个光学组件，使得宽场激活照射和图案化的损耗照射相对于样品移动。在另一实施例中，该方法包括使用来自扫描系统的信息将由一个或更多个检测器产生的信号与样品上的各个点相关联，使得样品上的各个点的积分信号是选择性地对由一个或更多个检测器产生的信号积分的结果，该检测器接收从样品上的各个点发射的光。

在第四方面的一些实施例中，图案化的损耗照射产生零点强度的区域以选择性地去激活目标区域内的荧光团，同时允许零点强度的区域内的荧光团保持激活。

应当理解，前述概念(假设这些概念不相互矛盾)的所有组合被认为是本文公开的发明主题的一部分。特别地，出现在本公开结尾处的所要求保护的主题的所有组合被认为是本文公开的发明主题的一部分。

附图简述

参考以下结合附图的详细描述来描述本文提供的实施例的方面和优点。在整个附图中，可以重复使用参考数字来指示所引用的元件之间的对应关系。提供附图是为了说明本文描述的示例实施例，并且不旨在限制本公开的范围。

图1示出使用并行化的超分辨率显微系统的示例。

图2A-2D示出图1的超分辨率显微系统的示例实施例。

图3示出图2D的显微系统的光学路径中的波导的示例，该波导产生驻波。

图4A和图4B示出受激发射损耗(STED)线扫描的示例。

图5示出通过相对于扫描方向倾斜的STED环的栅格扫描样品的示例。

图6示出图1的超分辨率显微系统的另一示例实施例。

图7示出使用图6的超分辨率显微系统获取数据的一系列步骤。

图8示出使用图6的超分辨率显微系统获取数据的一系列步骤，其中流动池在数据获取期间移动。

图9示出利用图6的超分辨率显微系统产生的图案化照射的移动以匹配流动池的移动的示例。

详细描述

本公开的各方面涉及超分辨率显微术，其使用荧光探针的激活和去激活的并行化然后检测每个探针的荧光。所公开的系统可包括光源(例如，激光器)、光学组件、扫描系统和检测器，它们一起提供本文所述的优点和能力。另外，可以实施具有定制特征的荧光探针或染料的使用以实现一些所描述的能力和优点。本公开的各方面还涉及用于在超分辨率显微系统中提供并行化的方法，由此通过各种方法降低光源的功率要求。这可以允许增加的并行化，同时将激光功率消耗保持在实际或期望的水平内。总的来说，所公开技术的实施例可以使超分辨率显微术能够具有与传统显微术相当的通量。

尽管为了说明的目的，本文描述的示例和实施方式集中在受激发射损耗(STED)显微系统和方法上，但是所公开的特征和优点也可以用其他确定性超分辨率显微系统和/或随机超分辨率显微系统实现。例如，所公开的特征和优点可以在诸如采用以下技术的系统中实现：可逆饱和光学荧光跃迁(RESOLFT)、基态损耗(GSD)、饱和结构化照明显微术(SSIM)、经由瞬时激活的猝灭剂的超分辨率(STAQ)、随机光学重建显微术(STORM)、光激活定位显微术(PALM)、单分子定位显微术(SMLM)、超分辨率光学波动成像(SOFI)、光谱精密距离显微术(SPDM)等。此外，尽管在DNA测序的背景下描述了一些示例，但是所公开的系统和方法可以被实施以用于受益于具有高通量的超分辨率显微术的各种应用。示例性应用包括但不限于，执行与靶相互作用的分子探针的光学检测的应用，诸如核酸杂交测定、抗体结合测定、蛋白质-蛋白质相互作用测定、蛋白质-核酸相互作用测定。另一示例性应用可包括基于光学反应物的消耗或光学产物的产生来检测酶反应，检测小分子诸如候选治疗剂，其与蛋白质、细胞或其他生物分子相互作用以产生光学可检测的信号变化，检测光学标记的细胞或组织等。现在将关于某些示例和实施例描述本公开的各个方面，其旨在说明而非限制本公开。

实施例涉及与其他光学显微技术相比具有相对高通量的超分辨率显微技术。在一个实施例中，这可以通过并行化技术来实现。例如，本文公开的并行化技术可用于使用超分辨率技术同时或几乎同时地对样品上的多个位置成像。作为另一个示例，本文公开的技术可以用于增加通量，同时仍然能够通过使用采用时间延迟积分进行数据获取的技术来收集足够的光以分辨感兴趣的特征。作为另一个示例，本文公开的技术可用于通过降低荧光探针被激发和去激活的频率来增加数据获取速率。有利地，本文公开的用于超分辨率显微术的系统和方法例如可以使得能够在某些成像应用中使用较少的试剂、与超分辨率显微术相关的较低成本、和/或分辨尺寸小于或者等于约100nm或者小于或等于约50nm的靶(在一些基于核酸阵列的应用中，其对应于每平方毫米约1个人类基因组)。

当试图在同时尝试分辨小结构的同时增加通量时出现的问题是缺少足够的可用于成像的光子。例如，在使用荧光团的情况下，在被成像的区域中存在较少的荧光团，导致较少的光子。通常，这可以通过在更长时间内积分来获得足够的光子信号以生成图像(例如，改善信噪比以分辨结构或特征)而得到解决，但是这可能对数据获取速率具有不利影响，并由此对通量具有不利影响。例如，在目标分辨率小于或等于约100nm或更小的测序应用中，在簇中可能有数十个分子被成像。如本文所述，该问题可以通过以下操作来解决：并行化数据获取过程使得系统停留在被成像的每个特征上足够长时间以收集足够的光子从而实现目标信噪比。在一些实施例中，可以通过同时激活在多个位置而不是在单个位置中的荧光团来实现并行化。在一些实施方式中，还可以通过同时检测来自这些激活位置的荧光来实现并行化。

在一个实施例中，该系统使用有机荧光团的化学光切换来降低激光功率要求并实现具有高通量的并行化。与受激发射相比，某些有机荧光团的光学跃迁可以用相对小的激光能量完成。另外，可以使用具有稳定暗态的某些有机荧光团。在一个示例中，这样的荧光团使得单个饱和周期对于每个成像周期是足够的，与其他超分辨率技术的每秒数千或数百万个光饱和周期相对比。

另外，如本文所述，可以采用其他超分辨率技术，其利用较少的激光功率来实现靶向荧光团的激发和损耗。例如，在不受限的情况下，一种这样的技术被称为经由瞬时激活的猝灭剂的超分辨率(STAQ)，并且利用将发光和猝灭功能分离成两个耦合分子的二分探针。这导致超分辨率成像需要较少的去激活功率。STAQ技术的其他示例和描述包括在于2013年10月1日发布的名称为“Composite probes and use thereof in super resolutionmethods”的美国专利号8,547,533中，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的以形成本说明书的一部分。

STAQ方法是超分辨率光学技术，其中，复合探针(例如，由接头(linker)分开的新型荧光共振能量转移(FRET)对)用于缩小激发光束内探针群的点扩散函数。缩小点扩散函数缩小例如荧光显微镜的光斑尺寸。复合探针由通过诸如聚脯氨酸的接头连接的供体部分和瞬时激活的猝灭剂(TAQ)(例如受体)组成。在一个示例中，处于其基态的TAQ在供体的发射带区域中不吸收。然而，处于其激发态的TAQ在供体发射区域中显著吸收。在STAQ技术中，供体激发光束激发供体部分并且猝灭光束激发瞬时激活的猝灭剂部分，通过可以穿过或通过接头的猝灭机制有效地切断供体发射的一部分。

另外，长斯托克斯位移(Stoke’s shift)染料可用于进一步分离荧光探针的激发和损耗波长。在一些实施方式中，这可允许损耗激光的波长处于损耗光谱的更有效部分中，从而允许较少的激光能量用于使用此类染料去激活靶向荧光团。在某些实施例中，这可以使用具有约150nm斯托克斯位移的染料来实现。在各种实施方式中，相对于具有相当的损耗激光能量的典型染料，这可以导致大约10倍的更有效的损耗。

这些技术可用于减少超分辨率显微技术中所需的激光功率量，但缺少光子的挑战可能仍然存在。如本文所述，可以使用技术有效地停留在每个被成像的子衍射区域上足够长的时间以检测足够的光子，从而实现目标或期望的信噪比。

例如，利用时间延迟积分(TDI)进行数据获取的系统可以被实现以对子衍射区域成像。这样的系统可以扫描一连串子衍射区域(例如，沿着样品的x维度对齐的多个子衍射区域，其以不同于x维度的维度诸如y维度扫描)以跟踪样品上的一系列平行线和/或扫描子衍射区域的栅格(例如，沿样品的x和y维度排列的多个子衍射区域，其以线性维度扫描以跟踪样品上的一系列平行线)。典型的STED系统利用线扫描，其中产生单个环形激发区域并以类似光栅的方式跨样品以一条线扫描。在本文所述的几个示例中，环形区域用于描述激发区域。然而，将理解，区域和环不需要一定是圆形的。相反，激发源和成形光学器件可用于创建其他形状，诸如三叶草结构、六边形或矩形阵列，或几乎任何产生高激光强度区域的亮区和暗区的变型，以及其他低/零激光功率强度的区域。

在本文公开的改进的STED系统的实施例中，可以在样品上产生并扫描环阵列以并行地执行不同区域的扫描。在一些实施方式中，该阵列可以有效地等效于平行线扫描并且系统可以扫描样品使得样品的各个点通过阵列中的多个环。对于照射点通过的每个STED环，数据获取系统对得到的光子信号进行积分，以使得对于被成像的点存在有效地更长的曝光时间。通常，所描述的类似TDI技术可以被配置为在算法上移位光子，使得检测到的光子跟随被成像的点。这允许超分辨率显微系统在被成像的点移动到不同的扫描线时对这些点的信号进行积分。例如，该系统使用不同的传感器(例如，不同的光电检测器或图像传感器中的不同像素)检测或者被配置为检测来自不同扫描线的信号。该系统可以将利用不同检测器采集的数据与在相应扫描线中成像的点相关联，并对这些信号积分以获得该点的总信号。这种情况可针对点阵列并行发生。因此，这些类似TDI的技术通过从样品上的相同位置收集光子而有效地停留在样品的点上更长时间，其中该位置被不同的STED环激发多次。

这些超分辨率技术在DNA测序方面可能特别有价值。期望应用超分辨率技术用于对位于固体支持物上的子衍射大小的阵列特征(诸如阱)或其他呈现单核酸分子或核酸扩增子簇的特征处的核酸进行测序。超分辨率允许的更高密度可以导致更低的每基因组成本。例如，增加测序流动池的特征密度允许给定的测序试剂溶液与更多核酸相互作用，从而产生更多的测序数据。这反过来提供测序成本的显著降低，因为试剂在测序运行的多个循环中逐渐消耗。此外，超分辨率技术可以更有效地使用试剂，从而导致每单位试剂的更多测序数据。降低消耗成本的进一步进展是有益的，因为与每个基因组的仪器成本相比，这些成本可能是每基因组成本的很大一部分，这可能随着工厂测序仪的通量增加而下降。成像速度的提高可以为实现超分辨率测序提供显著的改进。因此，本文描述的一些实施例包括提高用于测序的超分辨率显微系统中的成像速度的技术。

本文描述的超分辨率显微术的改进可以应用于各种超分辨率技术。超分辨率显微术可以包括利用“受激发射”的技术，但更一般地适用于以空间控制的方式在明亮和暗态之间切换分子的系统和方法。受激发射是实现光切换的一种方式。在一些实施例中，在受激发射需要不切实际的高激光强度来切换分子的情况下，可以采用不同的光切换机制。替代的光切换机制包括例如但不限于，单线态和三线态、猝灭和非猝灭状态之间的转换、光化学转换、光异构化等。

具有高通量的超分辨率显微系统的概述

现在转到图1，示出使用并行化的超分辨率显微系统100的示例。示例显微系统100可以实现或被配置为实现本文描述的一种或更多种并行化技术和/或减少用于实现超分辨率成像的光强度的量的一种或更多种技术。在此关于图2A-2D和图6描述显微系统100的特定示例实施方式。显微系统100使用本文所述技术的任何合适组合产生样品130的超分辨率图像。显微系统100可以实现超分辨率技术，诸如例如但不限于STED、STORM、STAQ、SSIM、GSD、PALM、SMLM、SOFI、SPDM等，以及这些技术的变型。

显微系统100包括光源110，其可提供光以选择性地激活和/或去激活样品上的目标点处的荧光团。光源110可以是一个或更多个激光器。光源110可包括提供不同波长的光的光源。光源110可以提供具有被调节以选择性地激活荧光和/或抑制荧光的波长的光。

显微系统100包括从光源110到样品130的光学路径120。光学路径120包括反射镜、透镜、棱镜、四分之一波片、半波片、偏振器、滤光器、二向色镜、分束器、光束组合器等中的一个或更多个的组合。光学路径120可以是从光源110到样品130的直射光。另外，光学路径120包括光学组件，其引导光或者可以被配置为将从样品130发射的光引导到积分检测系统150。在一些实施例中，用于将光从光源引导到样品的光学元件的一部分也用于将来自样品130的光引导到积分检测系统150。光学路径120可包括物镜。可以将物镜浸入诸如水或油的液体中，或者可以在不浸没的情况下使用物镜。与超分辨率显微术一起使用的光学路径和光学系统的示例被包括在于2009年9月15日发布的题为“Confocal Imaging Methods andApparatus”的美国专利号7,589,315中、于2015年2月10日发布的题为“Systems,Methods,and Apparatuses to Image a Sample for Biological or Chemical Analysis”的美国专利号8,951,781中、以及于2015年11月24日发布的题为“Integrated OptoelectronicRead Head and Fluidic Cartridge Useful for Nucleic Acid Sequencing”的美国专利号9,193,996中，其各自通过引用以其整体并入本文。

显微系统100包括扫描系统140，以有效地相对于样品130移动光以扫描样品130，从而产生图像。在一些实施例中，扫描系统140可以在光学路径120内实现。例如，扫描系统140可包括在光学路径120内相对于彼此移动以有效地跨样品移动来自光源110的光的一个或更多个扫描镜。扫描系统140可以实现为物理地移动样品130的机械系统，使得样品相对于来自光源110的光移动。扫描系统140可以是光学路径120中的光学组件和用于物理移动样品130的机械系统的组合，使得来自光源110的光和样品130相对于彼此移动。

显微系统100包括积分检测系统150，其包括一个或更多个光检测器以及相关的电子电路、处理器、数据储存器、存储器等，以获取和处理样品130的图像数据。积分检测系统150可包括光电倍增管、雪崩光电二极管、图像传感器(例如，CCD、CMOS传感器等)等。在一些实施例中，积分检测系统150的光检测器可以包括放大光信号的组件，并且可以对单光子敏感。在一些实施例中，积分检测系统150的光检测器可具有多个通道或像素。积分检测系统150可以基于从样品130检测到的光生成超分辨率图像。

光学路径120包括阵列发生器121，阵列发生器121在样品130上产生多个激活和/或去激活区域。可以使用扫描系统140在样品130上扫描这些区域以选择性地激活用于成像的子衍射区域。当在样品130上扫描多个激活和/或去激活区域时，积分检测系统150可以对与样品130上的特定点对应的信号进行积分。对于样品130上的各个点，积分检测系统150可以选择性地聚合对应于各个点的检测信号，其中各个点在不同的时间由不同的激活和/或去激活区域激活。因此，阵列发生器121和积分检测系统150的组合可以同时或几乎同时地检测来自样品130上的多个点的光，并且随时间对来自多个点的检测到的光积分以生成样品130的至少一部分的超分辨率图像。

产生STED环阵列的显微系统的示例

图2A-2D示出图1的超分辨率显微系统100的不同实施例。这些示例显微系统将被描述为实现STED超分辨率技术，但是这些系统可以利用任何合适的超分辨率技术，其利用激发光源和损耗光源以选择性地激活荧光团。这些系统利用类似TDI的数据获取方法，该方法在多次扫描中对来自样品上的各个点的信号进行积分，以生成样品的超分辨率图像数据。例如，系统可以生成平行线扫描阵列，使得被成像的点通过阵列中的每个线扫描，并且检测系统对来自每个线扫描的信号积分。例如，在阵列中有10条线的情况下，相对于具有单线扫描的STED系统，这可以有效地提供大约十倍的曝光时间，其中样品以基本相同的速度移动通过系统。

各个显微系统200a-200d的积分检测系统250a-250d可以将检测到的信号与样品130上的对应点相关联或被配置为将二者相关联，使得信号可被积分。积分检测系统250a-250d可以利用诸如CCD相机的图像传感器、凝视传感器(staring sensor)、多个PMT等。积分检测系统250a-250d可以基于信号检测中的空间信息将检测到的信号与对应点相关联或被配置为使两者关联。例如，检测光子的传感器的位置可以与特定的线扫描相关联。作为另一个示例，来自传感器的信号的定时可以与样品上的线扫描的特定位置相关联。将定时信息与位置信息组合，积分检测系统250a-250d可以将来自不同传感器的信号在不同时间与样品上的适当点相关联。以这种方式，检测系统可以精确地对来自不同传感器的对应于从样品上的特定点发射的光子的信号积分。

一般而言，在STED显微术中，损耗激光器与激发激光器共同对准以产生由损耗区域围绕的“允许发射”区域。损耗激光器在此关于产生环形损耗区域被例示，其中环中的孔是允许发射的区域。该允许发射区域比常规显微镜的常规衍射极限点小得多，并且通过在样品上扫描该区域，获得超分辨率图像。STED显微术结合两种衍射极限强度分布(例如，高斯激发分布和环形损耗分布与可能的其他分布配置，如本文所述)以及基于荧光激发和受激发射的光切换机制。组合这些特征可以允许来自样品的荧光发射的空间限制，并因此允许超分辨率成像。

更详细地，共聚焦点扩散函数(PSF)可用于激发衍射限制区域内的荧光分子。紧随其后，在分子可以松弛并发射光子之前，经由受激发射过程，使用“损耗脉冲”(例如，环形损耗脉冲)迫使PSF外围中的受激分子回到其基态。通过使用足够高的激光强度，该环可以使向基态的转变饱和，迫使环形损耗脉冲内的基本上每个分子进入基态，而环中心内的分子保持被激发。在损耗脉冲之后，环中心内的空间受限的受激分子可以根据它们的荧光发射时间尺度松弛，发射光子，光子然后被检测。因为这些光子来自子衍射区域，所以它们可用于生成超分辨率图像数据。通过跨样品扫描该PSF环并在光电检测器上收集信号来创建完整图像。

传统的STED系统可能是缓慢的，因为由点访问样品内的每个位置，并且该点驻留在给定位置上足够长的时间以便收集足够的光子以进行可靠的测量(例如，DNA测序的碱基判定)。如本文所述，显微系统200a-200d可以生成或被配置为生成STED环阵列并且可以以与TDI扫描类似的方式执行数据获取。例如，通过使用一系列STED环线扫描，可以提供样品上各个点的更长的有效曝光。因此，该系统可以获得具有与较高有效成像速度下的典型单环STED系统相当的信噪比的数据。

如本文所述，类似TDI的数据获取是在同时移动样品的同时实现样品上的点的长曝光时间的方式。例如，物体移过一系列传感器(例如，其中各个传感器可以是CCD芯片上的像素、APD上的通道、各个光电二极管、各个PMT等)。当物体移动时，光子被收集在传感器上，并且当物体从一个传感器转移到下一个传感器时，累积的信号沿着一系列传感器移位。信号的这种移位可以通过在积分检测系统250a-250d中物理地将信号从传感器移动到传感器和/或在算法上实现。当物体到达一系列传感器的末端时，物体的图像包括来自不同传感器的多次曝光。来自不同传感器的信号可以被聚合(例如，积分)以生成具有与获取样品上的点的单次曝光的类似系统相当或更好的信噪比的图像。

举例来说，具有单个环的STED显微系统可以以每秒约20000至100000个阱的通量扫描或被配置成扫描100nm的阱。可能期望将该通量提高到每秒约500M个阱。通过增加用于创建图像的PSF的数量，本文描述的超分辨率显微系统可以达到或超过该目标通量。例如，具有25000个斑点的STED显微系统可以在保持相同分辨率的同时达到该目标通量(例如，扫描100nm的阱)。

图2A示出使用多个激发激光器212a、多个损耗激光器214a、和多个检测器252a产生或被配置为产生多个STED环的示例显微系统200a。显微系统200a可包括独立激光器(例如，激发激光器212a和损耗激光器214a)、光束控制(beam-steering)(例如，光学路径220a或扫描系统240a的一部分)、以及用于STED环阵列中的每个环的检测装置(例如，检测器252a)。显微系统200a可以针对阵列中的每个环复制或被配置为复制典型STED显微系统中使用的光学光路和检测设置。扫描系统240a包括线扫描模块242a，其跨样品130扫描使用相应的激发激光器212a和损耗激光器214a产生的环。环阵列的线扫描的例子在本文中参考图4A和图4B更详细地描述。

积分检测系统250a可以对来自检测器252a的信号积分，以产生样品130上各个点的积分信号。例如，积分检测系统250a可以使用来自扫描系统240a的信息确定积分来自检测器252a的哪些信号以产生样品130上各个点的这些积分信号。

图2B示出示例显微系统200b，其包括光学路径220b中的偏转器222。偏转器222被配置为分别使来自激发激光器212b和损耗激光器214b的光偏转以产生STED环的阵列。具有偏转器222的显微系统200b可以使用分时方法提供STED环阵列，其中相同的激光源用于分别产生针对阵列中的每个环的激发脉冲(例如，使用激发激光器212b)和损耗脉冲(例如，使用损耗激光器214b)。偏转器222可以是任何类型的高频光束控制设备，诸如高速偏转器，例如声光偏转器。为了更好地说明，这里的偏转器222被称为高速偏转器，但是偏转器222可以是如本文所述的任何合适的偏转器。

扫描系统240b包括线扫描模块242b，其跨样品130扫描使用相应的激发激光器212b和损耗激光器214b产生的环。环阵列的线扫描的示例在本文中参考图4A和图4B更详细地描述。

在一些实施例中，积分检测系统250b可包括高频单光子检测器，诸如SPAD、APD、PMT等。检测器可以在各种STED线(例如，阵列中的环)之间分时。积分检测系统250b可以包括数据获取系统，该系统将根据时间产生的信号与样品130上的相应环和位置相关联。这可以允许积分检测系统250b对来自多个环的信号积分，其中积分信号对应于样品130上的特定点的图像数据。

在一些实施例中，积分检测系统250b包括具有空间分量的检测器，使得在检测器上检测到的光子的位置以及检测到的光子的定时可用于生成样品130上的特定位置的图像数据。例如，检测器可以是APD阵列、图像传感器、微通道光电检测器等。来自样品130上的间隔比显微系统200b的衍射极限更远的点的光可以被引导到检测器上的不同位置。环阵列可以被配置成使得阵列中的各个环各自彼此间隔开一定距离，该距离超过显微系统200b的衍射极限，如本文参考图4A、图4B和图5更详细地描述的。

在一些实施例中，可以使用光学路径220b和/或高速偏转器222将从样品上对应于各个环的各个点发射的光引导到检测器上的不同位置。使用高速偏转器222生成的环可以使用扫描系统240b并且特别是扫描系统240b的线扫描模块242b跨样品130扫描。扫描系统240b可以包括扫描镜以跨样品130移动环阵列。积分检测系统250b可以使用来自高速偏转器222和/或扫描系统240b的信息确定来自检测器的哪些信号对应于样品130上的特定点，使得积分检测系统250b可以对来自检测器的对应于样品130上的各个点的信号积分。

图2C示出示例显微系统200c，其包括光学路径220c中的相位掩模224。相位掩模224分别使来自激发激光器212c和损耗激光器214c的光偏转以产生STED环阵列。具有相位掩模224的显微系统200c可以通过将相应的激光分成多个光束来提供STED环阵列。在一些实施例中，单个激发激光器212c和单个损耗激光器214c可用于为阵列中的所有环提供相应的激发和损耗脉冲。在一些实施例中，相位掩模224可包括衍射光栅。

显微系统200c的扫描系统240c可跨样品130扫描阵列中的环。扫描系统240c可相对于阵列中的环移动样品130。

在一些实施例中，积分检测系统250c包括多个检测器252c，用于检测来自样品130上的点的信号，这些点对应于样品130上来自所产生的阵列的环入射的位置。检测器252c可以包括如本文所述的任何合适的光子检测器，诸如，例如但不限于PMT、APD、CCD相机、凝视传感器等。积分检测系统250c可以包括将信号与样品130上的相应环和位置相关联的数据获取系统。这可以允许积分检测系统250c对来自多个环的信号进行积分，其中积分信号对应于样品130上的特定点的图像数据。

在一些实施例中，检测器252c包括用于STED环阵列中的每个环的一个检测器。在某些实施例中，检测器252c包括阵列检测器，其具有对应于阵列中的每个STED环的通道或传感器。以这种方式，多个检测器252c中的每个检测器或传感器产生对应于从样品上由阵列中的特定环激发的点发射的光的信号。积分检测系统250c可以使用来自扫描系统240c的信息和定时信息来确定来自特定检测器或传感器的哪些信号对应于样品上的特定点。例如，使用本文所述的扫描和时间延迟积分技术，多个不同检测器在不同时间点可以检测从样品130上的特定点发射的光。积分检测系统250c可以对来自相应检测器的适当信号积分以确定样品130上各个点的积分信号。

在一些实施例中，积分检测系统250c包括具有空间分量的检测器252c，使得在检测器上检测到的光子的位置以及检测到的光子的定时可用于生成样品130上的特定位置的图像数据。例如，检测器可以是APD阵列、图像传感器、微通道光电检测器等。来自样品130上的间隔远远超过显微系统200c的衍射极限的点的光可以被引导到检测器上的不同位置。环阵列可以被配置成使得阵列中的各个环彼此间隔开一定距离，该距离超过显微系统200c的衍射极限，如本文参考图4A、图4B和图5更详细地描述的。

在一些实施例中，可以使用光学路径220c将从样品上对应于各个环的各个点发射的光引导到不同的检测器252c。使用扫描系统240c，特别是扫描系统240c的线扫描模块242c，可以跨样品130扫描使用相位掩模224产生的环。扫描系统240c可以包括扫描镜，其跨样品130移动环阵列。积分检测系统250c可以使用来自扫描系统240c的信息和关于检测器252c的信息确定来自各个检测器252c的哪些信号对应于样品130上的特定点，从而积分检测系统250c可以对来自特定检测器的信号积分，该信号对应于样品130上的各个点。扫描系统240c包括线扫描模块242c以跨样品130扫描使用相应激发激光器212c和损耗激光器214c产生的环。环阵列的线扫描的示例在本文中参考图4A和图4B更详细地描述。

图2D示出示例显微系统200d，其包括光学路径220d中的波导226。波导226在波导226内部产生站立模式。显微系统200d可以使由损耗激光器214d提供的光的波长偏移，以移动波导226中的站立模式的峰和谷相对于样品130定位的位置。具有波导226的显微系统200d可以通过使用激发激光器212d照射样品并产生包括多个节点和波腹(anti-node)的损耗激光器214d的站立模式来提供STED环阵列，节点对应于损耗激光器的零强度的位置，并因此对应于样品上的激发区域。在一些实施例中，单个激发激光器212d和单个损耗激光器214d可用于为阵列中的所有环提供相应的激发光和损耗脉冲。在一些实施例中，波导226包括多个波导，这些波导与波导耦合器彼此成直角正交定向。在一些实施例中，波导226包括光学腔。在某些实施例中，波导226包括法布里-珀罗干涉仪。

图3示出图2D的显微系统200d的光学路径中的波导226的示例，波导226产生驻波227。驻波227的峰228(或波腹)可以对应于待成像的样品130上的损耗位置，诸如簇，而驻波的节点229可以对应于损耗光源的零强度的位置。波导226可包括反射器225以反射入射光223以产生驻波227。

为了移动驻波227的峰228和节点229的位置，可以修改注入光223的波长。例如，在光源是二极管激光器的情况下，可以改变激光二极管的温度以改变激光器的输出波长。作为另一个例子，可以在波导226中使用热量来移动峰228和节点229的位置。波导226中的温度变化引起折射率的变化，从而增加或减少波导226内部的光学路径的长度。

返回图2D，显微系统200d可包括扫描系统240d，其相对于波导226移动样品130，以改变波导中驻波227的特性，和/或修改提供给波导226的光223的波长。

显微系统200d可以包括积分检测系统250d，以检测来自样品130上的多个点的光。类似于本文中参考图1和图2A-2C描述的检测系统，检测系统250d可以对来自样品130的信号积分，以针对样品130上的多个点提供类似TDI的数据获取。这可以使用多个检测器、一个或更多个具有多个通道或传感器的检测器、在不同STED环之间分时的一个或更多个检测器、多个空间相关的检测器(例如，检测到的信号的位置提供关于样品130上的STED环和/或位置的信息)、一个或更多个时间相关的检测器(例如，检测到的信号的时间提供关于样品130上的STED环和/或位置的信息)、或这些的任何组合来实现。

利用STED环阵列的类似TDI的数据获取

图4A和图4B示出STED线扫描的示例。STED线扫描包括跨样品(例如，图中水平地)扫描的多个STED环415，每个环具有激发区域416和损耗区域418。样品和STED环415的阵列相对彼此移动使得样品上的点432穿过多个STED环415的至少一个子集。如本文所述，每当STED环入射在点432上时，点432发射由一个或更多个检测器检测到的光。来自这些检测器的信号可以随时间积分以产生关于点432的积分信号454。检测系统可以包括类似TDI的数据获取系统，其随时间针对样品上的点的信号积分。通过使用STED环415的阵列，可以实现更快的扫描时间，同时仍然获取具有目标或期望的信噪比的信号。

为了说明本文中所描述的类似TDI的数据获取技术，现在将描述特定示例，其不旨在限制本发明的范围。参考图4A，在时间段T1期间，点432与“A”STED环线扫描重合并发射光。在时间段T2期间，点432与“B”线扫描重合。在时间段T3期间，点432与“C”线扫描重合，依此类推到时间段T10和线扫描“J”。在每个时间段T1-T10期间由点432发射的光可以由特定检测器检测。例如，在时间段T1期间由点432发射的光可以由检测器D1检测，在时间段T2期间由点432发射的光可以由检测器D2检测，在时间段T3期间由点432发射的光可以由检测器D3检测，等等。检测系统可以聚合来自适当时间段和适当的检测器的信号，以产生点432的积分信号454。例如，检测系统可以相加在各个时间段T1-T10期间由相应检测器D1-D10获得的信号S1-S10，以确定积分信号S_总：

S_总＝S1+S2+...+S10，

其中SN是在时间段TN期间由检测器DN检测到的信号(其中N＝1、2、3...10)。这可以针对样品上的多个点进行，其中样品上的每个点发射在特定时间段期间由特定检测器检测的光。

检测系统可以跟踪检测到的光子来自样品上的哪些位置。这可以使用软件、硬件、或两者的组合来完成。例如，单个检测器可以检测响应于来自特定STED环的激发而发射的信号。因此，检测器与该STED环相关联。检测系统可以将在特定时间检测到的信号与样品上的特定点相关联。检测器可以是CCD相机、PMT、APD、凝视传感器等。

在一些实施例中，检测器可以是图像传感器或具有光子检测元件阵列的类似检测器。在某些实施方式中，样品可以在样品扫描方向上(例如，在图4A和图4B中竖直地)机械地步进，并且每个机械步长可以对应于移动到新的像素或光子检测元件。当每个STED环分开的距离大于或等于显微系统的衍射极限时，这可能是有利的。在各种实施方式中，为了对样品上的特定点进行积分，电荷可以从像素到像素(或从光子检测元件到光子检测元件)移位以在机械扫描样品时跟随点通过检测器。以这种方式，可以使用检测硬件来对每个点的信号积分。

图4A示出STED环415的阵列，其被布置成在跨样品的线扫描期间基本上竖直对齐。每个STED环的激发区域416可以分开大于或等于使用中的特定显微系统的衍射极限的距离。此外，STED环415的阵列可以被布置成使得相邻环的损耗区域418不与相邻环的激发区域416重叠。

图4B示出STED环415的阵列，其被布置成在跨样品的线扫描期间水平和竖直交错。每个STED环的激发区域416可以分开大于或等于使用中的特定显微系统的衍射极限的距离。此外，STED环415的阵列可以被布置成使得相邻环的损耗区域418不与相邻环的激发区域416重叠。通过使环水平和竖直交错，可以扫描相邻环的激发区域416，使得扫描的激发区域对于跨样品的每次扫描基本上彼此相邻(在与扫描方向正交的维度中)。这可以与图4A中所示的布置相比较，其中扫描的激发区域彼此间隔开，使得对于跨样品的每次扫描在激发区域之间(在与扫描方向正交的维度中)存在空间。

图5示出通过STED环510的栅格扫描样品的示例，其中栅格线相对于扫描方向是非正交且非平行的。可以如本文更详细描述的那样生成STED环510的栅格。在一些实施例中，STED环510的栅格中的每个环可以与相邻的STED环间隔开大于或等于显微系统的衍射极限的距离。例如，相邻的STED环可以间隔开至少约200nm、至少约250nm、或至少约300nm。

可以将STED环510的栅格引导到样品以选择性地激发样品。发射的光可以被引导到具有多个像素的图像传感器505，诸如CCD图像传感器。在一些实施例中，如图所示，穿过STED环510的线栅格(进而由STED环510激发的样品上的区域栅格)相对于图像传感器505的像素布置处于非正交且非平行的角度。在某些实施方式中，穿过STED环510的栅格线相对于图像传感器的像素的取向是正交或平行的。图像传感器505可以是高速图像传感器以每秒获取数千帧图像数据。在一些实施例中，图像传感器505每秒获取至少约10000帧，并且STED环510的栅格包括至少约10000个环。在一些实施例中，还可以使用传统的TDI传感器，其中放大率足够高。在这种情况下，可以在类似于尼普科夫盘共聚焦显微镜的传感器中形成图像。

可以在相对于STED环510的栅格倾斜的方向上机械地扫描样品。以这种方式，可以使每个STED环510跟踪跨样品的独特路径，使得STED环的集合基本上对整个样品成像。为了对样品成像，可以定位样品，可以使激发和损耗光源闪烁，可以检测发射的光，并且可以将样品移动到新的位置。可以重复该过程，直到样品已经通过STED环510的栅格。有利地，与具有单个STED环的STED显微系统相比，这可以允许超分辨率显微系统在相对较短的时间内扫描大样品。

降低超分辨率显微系统中的激光功率

然而，增加环的数量可能会使激光功率消耗增加到潜在的不切实际的高水平。这可能发生，至少部分地由于损耗或STED激光相对于染料的发射光谱处于红移波长，目标是染料发射光谱的尾部。这样做是为了促使染料的受激发射到基态并避免通过与激发光谱重叠而重新激发染料。在发射光谱的尾部，STED激光器和受激发射过程之间的横截面非常低，需要相对高的功率密度以使STED激光器实现由于基态引起的受激发射。不希望的高激光功率消耗的另一个潜在原因是受激发射快速发生(例如，在亚纳秒时间尺度上)，从而导致损耗在荧光发射之前发生。由于这些短时间尺度，STED脉冲被配置为相对强烈并且每秒脉冲大约数百万次。

为了减少在这种系统中消耗的激光功率的量，本文描述利用不同的光切换机制来实现子衍射成像的技术。类似地，为了减少在这种系统中消耗的激光功率的量，可以使用长斯托克斯位移染料，使得损耗激光器在光谱的更有效部分中运行以引起受激发射。

具有宽场图案化照射和化学光切换的显微系统的示例

图6示出图1的超分辨率显微系统600的另一示例实施例。显微系统600包括具有激发激光器612和损耗激光器614的光源610。显微系统600包括光学路径620，光学路径620包括宽场光学器件621和干涉栅格光学器件623，光学路径620将来自光源610的光引导到样品630并且将来自样品630的光引导到积分检测系统650。显微系统600包括扫描系统640，以将样品630和来自光源610的光相对于彼此移动以扫描样品630，从而产生图像数据。宽场光学器件621可以将来自激发激光器612的光散布在样品的相对大的区域上，以激活照射区域中的荧光团。干涉栅格光学器件623可以产生来自损耗激光器614的光图案，其选择性地使由激发激光器612照射的区域中(或在待成像的区域中)的几乎所有荧光团去激活，同时使子衍射区域(例如，单个或仅几个分子)中的靶向荧光团保持激活。

显微系统600可以通过将宽场和图案化照射与有机荧光团的化学光切换相结合来以相对高的通量实现具有降低或相对低的激光功率消耗的超分辨显微术。这可用于创建在延长的时段内稳定的子衍射激活区域。可以使用本文描述的一种或更多种检测技术以高通量方式对这些激活区域进行成像。

显微系统600可以与本文描述的高速扫描技术和类似TDI的数据获取技术一起使用。此外，通过使用以(例如与受激发射技术相比)相对小的功率操作的光学转换，显微系统600可以消耗相对较少的激光功率。类似地，显微系统600可以通过使用稳定但可逆的暗态消耗相对较少的激光功率。与其他超分辨率技术的每秒数百万个光饱和周期相比，利用稳定的暗态可以允许显微系统600对于每个成像周期使用单个饱和周期。这降低激光功率，因为通常使用较高的激光功率以重复的方式快速饱和光学转换。显微系统600的另一个优点是系统600可以分离光学图案化和读出/成像步骤。

可以使用STORM显微术和其他类似技术来实现显微系统600。STORM显微术采用光化学切换机制来诱导开/关转换。例如，STORM显微术是一种超分辨率光学显微技术，它基于单分子荧光信号的随机切换。STORM利用可以在荧光和暗态之间切换的荧光探针，并且显微系统600可以激发荧光团的光学可分辨部分。因为只有一小部分荧光团被激发，所以显微系统600可以基于检测到的荧光信号的中心位置以相对高的精度确定荧光团的位置。利用样品的多个快照，每个快照基于本文描述的图案化照射捕获荧光团的子集，可以从累积位置重建最终超分辨率图像。

显微系统600可利用包括还原剂(例如MEA)的成像缓冲液，该还原剂还原荧光染料或与荧光染料反应。这可以产生自由基阴离子或化学改变的染料，其后以非荧光的暗态存在。在某些实施方式中，可通过将荧光团激发至其单线态来光化学增强该反应。还原后，荧光团保持在暗态一段时间，直到染料与诸如氧气的氧化剂发生反应。在某些实施方式中，该反应也可通过使用UV光(例如，约405nm的光)进行光化学增强并且氧浓度可用于调节“接通(on)”切换的速率。

在STORM中，可以调节缓冲液中的氧浓度以匹配染料断开状态的稳定性，使得染料以目标或期望的速率重新接通。具有稳定断开状态的染料(例如罗丹明和恶嗪染料)可以在周围的(例如，相对高的)氧气水平下进行光切换，以确保染料以目标速率重新接通(或氧化)。具有不稳定的断开状态的染料(例如，羰花青染料)可以在低氧浓度下光切换(例如，使用酶氧清除系统实现)，以确保染料在目标或期望的时间段内保持断开。显微系统600可以使用具有损耗的氧水平的稳定的关闭状态染料(例如罗丹明和恶嗪)来进一步增强染料的稳定性以实现长的断开状态(例如，在秒的时间尺度上或大于或等于大约1秒钟)。该系统还可以使用这些染料的组合。在某些实施例中，例如，100mW激光器可用于在50×50μm视场中引起接通和断开状态之间的切换。在这样的实施例中，与使用受激发射的典型超分辨率技术(例如，STED超分辨率显微系统)相比，显微系统600在接通和断开状态之间切换时的效率可以高约2500倍。

通常，STORM显微术中使用的光化学转换不用于高通量超分辨率显微系统，因为转换太慢(例如，大约几毫秒)。然而，显微系统600使用类似STORM的光化学反应，同时通过宽场激发和图案化的损耗的组合实现高通量。例如，显微系统600可以将荧光分子切换成长寿命的暗态(例如，比典型STORM应用中的暗态长约10-1000倍的断开状态，或者至少约10ms、至少约100ms、或者至少约1s)并且使用宽场图案化照射来跨样品对接通/断开激活进行整形，从而激活目标衍射限制区域。在一些实施例中，关闭状态可持续至少约1秒、2秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、2分钟、5分钟、10分钟等。然后，长寿命的暗态允许对子衍射图案化的样品进行成像。在成像之后，可以重新激活荧光团(例如，使用UV光)，并且可以重新激活另一个衍射限制区域子集。

该光化学切换方法可用于将大多数荧光团偏置到断开状态。可以使用积分检测系统650对残留的、间隔良好的“接通”分子进行成像。积分检测系统650可以借助于检测单独的分子或很少到几个分子以及确定相应点扩散函数(PSF)的中心来以子衍射精度确定分子位置。可以使用荧光团的随机接通和断开切换和重复定位来构建图像。

在某些实施方式中，有机荧光团可以与显微系统600结合使用。例如，可以使用推拉式荧光团(push-pull fluorogen)。在各种实施方式中，可以使用有机染料而不是与显微系统600结合的光可切换蛋白质。对于有机染料，转换是光化学的并且因此通常比光可切换蛋白质的转换慢，这至少部分地由于所需的化学反应。转换到断开状态可以在毫秒或几秒的时间尺度上发生，并且转换回接通状态也可以是缓慢的，因为两个转换都依赖于光化学反应。所描述的显微系统600的一些方面涉及以下认识：可以利用有机染料的较慢切换动力学以允许图案化和成像的分离，允许使用较低的激光强度。在断开状态相对长寿命的情况下，可以利用每个成像周期的单个饱和切换周期。如本文所述，可以调节荧光团断开状态的长度，因为它涉及与氧气的反应。例如，降低氧浓度可以增强或增加断开时间。通过使用在断开状态下不易氧化的染料(例如罗丹明/恶嗪类染料)，可以使断开状态持续相对长的时间(例如，数十秒)。

图7示出使用图6的超分辨率显微系统600获取数据的一系列步骤。显微系统600在成像之前生成激活的子衍射区域阵列，其中使用这里描述的类似TDI的数据获取系统和技术完成成像。然后可以相对于样品移动激活的子衍射区域阵列并再次成像。可以重复该过程以随时间构建样品的图像。

显微系统600可以激活目标区域中的染料，产生激活的荧光团阵列705。例如，激活可以使用激发激光器612与宽场光学器件621完成。例如，激发激光器612可以是利用宽场光学器件621在目标区域上散布的UV光的源。

在宽场激活之后，显微系统600通过使用例如正弦强度栅格或图案710产生激活阵列，以经由光化学反应断开激活区域中的目标染料。例如，来自损耗激光器614的光可以穿过诸如干涉栅格光学器件623的光学器件以形成图案化照射710，该图案化照射710使除了衍射限制区域中的目标染料之外的所有激活的染料去激活。在某些实施方式中，图案化栅格与样品(例如，流动池)的移动同步移动。

使用本文所述的类似TDI的数据获取和成像技术，显微系统600可使用积分检测系统650对所得的子衍射激活区域阵列成像。如本文所述，显微系统600可以至少部分地由于暗态是长寿的而实现这些成像过程。

在成像之后，显微系统600可以使用目标波长的光(例如，UV光)重新激活分子715。显微系统600可以使用光学路径620的元件(例如，干涉栅格光学器件623)和/或扫描系统640来移动图案化的光栅710，使得对不同的子衍射区域进行成像。显微系统可以重复这一系列步骤以构建样品630的超分辨率图像。

图8示出使用图6的超分辨率显微系统600获取数据的一个示例中涉及的过程，其中样品(例如，流动池)在数据获取期间移动。显微系统600生成宽场照射以产生激活的荧光团阵列705。显微系统600产生用于损耗照射710的驻波栅格以在样品(例如，没有被关闭的区域)中产生“零强度点”的阵列。高强度区域中的荧光团变得饱和到其关闭状态，而在图案化照射的“零点”处的区域，荧光团保持激活。保持激活的这些区域的大小至少部分取决于光的强度和曝光时间。保持“接通”的区域在衍射限制区域中，并且从这些区域收集荧光提供关于样品630的超分辨率信息。在使用积分检测系统650收集该荧光之后，显微系统600使用宽场照射715将荧光团切换回“接通”。显微系统600移动损耗栅格710，使得相对于移动样品630改变“零点”的位置，并且可以询问样品630的下一个点，构建样品的超分辨率图像。

显微系统600使用图案化的损耗栅格710以光化学地将除“零强度点”位置中的荧光团之外的荧光团诱导至断开状态。例如，借助于定制的成像缓冲液，“关闭”荧光团可以保持断开数十秒(例如，至少10秒)。例如，如本文所述，定制的成像缓冲液可以包括低氧、低氧化性染料。在图案化之后，对这些荧光团进行成像，并且然后使用宽场激发光源重新激活。随后，损耗栅格图案可以随着样品的移动而移动，从而激活不同的荧光团子集，并重复该过程。

图9示出利用图6的超分辨率显微系统600产生的图案化照射710的移动以匹配样品(例如，流动池)的移动的示例。该模态可以与实现高速扫描类似TDI的成像技术的显微系统600结合使用。在这样的实施方式中，图案化的损耗栅格710可与样品630(例如，流动池)同步移动以在样品630上产生目标的接通/断开图案。然后显微系统600可对样品630成像并且相对于样品630移动损耗栅格710。当样品630(例如，在x方向上)移动时，损耗栅格710可以随样品630移动，使得损耗栅格相对于样品630静止。例如，损耗栅格710具有相对于y轴保持静止的特征，而其他特征相对于y轴移动。在显微系统600以这种方式扫描样品630的一部分之后，损耗栅格710相对于样品630横向和纵向移位目标量，允许成像不同组的荧光团。

显微系统600可以使用荧光团的长寿命暗态来提供解开图案化和成像的有利方式。在典型的超分辨率技术中，图案化和成像以时间交错的方式几乎同时发生。当使用具有快速动力学的光转换时，如在典型的超分辨率显微系统中，损耗和激发激光器的快速脉冲和交错可能增加系统的复杂性。如本文所述，显微系统600有利地至少部分地由于在成像之前的图案化而降低了这种复杂性。

此外，相对于典型的超分辨率技术，显微系统600可以降低激光功率利用率。例如，至少部分地由于使损耗发生在相对短暂的时间段内(例如，微秒到纳秒范围的时间尺度)的光学转换的饱和所需的激光功率强度，交错图案化和成像的典型的超分辨率技术通常需要高激光功率。至少部分地由于重复激发和光子发射周期的频率(例如，每秒数百万次)，这些激光功率要求进一步增加。至少部分地由于在成像之前每个成像周期进行一次开关转换(与每个周期数百万次相比的话)，显微系统600有利地使用稳定的可逆转换以降低激光功率要求。

显微系统600在样品通常随时间静态的应用中可能是特别有利的。使用在相对长的时间尺度上切换的有机荧光团，结合宽场图案化可以有利地为时间分辨率不如空间分辨率重要的应用提供超分辨率成像技术。例如，在测序应用中，流动池样品可以是相对静止的和不变的，并且低效的“时间分辨率”是可接受的，而快速成像相对大的视场的能力是特别有利的。显微系统600可以提供这些有利特性。

附加说明和术语

这里描述的实施例是示例性的。可以对这些实施例进行修改、重新布置、替代处理等，并且仍然包含在本文阐述的教导内。本文描述的步骤、过程或方法中的一个或更多个可以由适当编程的一个或更多个处理和/或数字设备来执行。

结合本文中所公开的实施例而描述的各种说明性成像或数据处理技术可以实现为电子硬件、计算机软件或两者的组合。为了说明硬件和软件的这种可互换性，上面已经在其功能方面对各种说明性组件、块、模块和步骤进行了总体描述。将此功能实施为硬件还是软件取决于特定应用和强加于整个系统的设计约束。所描述的功能可以针对每个特定应用以不同方式实现，但是这种实现决策不应被解释为导致脱离本公开的范围。

结合本文公开的实施例描述的各种说明性检测系统可以由机器实现或执行，诸如配置有特定指令的处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、或其他可编程逻辑器件、离散门或晶体管逻辑、分立硬件组件或其被设计用于执行本文所述的功能的任何组合。处理器可以是微处理器，但是在替代方案中，处理器可以是控制器、微控制器或状态机、它们的组合等。处理器还可以实现为计算设备的组合，例如DSP和微处理器的组合、多个微处理器、结合DSP内核的一个或更多个微处理器、或任何其他这样的配置。例如，本文描述的类似TDI的成像系统可以使用分立存储器芯片、微处理器中的一部分存储器、闪存、EPROM或其他类型的存储器来实现。

结合本文中所公开的实施例而描述的方法、过程或算法的元素可直接体现于硬件中、由处理器执行的软件模块中、或两者的组合中。软件模块可以驻留在RAM存储器、闪存、ROM存储器、EPROM存储器、EEPROM存储器、寄存器、硬盘、可移动磁盘、CD-ROM或本领域中已知的任何其他形式的计算机可读存储介质中。示例性存储介质可以耦合到处理器，使得处理器可以从存储介质读取信息和向存储介质写入信息。在替代方案中，存储介质可以是处理器的组成部分。处理器和存储介质可以驻留在ASIC中。软件模块可以包括计算机可执行指令，其使硬件处理器执行计算机可执行指令。

本文使用的条件语言——诸如除其他之外的“可以”、“可能”、“可”、“例如”等——除非另有明确说明或者在所使用的上下文中以其他方式理解通常是旨在传达某些实施例包括而其他实施例不包括某些特征、元素和/或状态。因此，这种条件语言通常不旨在暗示一个或更多个实施例以任何方式需要特征、元素和/或状态，或者一个或更多个实施例必须包括用于决定在任何特定实施例中是否包括或将要执行这些特征、元素和/或状态的逻辑，不论是否具有作者输入或提示。术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“具有”、“涉及”等是同义词并且以开放式方式包含使用，并且不排除其他元素、特征、动作、操作等等。此外，术语“或”在其包含意义上(而不是在其专有意义上)使用，因此当使用时，例如，为了连接元素列表，术语“或”表示一个、一些或全部列表中的元素。

除非另有明确说明，否则诸如短语“X、Y或Z中的至少一个”的析取语言在上下文中被理解为通常用于表示项目、术语等可以是X、Y或Z、或其任何组合(例如，X、Y和/或Z)。因此，这种析取语言通常不旨在且不应该暗示某些实施例需要X中的至少一个、Y中的至少一个或Z中的至少一个各自存在。

术语“约”或“近似”等是同义的并且用于表示由该术语修饰的值具有与其相关的理解范围，其中该范围可以是±20％、±15％、±10％、±5％或±1％。术语“基本上”用于表示结果(例如，测量值)接近目标值，其中接近可以意味着，例如，结果在值的80％内、在值的90％内、在值的95％以内、或在值的99％以内。

除非另有明确说明，否则诸如“一个(a)”或“一个(an)”的冠词通常应被解释为包括一个或更多个所述项目。因此，诸如“设备被配置为”或“设备用于”的短语旨在包括一个或更多个所述设备。这样的一个或更多个所述设备也可以被共同配置为执行所述的叙述。例如，“执行叙述A、B和C的处理器”可以包括被配置为执行叙述A的第一处理器，其与被配置为执行叙述B和C的第二处理器一起工作。

尽管以上详细描述已经被示出、描述并指出了应用于说明性实施例的新颖特征，但是将理解，在不脱离本公开的精神的情况下，可以对所示设备或算法的形式和细节进行各种省略、替换和改变。如将认识到的，本文描述的某些实施例可以体现为不提供本文阐述的所有特征和益处的形式，因为一些特征可以与其他特征分开使用或实践。在权利要求的等同物的含义和范围内的所有变化都包含在其范围内。

应当认识到，前述概念的所有组合(假设这些概念不相互矛盾)被认为是本文公开的发明主题的一部分。特别地，出现在本公开结尾处的所要求保护的主题的所有组合被认为是本文公开的发明主题的一部分。

Claims (32)

1.一种超分辨率显微系统，包括：

激发光源；

损耗光源；

光学路径，所述光学路径包括产生区域的阵列的光学组件，其中，每个区域包括包含来自所述激发光源的光的激活区域，所述激活区域由包括来自所述损耗光源的光的损耗区域围绕；

一个或更多个检测器，所述一个或更多个检测器随时间接收来自所述区域的信号并对所述信号积分，并且产生关于由各个环形区域照射的各个点的积分信号；以及

处理器，所述处理器被编程为从所述积分信号确定所述各个点的荧光。

2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述各个点对应于固体支持物上的荧光核酸分子。

3.根据权利要求1所述的系统，其中，各个区域是圆的环形区域。

4.根据权利要求1所述的系统，其中：

所述激发光源包括用于所述阵列中每个区域的激发激光器，并且所述损耗光源包括用于所述阵列中每个区域的损耗激光器，并且

其中，对于所述区域的阵列中的每个区域，所述光学路径用于引导来自相应的激发激光器和损耗激光器的光以产生所述环形区域。

5.根据权利要求4所述的系统，其中，所述一个或更多个检测器包括用于所述区域的阵列中的每个相应区域的检测器。

6.根据权利要求1所述的系统，其中，所述光学路径包括偏转器，以按照时间依赖的方式引导来自所述激发光源的光并且引导来自所述损耗光源的光以产生所述区域的阵列。

7.根据权利要求1所述的系统，其中，所述光学路径包括相位掩模，以将来自所述激发光源的光分成多个激发光束并且将来自所述损耗光源的光分成多个损耗光束以产生所述区域的阵列。

8.根据权利要求1所述的系统，其中，所述光学路径包括波导，以在所述波导内利用来自所述损耗光源的光产生驻波。

9.根据权利要求1所述的系统，其中，所述一个或更多个检测器包括单个检测器以检测来自所述样品的光。

10.根据权利要求9所述的系统，其中，所述单个检测器包括多通道光子检测器。

11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述多通道光子检测器包括CCD图像传感器。

12.根据权利要求1所述的系统，其中，所述区域的阵列中的区域分布在包括多个行和多个列的栅格中。

13.根据权利要求1所述的系统，还包括扫描系统，所述扫描系统被配置为移动所述样品使得所述区域的阵列相对于所述样品移动。

14.一种超分辨率显微系统，包括：

激发光源；

损耗光源；

光学路径，所述光学路径包括产生多个图案化区域的一个或更多个光学组件，其中，每个图案化区域包括来自所述激发光源的激发光和来自所述损耗光源的损耗光；

一个或更多个检测器，所述一个或更多个检测器被配置为接收来自被所述图案化区域照射的荧光团的信号并对所述信号积分，并且产生关于样品上各个点的积分信号；以及

处理器，所述处理器接收来自所述一个或更多个检测器的所述积分信号并且基于所述积分信号确定所述荧光团的荧光。

15.根据权利要求14所述的系统，其中，所述荧光团具有暗态，所述暗态的寿命大于或等于约100ms。

16.根据权利要求14所述的系统，其中，所述荧光团包括具有稳定至少10秒的断开状态的染料。

17.根据权利要求16所述的系统，其中，所述染料包括罗丹明、恶嗪或羰花青染料。

18.根据权利要求14所述的系统，其中，所述图案化区域包括由第二损耗光区域围绕的第一激活光区域。

19.一种执行超分辨率显微术以读取样品的方法，所述方法包括：

通过(i)使用激发光源选择性地激活样品上的荧光团和(ii)使用损耗光源选择性地使所述样品上的荧光团去激活，来产生包括由损耗区域围绕的激活区域的区域的阵列；

使用一个或更多个检测器随时间接收来自所述区域的信号并对所述信号积分；

确定关于所述样品上各个点的积分信号；并且

从所述积分信号确定所述样品上所述各个点的荧光。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述样品是固体支持物上的核酸特征阵列。

21.根据权利要求19所述的方法，其中，各个区域是圆的环形区域。

22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述一个或更多个检测器包括用于所述区域的阵列中的每个区域的检测器。

23.根据权利要求19所述的方法，其中，产生所述区域的阵列包括使用高速偏转器以时间依赖的方式偏转来自所述激发光源和所述损耗光源的光。

24.根据权利要求19所述的方法，其中，产生所述区域的阵列包括将来自所述激发光源的光分成多个激发光束并且将来自所述损耗光源的光分成多个损耗光束。

25.根据权利要求19所述的方法，其中，产生所述区域的阵列包括利用来自所述损耗光的光产生驻波。

26.根据权利要求19所述的方法，还包括在第一方向上跨所述样品扫描所述区域的阵列，并且在相对于所述第一方向非平行的第二方向上跨所述样品扫描所述区域的阵列。

27.一种执行超分辨率显微术以读取样品的方法，所述方法包括：

产生宽场激活照射以激发照射区域内的荧光团；

产生图案化的损耗照射以选择性地使所述照射区域的目标部分中的荧光团去激活；

使用一个或更多个检测器接收来自所述照射区域内的受激发的荧光团的信号并对所述信号积分；

产生关于所述样品上各个点的积分信号；并且

从所述积分信号确定所述样品上所述各个点的荧光。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述荧光团具有暗态，所述暗态的寿命大于或等于约100ms。

29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述染料包括罗丹明、恶嗪或羰花青染料。

30.根据权利要求27所述的方法，还包括使用扫描系统移动所述图案化的损耗照射，使得所述图案化的损耗照射相对于所述样品是静止的。

31.根据权利要求27所述的方法，还包括使用来自所述扫描系统的信息将由所述一个或更多个检测器产生的信号与所述样品上的各个点相关联，使得所述样品上的各个点的积分信号是选择性地积分由所述一个或更多个检测器产生的所述信号的结果，所述一个或更多个检测器接收从所述样品上的所述各个点发射的光。

32.根据权利要求27所述的方法，其中，所述图案化的损耗照射产生零点强度的区域以选择性地使所述目标区域内的荧光团去激活，同时允许所述零点强度的区域内的荧光团保持激活。