CN108572164B - 用于空间上测量纳米级结构的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

一种空间上测量样品中的多个纳米级结构的方法，所述包括步骤：利用荧光标记(1)在不同位置处标记各个结构；将各个结构耦接(2)到各个定位辅助件，所述定位辅助件在样品中的位置是已知的；利用激发光激发荧光标记从而发射荧光，其中，激发光的强度分布具有局部最小值；将局部最小值布置(3)在围绕相应的定位辅助件的位置的近距离范围中的不同位置处，所述近距离范围的尺寸不大于激发光的波长下的衍射极限；针对各个荧光标记以及针对最小值的不同位置单独地记录从样品发射出的荧光；以及从记录的荧光的强度确定各个荧光标记在样品中的位置。

Description

用于空间上测量纳米级结构的方法和设备
技术领域
本发明涉及一种空间上测量样品中的至少一个纳米级结构的方法并且涉及一种用于实施这种方法的设备。
特别地，所述方法包括步骤：用荧光标记在不同位置处标记至少一个纳米级结构；利用激发光激发荧光标记从而发射荧光；记录从样品发射出的荧光；以及从记录的荧光的强度确定各个荧光标记在样品中的位置。
更特别地，本发明涉及一种方法，其中，确定各个荧光标记在样品中的位置以超过激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的精度执行。
背景技术
已知一种被称为MINFLUX显微术的空间上测量样品中的至少一个纳米级结构的方法，其中，以超过激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的精度确定样品中的各个的荧光标记的位置，见Balzarotti F,Eilers Y,Gwosch KC,
Figure BDA0001590902450000011
AH,Westphal V,StefaniFD,Elf J,Hell SW的Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescentmolecules with minimal photon fluxes(《纳米分辨率成像和光子通量最小的荧光分子追踪》)，Science 355，2016年12月22日在线发布。在MINFLUX显微术中，通过以下方式确定各个荧光标记的位置：将激发光的强度分布的零点布置在各个荧光标记的估计位置周围的测量区域的中心处以及在测量区域的边界处围绕中心均匀分布的三个位置处。在该总共四个零点位置处，单独地测量来自相应的荧光标记的荧光的强度，并且从对于零点的不同位置分别记录的各个荧光标记的荧光的强度来确定各个荧光标记的位置。零点的四个位置布置得越紧密且仍跨越了相应荧光标记的目标位置，越能够精确地从针对零点位置中的每一个记录的荧光的仅少许光子确定荧光标记的位置。
在搜索多种物质是否包括具有关于其他物质或生物物体的特定性质的物质的所谓的药物筛选和其它方法中，物质与其它物质或者与物体的多个副本分别接触多次，并且监测其它物质或物体的产生的反应。由于需要多个相同的配对以获得统计学显着的结果，并且另一方面，由于这些物质通常应该显示其相对于不同其它物质或不同生物物质的期望的性质，所以待监测的反应的总数通常等于多个待搜索的物质的数量。一般地，系统地确定数量如此多的反应是费时费力的。通常，分子级别的反应仅可以借助分析反应来确定。从而监测反应动态经常是不可能的。
WO 2014/108455 A1公开了一种对用荧光标记标记的样品的结构执行空间高分辨率成像方法，其中，样品例如在STED荧光显微术中经受激发光和作为荧光抑制光的刺激光，以将样品的面积限界到刺激光的零点的面积，样品的面积可以被分配从样品发射出的并检测到的荧光。为了保护荧光标记免受邻近零点的强度最大值区域内的刺激光的高强度，样品附加地经受激发抑制光，其强度分布具有与刺激光的零点一致的局部最小值。该激发抑制光特别地可以作为关断光，其将激发抑制光的最小值以外的可切换的荧光标记关断为非活跃状态，在该非活跃状态下，它们不能被激发光激发来发射荧光。特别地，荧光标记可以是如高分辨率RESOLFT荧光显微术中所使用的那样的可切换的荧光染料。
DE 10 2016 117 096 A1公开了一种对用荧光标记标记的样品的结构执行空间高分辨率成像的方法，其也是STED荧光显微术法，其中，除了激发光之外，样品还经受作为荧光抑制光的刺激光，以将从样品发射出并记录的荧光被分配到的样品的面积限于刺激光的零点区域。为了保护荧光标记免受邻近的零点的强度最大值的区域中的刺激光的高强度以及导致的光化学漂白的危险，零点仅布置在样品中的尺寸显著小于这些强度最大值的距离的近距离范围中。另外，近距离范围外的样品可以经受关断光，所述关断光将近距离范围外的可切换的荧光标记关断为非活跃状态，在该非活跃状态下，荧光标记不能借助于激发光被激发来发射荧光。特别地，这些荧光标记可以是如高分辨率RESOLFT荧光显微术中所使用的那样的可切换的荧光标记。
还需要一种能够快速地、甚至重复地测量至少一个纳米级结构的方法，例如在由于添加了待搜索的物质之一而改变环境条件这样的药物筛选的情况下所需的那样，记录纳米级结构对变化的环境条件的反应。
发明内容
本发明涉及一种空间上测量样品中的多个纳米级结构的方法。所述方法包括步骤：利用荧光标记在不同位置处标记各个结构；利用激发光激发荧光标记从而发射荧光，其中，激发光的强度分布或者对荧光标记的荧光发射具有影响的另外的光的强度分布包括局部最小值，该局部最小值布置在样品中的不同位置处；针对各个荧光标记以及针对最小值的不同位置单独地记录从样品发射出的荧光；以及从对于相应的荧光标记针对最小值的不同位置记录的荧光的强度，确定各个荧光标记在样品中的位置。所述方法包括另外的步骤：将各个结构耦接到各个定位辅助件，所述定位辅助件在样品中的位置已知，或者在耦接步骤之后从由定位辅助件反射的光确定。此外，激发的步骤包括将局部最小值布置在围绕相应的定位辅助件的位置的近距离范围中的不同位置处，近距离范围的尺寸不大于激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限。
本发明还涉及一种空间上测量样品中的多个纳米级结构的设备，其中，结构中的每一个都耦接到定位辅助件，所述定位辅助件在样品中的位置是已知的，或者从由定位辅助件反射的光确定。设备包括：用于样品的样品保持器；指向样品保持器上的物镜；光源，所述光源将激发光耦入物镜中，使得由物镜聚焦的激发光的强度分布包括局部的最小值，或者所述光源将激发光和对通过荧光标记发射荧光具有影响的另外的光耦入物镜，使得由物镜聚焦的所述另外的光的强度分布具有局部的最小值；扫描仪，所述扫描仪配置为能够使所述最小值的位置相对于样品保持器移动；检测器，其配置为能够针对最小值的不同位置单独地记录从样品发射的荧光；评估单元，其配置为能够根据针对相应的荧光标记针对最小值的不同位置记录的荧光的强度来确定各个荧光标记在样品中的位置；以及控制器，其配置为能够将局部最小值布置在围绕相应的定位辅助件的位置的近距离范围中的不同位置处，近距离范围的尺寸不大于激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限。
本发明还涉及一种空间上测量样品中的纳米级结构的方法。方法包括步骤：利用荧光标记在不同位置处标记结构；在荧光抑制光的强度分布的局部最小值的相应位置处，利用激发光激发荧光标记从而发射荧光，其中，局部最小值布置在样品中的近距离范围中的不同位置处，近距离范围的尺寸不大于激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限；针对各个荧光标记以及针对最小值的不同位置单独地记录从样品发射出的荧光；以及从针对相应的荧光标记针对最小值的不同位置记录的荧光的强度，确定各个荧光标记在样品中的位置。
通过研究以下附图和详细描述，本发明的其它特征和优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见。旨在将所有这些附加特征和优点包括在由权利要求书所限定的本发明的范围内。
附图说明
参考以下附图可以更好地理解本发明。附图中的部件不一定按比例绘制，而是将重点放在清楚地示出本发明的原理上。在附图中，在多个附图之中，相同的参考符号表示相应的部件。
图1是根据本发明的方法的一实施例的流程图。
图2示意性地示出将纳米级结构耦接到定位辅助件的步骤以及纳米结构对添加的物质的反应。
图3说明了在根据本发明的方法的MINFLUX实施例中的激发光的强度分布的最小值相对于定位辅助件的定位。
图4以平面图以及以通过最小值的剖视图示出根据本发明的方法的MINFLUX实施例中的激发光的强度分布。
图5示出具有布置成方形图案的定位辅助件的样品。
图6示意性地示出用于执行根据本发明的方法的设备。
图7以通过最小值的剖视图示出根据本发明的方法的另一实施例中的激发光和荧光抑制光的强度分布；以及
图8是也利用根据图7的强度分布的根据本发明的方法的另一方面的一实施例的流程图。
具体实施方式
根据本发明的空间上测量样品中的多个纳米级结构的方法包括标记、耦接、激发、布置、记录和确定这样的部分重叠的步骤。
在根据本发明的方法中，测量纳米级结构的事实意味着这些结构具有最大200nm、通常最大为100nm、经常最大为50nm或仅30nm的纳米级尺寸。
在标记的步骤中，利用荧光标记在不同的位置处标记各个结构。这意味着根据本发明测量的每个结构利用在不同位置处附着于结构的至少两个荧光标记标出。为了特别地快速地测量所述结构，标记每个结构的荧光标记的数量可以有目的地保持为小的，并且例如可以限制为不大于10个或5个。优选地，在等同的位置处用相同数量的荧光标记标出所有等同的结构。在不同位置处附着于结构的荧光标记可以是等同的或不同的。
在耦接步骤中，各个结构耦接到各个定位辅助件。这意味着依据根据本发明的方法测量的每个结构分别耦接到一个定位辅助件。这些定位辅助件是已知其在样品中的位置的定位辅助件，因为在样品的生产或制备当中，定位辅助件已经被有目的地布置在这些位置处，或者因为定位辅助件在样品中的固定位置已经以某种方式在耦接步骤之前被确定。替代地或附加地，可以连续地确定定位辅助件在样品中的位置，并且进而即使在耦接步骤之后，也可以从由定位辅助件反射的光来确定。利用纳米级结构的上述的最大尺寸，如果耦接在纳米级结构的端部中的一端处，则纳米级结构不从相应定位辅助件延伸超过基本上多于200nm、100nm、50nm或30nm，并且优选在中间耦接的情况下，不超过基本上多于100nm、50nm、25nm或15nm。
在激发的步骤中，利用激发光来激发荧光标记从而发射荧光，利用该荧光标记来标记待测量的结构。此处，激发光的强度分布或者对通过荧光标记发射荧光有影响的另外的光的强度分布具有局部最小值，该局部最小值在激发的步骤中布置在样品中的不同位置处。局部最小值可以是相应强度分布的真实零点，其中，激发光或所述另外的光的强度实际上降低至零。在任一情况下，在局部最小值处仅期望激发光或所述另外的光的低剩余强度。在用根据本发明的方法测量结构的所有空间方向上，局部最小值由相应的强度分布的最大值限界。
在以特殊方式执行激发的步骤的布置步骤中，局部最小值布置在围绕相应的定位辅助件的已知位置的近距离范围中的不同位置处。该近距离范围的尺寸不大于激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限。即使各个定位辅助件在样品中的位置是固定和通常已知的，但是使局部最小值接近这些位置或绕这些位置延伸的近距离范围是可以借助于由定位辅助件反射的光来支持甚或完全控制的。
在记录步骤中，既针对各个荧光标记也针对样品中最小值的不同位置单独地记录从样品射出的荧光。从而，记录的荧光可以相应地分配给特定的荧光标记和样品中最小值的特定位置。
从而，在确定步骤中，能够基于来自相应荧光标记的荧光的仅少量光子，从针对相应的荧光标记针对最小值的不同位置记录的荧光的强度来确定各个荧光标记在样品中的位置。
测量仅利用少量荧光标记来标记的结构特别意味着测量结构处的荧光标记的位置之间的距离。
在根据本发明的方法中，可以利用激发光或者所述另外的光的强度分布的最小值系统地接近围绕定位辅助件的位置的近距离范围，因为开始就已知定位辅助件的位置，或者在不需要从荧光标记发射荧光的光子的情况下确定了定位辅助件的位置。从而，在本发明的方法中，利用预先知晓各个荧光标记的位置，借助于荧光标记来测量各个结构。由于将关注的结构耦接到定位辅助件，所以每个结构以及进而的与结构有关的荧光标记紧邻定位辅助件。从而，当利用激发光或所述另外的光的光强分布的最小值接近围绕该定位辅助件的近距离范围时，该最小值已经接近相应的荧光标记。越准确地知晓定位辅助件的位置，近距离范围就可以越小，在该近距离范围内，激发光或所述另外的光的光强分布的最小值布置在不同位置处，以确定相应的荧光标记的位置。
根据本发明，近距离范围的尺寸不大于激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限，并且通过将局部最小值布置在近距离范围内的不同位置处来扫描近距离范围，即，近距离范围被划分，使得荧光标记的位置可以在近距离范围的尺寸的若干分之一(fraction)的空间分辨率下确定。优选地，其中，围绕相应的定位辅助件的位置在不同位置处布置有局部最小值的近距离范围的尺寸不大于激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的一半、甚至更优选地不大于激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的四分之一。这意味着需要更准确地知道或确定相应定位辅助件的位置。
在根据本发明的方法中，以光的包括局部最小值的增大的强度，以及优选地以近距离范围的相应地较小的尺寸，激发、记录和确定步骤可以至少重复一次。较小的近距离范围可以布置成围绕利用强度分布具有局部最小值的激发光或所述另外的光的先前的强度而确定的相应荧光标记的位置。以该方式，位置确定的精度可以迭代地提高。
根据本发明的方法的其中激发光的强度分布具有局部最小值的实施例可以实现为已知的MINFLUX显微术的实施例。在根据本发明的方法的另一实施例中，对由荧光标记发射荧光具有影响的所述另外的光的强度分布具有局部最小值，在该另一实施例中，激发光的强度分布可以在所述另外的光的强度分布的局部最小值的相应位置处具有最大值，并且所述另外的光可以是抑制由荧光标记发射荧光的荧光抑制光。在根据本发明的方法的该实施例中，激发光和荧光抑制光被叠加成具有如它们还被用于RESOLFT中以及特别地用于STED显微术中那样的强度分布。然而，在根据本发明的方法的该实施例中，不仅仅利用荧光只能来自位于局部最小值的区域的荧光标记。相反，针对相应的荧光标记记录的荧光的强度与荧光标记的位置到局部最小值的位置的距离的相关性还用于以特别高的精度从针对最小值的多个位置记录的荧光的强度确定荧光标记的位置。相应地，即使在本发明的方法的其中所述另外的光的强度分布具有局部最小值的该变型中，局部最小值也可以在样品中定位在如此少数的位置处，并且记录的荧光的强度的评估可以遵循与在MINFLUX显微术中相同的原理。然而，差异在于，在MINFLUX显微术中，来自荧光标记的荧光的强度随着荧光标记的位置相对于局部最小值的位置的距离增大而增大，而在根据本发明的方法的其中所述另外的光是荧光抑制光的实施例中，来自荧光标记的荧光的强度随着该距离增大而减小。
在根据本发明的方法的其中激发光的强度分布具有局部最小值的实施例中，个性化的(individualized)荧光标记仅受到最小光量，因此仅在最小程度上受到光化学胁迫。在其强度分布具有零点的所述另外的光是荧光抑制光的实施例中，荧光抑制光的邻近零点的强度最大值有利地抑制了邻近的另外的荧光标记发射出的荧光对位置确定的干扰。
在执行根据本发明的方法时，已经发现不需要将局部最小值布置在围绕相应的定位辅助件的位置的近距离范围中的许多不同位置处来以与近距离范围的尺寸相比的很高的空间分辨率确定相应的荧光标记的位置。相应地，在根据本发明的方法中，通常从针对不超过4n、通常不超过3n、特别优选不超过2n个最小值的不同位置记录的荧光强度来确定各个荧光标记的位置。此处，n是沿其确定各个荧光标记在样品中的位置的空间方向的数量。
确定各个荧光标记在样品中的位置可以特别地包括将具有局部极值的空间函数拟合到针对各个荧光标记针对最小值的不同位置记录的荧光的强度。在根据本发明的方法的其中激发光的强度分布具有局部最小值的实施例中，空间函数的局部极值也是局部最小值。然而在其强度分布具有零点的所述另外的光是荧光抑制光的实施例中，空间函数的局部极值是局部最大值。
具有局部极值的空间函数理想地在荧光标记到激发光或所述另外的光的强度分布的局部最小值的距离上具有与来自相应的荧光标记的荧光的强度相同的变化特性。从而，可以利用最小值来扫描反射光的定位辅助件中的至少一个或者直接地荧光标记中的至少一个或另外的相似的荧光标记，同时从样品反射的光或者从样品发射出的荧光以时间分辨率记录，以确定具有局部极值的空间函数。此处，扫描意味着与相应的近距离范围中的局部最小值的少量的位置相比，局部最小值大量地小步幅移位。在扫描反射光的定位辅助件中的所述至少一个时，也可以确定定位辅助件在样品中的位置以及进而的相应近距离范围的中心。
为了能够针对标记相应结构的各个荧光标记单独地记录从样品射出的荧光，不同的荧光标记发射的荧光必须是可分离的。此处，因为多个荧光标记分别附着到同一纳米结构使得荧光标记与荧光的波长下的衍射极限相比彼此更近、通常彼此明显更近，所以不能基于从样品发射出荧光的位置而将来自不同的荧光标记的荧光分离。从而，需要具有或提供关于来自各个荧光标记的荧光的其他区分选项。
如果将在不同位置处标记各个结构的荧光标记从在其光谱特性方面不同的荧光标记中选出，则相应结构处的各个荧光标记可选择性地被不同波长的激发光激发，或者可以以波长选择的方式检测其发射出的荧光。此外，还可以从具有活跃状态和非活跃状态并且可以在其活跃和非活跃状态之间转换的荧光标记中选择荧光标记，在所述活跃状态下，荧光标记可以被激发光激发从而发射荧光，并且在所述非活跃状态下，至少利用相同的激发光不能使荧光标记被激发来发射荧光。然后，可选择性地或者基于转换概率，仅一个荧光标记可以相应地留在其活跃状态或者进入其活跃状态，使得在利用激发光激发之后记录的荧光只能来自这一个荧光标记。在基于转换概率的过程中，可以是同一荧光标记重复地进入其活跃状态。然而，随着重复次数的增加，这也变得越来越不可能。
特别地，这样可以从在其激发光谱和其发射光谱中的至少一者方面不同的荧光标记或者能够利用切换光从其活跃状态切换到其非活跃状态的荧光标记中选择荧光标记。切换光通常可以具有与激发光或对荧光标记的荧光发射具有影响的所述另外的光的波长相同的波长。
在根据本发明的方法的实际实现方式中，可以通过与将最小值定位在近距离范围内不同的用于最小值相对于样本的相对运动的其它方式，接近定位辅助件的位置，即近距离范围。这使得能够使用用于在近距离范围内精确定位最小值的装置，所述装置适合于精确定位样本中的最小值，但不适用于在较大距离上移动最小值。可以通过用于接近定位辅助件的位置的装置覆盖这些较大的距离。特别地，用于接近定位辅助件的位置的装置可以使整个样品相对于将激发光聚焦到样品的物镜移动，而最小值利用使光束相对于物镜偏转的光束偏转装置在相应的近距离范围内移动。
在根据本发明的方法中，定位辅助件的位置优选地固定在样品中，并且进而相对于样品的固定点固定，并且定位辅助件的位置、即各个近距离范围相对于样品的固定点被接近。
有利地，由于结构耦接到定位辅助件，所以结构不只是进入已知位置或进入能够在不胁迫荧光标记的情况下即可确定的位置，而是结构还以限定的方式定向，即例如与相应的样品的主尺度平面平行。该朝向特别地具有如下目的：使结构相对于样品定向成使得荧光标记的距离或者结构被荧光标记所标记的不同位置的距离布置在下述方向上或下述平面中或者布置成平行于下述方向或下述平面，在所述方向上或所述平面中，局部最小值布置在样品中的不同位置处。从而，通过确定各个荧光标记的位置，特别容易地记录这些距离以及这些距离的变化。即使耦接至定位辅助件的结构的这种有目的性的定向是不可能的，通常也可以实现使耦接到定位辅助件的结构在样品内具有固定的取向。然后，在第一次确定荧光标记的位置之后，可以检查哪些结构定向成使得它们的用荧光标记标记的区域的距离在样品的主尺度平面上延伸。在重复地执行荧光标记的位置的确定以例如记录结构对变化的环境条件的反应时，本发明的方法然后可以限定于具有期望的朝向的那些结构，而不具有该朝向的其它结构不再被考虑。这特别适于快速记录关于结构对变化的环境条件的反应的重要信息。
此外，优选的是，以最小距离布置定位辅助件的位置，该最小距离是激发光和荧光的波长下的衍射极限的长度的至少两倍。然后，来自样品的荧光可以单独地通过光学器件分配到各个近距离范围，并且从而分配到各个待测量的纳米级结构。如果将定位辅助件的位置自行限定为例如它们在样品中布置成预定图案，则直接保持了作为激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的两倍的所述最小距离。然而，如果定位辅助件在样品中随机分布，则需要注意借助于定位辅助件的低密度来使定位辅助件的距离不小于激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的两倍。通常，这需要比激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的两倍的倒数值小得多的密度。替代地或附加地，可以针对定位辅助件之间存在的距离检查定位辅助件。然后，当进一步执行根据本发明的方法时，可以忽略被认为彼此位置过于接近的定位辅助件以及耦接至这些定位辅助件的纳米级结构。
如果定位辅助件的位置在样品中布置成预定图案，则预定的图案可以特别地从循环性的(periodical)图案中和更特定地从六边形和正方形图案中选择。然后当执行根据本发明的方法时待接近的近距离范围也布置在这样的循环性的、六边形的或正方形图案中。在六边形图案中，保持最小距离为激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的两倍的定位辅助件的密度被最大化。
在根据本发明的方法的实施例中，对荧光标记的荧光发射有影响的所述另外的光的强度分布是荧光抑制光并具有局部最小值，并且激发光的强度分布在所述另外的光的强度分布的局部最小值的相应的位置处具有最大值，目前而言，借助于根据本发明的方法的该实施例，公开了如在RESOLFT中以及特别是在STED显微术中的类似程序，这是本发明的另一个方面，其与空间上测量多个纳米级结构的步骤、将各个结构耦接到各个定位辅助件的步骤以及将局部最小值布置在特别地位于围绕相应的定位辅助件的位置的近距离范围中不同位置处的步骤无关。
在该另一方面中，本发明与RESOLFT和STED显微术的不同之处在于，有目的地确定各个荧光标记的位置，为此目的，荧光标记常常首先被个性化，并且通常通过拟合包括局部最大值的函数来评估针对局部最小值的少量的不同位置记录的荧光的强度。在此，可以将拟合函数的局部最大值的位置作为样品中的荧光标记的搜索位置。与MINFLUX显微术中的相应过程相比，本发明的该另一方面的优点在于邻近零点的荧光抑制光的强度最大值有利地抑制了由布置在附近的其他荧光标记发射的荧光干扰位置确定。此外，本发明的该另一方面可以包括或者可以不包括在此公开的根据本发明的方法的所有其他特征。
在本发明的该另一方面中，激发光的强度分布优选地在荧光抑制光的强度分布的零点或局部最小值的相应位置处具有最大值。从而，激发光集中到荧光抑制光的强度分布的局部最小值的区域，即使其最大值由于衍射极限而具有比局部最小值的可能的尺寸更大并且比根据本发明的方法中对于局部最小值通常实施的尺寸更大的尺寸。
在本发明的另一方面中，荧光抑制光可以特别地为STED或刺激光，其通过在荧光标记可发射可被记录的荧光之前刺激荧光标记从而受激发射，去激由激发光激发的荧光标记物。然而，在根据本发明的该另一方面中，不仅仅利用了荧光可以仅来自位于荧光抑制光的局部最小值的区域中的荧光标记。相反，还使用针对相应荧光标记记录的荧光的强度与其位置到局部最小值的位置的距离的相关性，以特别高的精度从针对最小值的多个位置记录的荧光的强度确定其位置。在本发明的该另一方面中，最小值可以相应地布置在样品中的尽可能少的位置处，并且可以根据与在MINFLUX显微术中基本相同的原理，执行对所记录的荧光强度的评估。然而作为重要的区别，在MINLUX显微术中，来自相应荧光标记的荧光的强度随着其位置到局部最小值的位置的距离的增大而增大，而在根据本发明的方法中来自相应荧光标记的荧光的强度随着其位置到局部最小值的位置的距离的增大而减小。
目前而言，本发明的该另一方面与RESOLFT并且特别地与STED显微术重叠，但其与RESOLFT和STED显微术的不同之处在于为了有目的地确定各个荧光标记的位置，通常首先将荧光标记个性化，并且在于针对局部最小值的少量不同位置记录的荧光的强度仅针对位置确定进行评估：该位置确定通常包括拟合包括局部最大值的函数。拟合函数的局部最大值的位置可以作为样品中的荧光标记的位置。
与MINFLUX显微术中的过程相比，本发明的该另一方面的优点在于，由于荧光抑制光的强度最大值临近其零点，所以位于附近的荧光标记发射的荧光不干扰位置确定。
在本发明的该另一方面的实施例中，通过MINFLUX显微术附加地确定各个荧光标记的位置。这意味着附加地执行以下步骤：利用激发光来激发荧光标记以发射荧光，其中，激发光的强度分布具有布置在样品中的不同位置处的局部最小值；针对各个荧光标记并且针对激发光的强度分布的最小值的不同位置单独地记录从样品发射出的荧光；并且针对激发光的强度分布的最小值的不同位置，根据为相应的荧光标记确定的荧光的强度来确定各个荧光标记在样品中的位置。
在本发明的另一方面的该实施例的附加步骤中，能够接近与激发光的强度分布的最小值相同的位置，同时在之前或之后接近与荧光抑制光的强度分布的最小值相同的位置。然而，这仅是一种选择。
在本发明的另一方面的该实施例的附加步骤中，各个荧光标记仅经受最小光量，并且从而仅经受最小限度的光化学胁迫。
此外，在本发明的另一方面的该实施例中，由各个荧光标记发射的离开样品的荧光的互补强度曲线(complementary intensity course)可以在确定各个荧光标记在样品中的位置时相互比较，一方面，这在荧光抑制光的强度分布的最小值的不同位置之上形成并且另一方面在样品中的激发光的强度分布的最小值的不同位置之上形成。通过考虑到互补强度曲线，如果，可以以与在仅仅单独评估两个强度曲线的情况下基于两个强度曲线相比更高的精度来确定相应的荧光标记在样品中的位置。
此外，在本发明的另一方面的该实施例中，从针对荧光抑制光的强度分布的最小值的不同位置对相应的荧光标记记录的荧光的强度来确定的各个荧光标记在样品中的位置，可在限定之后布置激发光的强度分布的另外的最小值的位置，反之亦然。在越来越精确地迭代地确定各个荧光标记的位置时，可以在STED和MINFLUX群集(constellation)之间逐步改变。
在激发光或对荧光标记的荧光发射具有影响的所述另外的光的强度分布具有局部最小值的根据本发明的方法的所有方面中，可以以修改的形式应用WO 2014/108455 A1中已知的保护目前未测量的荧光标记免受与邻近局部最小值的最大值的区域中的高强度的概念。特别地，在将局部最小值布置在相应的近距离范围中之前，附加的关断光以如下强度分布被引导至样品：其将样品的与近距离范围临近的部分区域内的可切换的荧光标记物关断到非活跃状态。从而，荧光标记被切换为非活跃状态，在该状态下，激发光或所述另外的光的最大值出现，并且在没有该保护性措施的情况下，荧光标记将受到激发光或所述另外的光的高强度的胁迫，从该状态，它们将仅发射影响当前测量的荧光。样品中的纳米级结构的绝对密度在此可特别地高，而不需要测量必然对它的相邻纳米级结构进行光化学胁迫(stress)的每个纳米级结构，并且没有来自纳米级结构的荧光干扰当前的测量。
在根据本发明的方法的实际应用中，定位辅助件可以作为固定在样品中并且可以在样品中布置成预定图案的结构的耦接位点。特别地，结构可以经由免疫反应耦接到耦接位点。此处，在应用根据本发明的方法之前，首先可以将另外的荧光标记耦接到其荧光可以用于确定耦接位点的位置这样的耦接位点。此处，来自所述另外的荧光标记的荧光的非常多的光子可以用于以非常高的精度确定耦接位点的位置。之后，当在根据本发明的方法的接下来的应用中将纳米级结构耦接时，这些另外的荧光标记可以从位置已知的耦接位点释放。
然而，如果纳米级结构在已知其位置之前耦接到定位辅助件，则将提供确定定位辅助件的位置而不必使用来自纳米级结构处的荧光标记的荧光的可能性。为此目的，定位辅助件可以包括反射光的金或银颗粒或者量子点，借助于所述光可以以高精度确定定位辅助件的位置。
在根据本发明的方法的一个实施例中，测量的纳米级结构是等同的或者至少包括多个等同的结构。这些等同的结构可以在样品的不同区域中经受不同的环境条件，以测量环境条件对纳米级结构的影响。特别地，可以测量得到的荧光标记在纳米级结构处的空间距离或相对布置。
此外，可以针对不同的至少两个时间点从针对这至少两个时间点记录的荧光的强度来确定各个荧光标记在样品中的位置，以例如测量结构对变化的环境条件的反应，或除此之外，还测量这些反应的动态。为此目的，结构可以在这至少两个时间点时经受不同的环境条件，或者所述至少两个时间点可以跟在环境条件的改变之后。
最后描述的根据本发明的方法的实施例特别地使得能够执行药物筛选，其中，通过添加待搜索的物质之一来调节变化的环境条件。通过重复地根据本发明测量结构而直接记录结构对相应物质的添加的反应。不需要在纳米级结构处执行分析反应。此外，在根据本发明的这种药物筛选中花费的待搜索物质的量很小。理论上，将每种物质的单个分子添加到纳米级结构之一就足够了。相应地，即使只有少量可用的物质也可以在根据本发明的药物筛选中进行检查。
在受到已知PAINT(用于纳米级拓扑成像的点积累)概念启发的根据本发明的方法的实施例中，从在样品中可移动并且在不同位置处单独附着于结构的荧光标记选择荧光标记。这些荧光标记以使得它们相继地单独附着到结构这样的浓度和这样的空间分布添加至样品。当它们附着到结构时，根据本发明来确定它们的位置。因此，在本发明的该实施例中，使用与PAINT概念中相同的荧光标记的个性化。相应地，对于PAINT概念已知的这种个性化的所有变体也可以用于根据本发明的方法的该实施例中。从而，荧光标记可以从非活跃状态转换到活跃状态，在所述非活跃状态下，它们不可被激发光激发来发射荧光，在所述活跃状态下，它们可以激发光激发从而发射荧光。这种转换可能是由于荧光标记附着至结构。替代地或附加地，荧光标记可以仅暂时地附着于结构，或者荧光标记永久地或至少长时间地转换到暗状态，在暗状态下，由于激发光和荧光抑制光中的至少一者的长时间的影响，荧光标记不干扰相应的纳米级结构的另外的测量。
根据本发明的用于空间上测量样品中的多个纳米级结构的设备，其中，结构中的每一个都耦接到定位辅助件，该定位辅助件在样品中的位置是已知的或者是可以从定位辅助件反射的光而确定的，所述设备包括以下部件：
-用于样品的样品保持器；
-指向样品保持器的物镜；
-光源，该光源将激发光和对荧光标记的荧光发射具有影响的可选的另外的光耦接到物镜使得借助于物镜聚焦的激发光或同时聚焦的所述另外的光的强度分布具有局部最小值；
-扫描单元，其配置为能够使最小值的位置相对于样品保持器移位，
-检测器，其配置为能够分别针对最小值的不同位置记录从样品发射的荧光；
-评估单元，其配置为能够根据针对最小值的不同位置针对相应的荧光标记记录的荧光的强度来确定各个荧光标记在样品中的位置；以及
-用于自动执行根据本发明的方法的控制器。
现在详细参考附图，图1中以流程图描绘的根据本发明的方法从用荧光标记在不同位置标记1纳米级结构的步骤开始。这意味着每个纳米级结构用一个荧光标记在所选择的至少两个位置中的每一个处被标记，并且在具有等同结构的情况下所述位置也等同。如果荧光标记具有它们可以在其间转换的活跃和非活跃状态，或者它们在其关于激发光和荧光中的至少一个的光谱特性方面不相同，荧光标记可被所述激发光激发从而发射荧光，荧光标记在激发之后发射所述荧光，那么附着在相应结构的不同位置处的荧光标记可以是相同的。
在图1中示出了作为标记1的步骤之后的步骤的将纳米级结构耦接2至定位辅助件的步骤。然而，将结构耦接2至定位辅助件的步骤可以在标记1结构的步骤之前。此外，可以同时执行标记1的步骤和耦接2的步骤。在任意情况下，在标记1的步骤和耦接2的步骤之后，存在分别标记了多次并且单独地耦接至各个定位辅助件的纳米级结构。此处，定位辅助件在样品中的位置是已知的——这意味着它们是固定的，或者可以从定位辅助件反射的光确定，因为定位辅助件例如包括金或银颗粒或量子点。因此可以进行定位辅助件的位置的该确定，而无需通过激发和发射荧光来胁迫荧光标记。只要它们的实际位置始终是可确定的，则定位辅助件还可不在样品内被固定而是可在样品内移动。然而，在定位辅助件在样品中的位置不固定的情况下，更难以确保定位辅助件在样品中的距离不小于激发光和荧光的波长下的衍射极限的两倍，以能够将源自荧光标记的荧光在各个结构处始终确定地分配给某个定位辅助件并因此分配给与所述定位辅助件连接的结构。
在将光的强度分布的局部最小值布置3在相应的定位辅助件的近距离范围中的不同位置处的步骤中，光的强度分布可以特别地是激发光的强度分布。如果该强度分布的局部最小值布置在相应的定位辅助件的近距离范围中，则处于其活跃状态并且能够借助于激发光被激发的荧光标记发射荧光。此处，荧光的强度取决于相应的荧光标记到强度分布的局部最小值的距离。如果执行记录4所发射的荧光的步骤，使得针对荧光标记中的每一个单独地记录荧光，则因为来自不同荧光标记的荧光由于不同的波长而可以区分开，或者一次仅荧光标记中的一个是活跃的，所以可从针对最小值的不同位置记录的来自相应的荧光标记的荧光的强度来确定5各个荧光标记的位置。此处，在荧光的相同数量的光子被记录的情况下，确定5的步骤的精度取决于局部最小值的位置与荧光标记的位置已经有多接近。由于在布置3的步骤中局部最小值的位置布置在相应的定位辅助件的近距离范围内，耦接的结构和附着于该结构的荧光标记也位于所述近距离范围内，所以在确定5荧光标记的位置的步骤中的相对精度取决于该近距离范围的尺寸。
如果非常精确地、例如至少以±40nm或±20nm或±10nm或±5nm已知定位辅助件的位置，并且如果执行将结构耦接2到定位辅助件的步骤，使得结构具有到相同顺序的定位辅助件的位置的最大距离，则相应的定位辅助件的其中布置有最小值的位置的近距离范围可以相应地保持较小。如果已经确定了相应的结构被标记的所有荧光标记的位置，其中，荧光标记相对于彼此的相对位置、即它们的距离是特别重要的，则测量相应的结构。该测量可以在改变6结构的环境条件的步骤之后或期间重复。此处，样品中所有结构的环境条件可以以相同的方式改变。以该方式，例如，可以记录不同的纳米级结构对环境条件的相同的变化的反应。替代地，改变6环境条件的步骤可以在样品的不同区域中不同地执行，并且从而针对相同结构以不同方式执行。例如，可以将不同的物质在样品的不同区域中添加到相同结构以记录结构对物质的不同反应。例如，这可以在药物筛选中执行。与样品中的结构等同或者不同无关，在改变6结构的环境条件的改变步骤之后进行通过执行布置3、记录4和确定5的步骤的新的结构测量。
图2(a)非常示意性地示出了纳米级结构7的示例，纳米级结构7相应地在其两个端部中的每一个处用荧光标记8或9标记。荧光标记8和9可以不同地描绘。如已经解释的那样，荧光标记也可以相同，只要它们可以在活跃状态和非活跃状态之间转换。这例如可以借助于附加的切换光来实现，该切换光将荧光标记8和9根据转换概率转换成它们的活跃或非活跃状态，使得通过重复施加切换光，实现一次只有一个荧光标记8和一次只有另一个荧光标记9活跃的切换状态。此外，中心耦接点10形成在结构7处。耦接点10设计成用于耦接至定位辅助件12的相应耦接位点11。
图2(b)示出了耦接到定位辅助件12的耦接位点11的耦接点10，定位辅助件12在此仅由相对于样本13的其余部分固定的耦接位点11组成。
另一方面，图2(c)示出了经由耦接点10耦接到定位辅助件12的结构7，定位辅助件12除了耦接位点11之外还包括金颗粒14，借助由所述金颗粒14反射的光，甚至可以确定定位辅助件12在相应的样品中的位置改变，而无需通过用激发光激发和发射荧光来胁迫荧光标记8和9。
图2(d)示出了耦接到根据图2(c)的定位辅助件12的结构7，结构7由于作为结构7的改变的环境条件的一个示例的物质15的影响而改变。特别地，该改变包括结构7的端部折叠在一起，使得附着至所述端部的荧光标记8和9的距离减小。从而可以通过测量荧光标记8和9之间的距离而直接记录结构7对物质15的反应。
图3沿着与结构7的两端之间的距离垂直的观察方向示出结构7和定位辅助件12，其中，除了根据图2(d)的减小的距离16之外，还描绘了具有根据图2(c)的伸展的结构7的起始距离17。此外，在图3中描绘了围绕定位辅助件12的已知的或先前确定的位置19的近距离范围18。用于激发相应的活跃的荧光标记8、9的激发光的强度分布的局部最小值在四个不同位置20至23处布置在该近距离范围内，其中，位置20与定位辅助件12的位置19重合，并且位置21至23等距离地布置在围绕位置19、20的圆上。对于每个位置20至23，单独地记录来自相应的荧光标记8、9的荧光。然后，可从记录的荧光的强度非常精确地确定相应的荧光标记8、9在近距离范围中的位置。确定的精度取决于近距离范围的尺寸，即取决于近距离范围的直径，所述尺寸可以仅是图3的尺寸的一半。然而，这将要求以极高的精度知晓定位辅助件12的位置19，并且所述位置19实际上与结构7的中心重合。为了补偿在此出现的不精确度和变体，近距离范围18需要被选择为比其在理想的边界条件下所需呈现的更大。
图4以具有图3的观察方向的平面图(a)和正交于所述观察方向的通过局部最小值26的剖视图(b)，示出了激发光25的具有中心局部最小值26的强度分布24。局部最小值26在各侧处被强度分布的最大值27包围。在局部最小值26中，激发光25的强度理想地降低至零。随着到最小值26的距离增大，强度I在强度I在环状最大值27中达到其最大值之前，首先二次地增加。在根据本发明的方法中，在直接围绕最小值26的区域中，强度I二次地增加，使得由相应的荧光标记发射的并且被记录的荧光的强度能够对荧光标记至最小值26的距离有肯定结论，该强度分布24中的直接围绕最小值26的区域被利用。从针对最小值26在相应近距离范围中的多个位置确定的多个这样的距离，例如通过三角测量或甚至更优地通过将具有局部最小值的函数拟合到针对最小值的各个位置记录的荧光的强度，可以由此确定荧光标记的精确位置。
待拟合至针对最小值的各个位置记录的荧光的强度的具有局部最小值的空间函数表述了荧光的强度与相应的荧光标记到局部最小值26的距离的相关性。相应地，可以通过扫描相同或相似的荧光标记或者甚至具有相同有效截面的反射光的定位辅助件来确定该函数。此处，扫描意味着局部最小值确实以小步距移位，例如以至少5×5步距或10×10步距移位，以确定二维函数的变化特性。
图5示出用于进行根据本发明的方法的药物筛选实施例的样品13。样品13在其外周28处具有用于将样品13布置在样品保持器上的固定点29。多个定位辅助件12及其位置19相对于固定点29被布置成二次图案。每个定位辅助件12都位于样品13的凹陷或所谓的孔30中。相应地布置成行31和列32的孔30使得能够将物质选择性地添加到耦接至位于样品13的相应的孔30中的定位辅助件12的结构。从而，可记录等同或不等同的结构对不同物质的反应。为此目的，在添加物质之前和之后以及可选地还在添加物质期间依据根据本发明的方法测量结构，其中，根据图4的强度分布24的最小值26的位置分别直接地布置在围绕定位辅助件的相应的位置19的近距离范围18中。从而，能够以高速、以每个荧光标记发射的少量的光子但仍然以高精度记录相应结构的反应。
图6示出用于执行根据本发明的方法的设备33。设备33包括用于样品13的样品保持器34，样品13通过该样品保持器34相对于基部35可移动，以将样品13相对于设备33的另外的基部固定的部件定位。该定位特别地用于接近围绕相应的定位辅助件的相应的近距离范围18。特别地，相对于通过物镜36聚焦至样品中的激发光25的强度分布进行定位。通过光源37提供激发光25，使得在借助物镜36聚焦时在样本13中调整根据图4的强度分布。为此目的，除了激光器38之外，光源37还包括光束成形装置39，例如呈所谓的简易STED(easySTED)波片的形式的光束成形装置39。还设计为扫描仪的扫描单元40设置成能够使样品中的最小值26在相应的近距离范围18内移位。布置在光源37与扫描单元40之间的二色分光镜41将来自样品13的荧光42耦出到共焦检测器42。控制器43控制设备33，以用于特别是在药物筛选中自动地执行根据本发明的方法。此处，设备33还可以包括图6中未示出的附加装置，以将不同的物质添加到各个孔30中。控制器43包括评估单元44，评估单元44从针对相应的荧光标记针对最小值的不同位置记录的荧光的强度来确定各个荧光标记在样品中的位置。
图7示出根据本发明的方法的另一实施例，其中，不是激发光25的强度分布24具有局部最小值26，而是呈荧光抑制光46的形式的另外的光49的强度分布48具有局部最小值26。此处，强度分布48的由强度最大值27包围的最小值26相对于强度分布24的局部最大值47同心地布置。这得到了由相应荧光标记发射的荧光42在荧光标记到局部最小值26的距离上的空间受限的强度分布50。从具有荧光抑制光46在最大值27中的极高强度的强度分布48得到图7中描绘的强度分布50。换言之，图7中的强度分布48以强烈缩小的比例描绘。利用强度分布50，能够从针对局部最小值26的不同位置记录的荧光42得出关于发射荧光42的各个荧光标记的位置的结论。为此目的，在再现强度分布50时具有局部最大值的空间函数可以拟合于记录的荧光的强度。空间函数还可以通过利用局部最小值26扫描相应的荧光标记、相似的荧光标记或者具有相同的有效截面的定位辅助件并且记录从样品发射出的荧光42来确定。
在图8中以流程图描绘的根据本发明的方法的另一方面中，使用与图7所示的相同的强度分布24和48。在该另一方面中，根据本发明的方法在不同位置处利用荧光标记标记101至少一个纳米级结构的步骤开始。这意味着所述至少一个纳米级结构利用荧光标记在至少两个选择的位置中的每一个处被标记。如果荧光标记具有它们可以在其间转换的活跃和非活跃状态，或者荧光标记在其对于激发光和荧光中的至少一种的光谱特性方面不相同，所述激发光可激发荧光标记以发射荧光，荧光标记在激发之后发射所述荧光，则附着在所述至少一个结构的不同位置处的荧光标记可以是相同的。
在图1中示出作为标记101的步骤之后的步骤的将所述至少一个纳米级结构耦接2至定位辅助件的步骤。然而，将所述至少一个结构耦接102至定位辅助件可以在标记101结构的步骤之前。此外，可以同时执行标记101的步骤和耦接102的步骤。另外，在根据本发明的方法的该另一方面中甚至可以避免耦接102的步骤。如果执行耦接102的步骤，则在标记101的步骤和耦接102的步骤之后，所述至少一个结构被标记多次并且耦接到定位辅助件。定位辅助件在样品中的位置可以是已知的——这意味着它是固定的，或者定位辅助件在样品中的位置可以从由定位辅助件反射的光来确定，因为例如定位辅助件包括从金或银颗粒或者量子点选择的光反射颗粒。因此可以执行定位辅助件的位置的确定，而无需通过激发和发射荧光来胁迫荧光标记。
在利用激发光激发103荧光标记从而发射荧光的步骤中，在将荧光抑制光的强度分布的局部最小值布置在定位辅助件的近距离范围中的不同位置处时，激发光25的强度分布24可以在荧光抑制光46的强度分布48的局部最小值的相应位置处具有最大值。如果荧光抑制光的强度分布的局部最小值和激发光的强度分布的最大值一起布置在相应的定位辅助件的近距离范围中，则处于荧光标记的活跃状态并且可以被激发光激发的荧光标记发射荧光。此处，荧光的强度取决于相应的荧光标记到荧光抑制光的强度分布的局部最小值的距离。
如果执行记录104发射的荧光的步骤，使得针对荧光标记中的每一个单独地记录荧光，则因为来自不同荧光标记的荧光可以由于不同的波长而区分开，或者因为仅荧光标记中的一个是活跃的，所以可执行从来自相应的荧光标记的针对最小值的不同位置的荧光的强度来确定105各个荧光标记的位置。在记录的荧光的光子数量相同的情况下，该确定105的步骤的精度取决于局部最小值的位置与相应荧光标记的位置有多接近。由于在布置3的步骤中局部最小值的位置布置在定位辅助件的近距离范围内，耦接的结构和附着的荧光标记也位于所述近距离范围内，所以在确定5荧光标记的位置的步骤中的相对精度取决于该近距离范围的尺寸。
如果非常精确地已知定位辅助件的位置，并且如果执行将所述至少一个结构耦接102到定位辅助件的步骤，使得结构具有到相同顺序的定位辅助件的位置的最大距离，则相应的定位辅助件的其中布置有最小值的位置的近距离范围可以相应地保持较小。如果已经确定了所述至少一个结构被标记的所有荧光标记的位置，则测量相应的结构。该测量可以在改变6所述至少一个结构的环境条件的步骤之后或期间重复，这是根据本发明的方法的该另一方面中的可选步骤。
可以对本发明的优选实施例进行许多变化和修改，并不在实质上偏离本发明的精神和原理。所有这种修改和变化旨在被包括在如以下权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (27)

1.一种空间上测量样品(13)中的多个纳米级结构的方法，所述方法包括步骤：
-利用荧光标记(8、9)在不同位置处标记(1)各个结构；
-利用激发光(25)激发荧光标记(8、9)从而发射荧光(42)，其中，
-激发光(25)的强度分布(24)
-或者对通过荧光标记(8、9)发射荧光具有影响的另外的光的强度分布(48)
包括局部的最小值(26)，所述最小值布置在样品(13)中的不同位置处；
-既针对各个荧光标记(8、9)也针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)单独地记录样品(13)发射出的荧光(42)；以及
-从针对相应的荧光标记(8、9)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光(42)的强度，确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置，
-其中，所述方法包括将各个结构(7)耦接(2)到各个定位辅助件(12)的另外的步骤，所述定位辅助件在样品(13)中的位置是
-已知的，或者
-在耦接(2)的步骤之后从由定位辅助件(12)反射的光确定，以及
-其中，激发的步骤包括将局部的最小值(26)在不同位置(20、21、22、23)处布置(3)在近距离范围(18)中，所述近距离范围围绕相应的定位辅助件的位置(19)，近距离范围(18)的尺寸不大于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，近距离范围(18)的尺寸不大于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限的一半或四分之一。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，从荧光(42)的强度确定各个荧光标记(8、9)的位置，针对最小值(26)的不超过4n、不超过3n或者不超过2n个不同位置(20、21、22、23)记录所述荧光(42)的强度，其中，n是下述空间方向的数量，在所述空间方向上确定各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置的步骤包括：将包括局部极值的空间函数拟合到针对相应的荧光标记(8、9)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光的强度，其中，所述空间函数表述荧光的强度与相应的荧光标记(42)到局部最小值(26)的距离的相关性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，通过利用最小值(26)扫描：
-反射光的所述定位辅助件(12)中的至少一个、
-荧光标记(8、9)中的至少一个、或
-另外的荧光标记，
以及在扫描时利用时间分辨率记录(4)从样品(13)反射出的光或者从样品(13)发射出的荧光(42)，确定包括局部极值的所述空间函数。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，从以下中选择在不同位置处标记各个结构(7)的荧光标记(8、9)：
-在从荧光标记(8、9)的激发光谱和发射光谱中选择的光谱特性方面不相同的荧光标记(8、9)；以及
-具有活跃状态和非活跃状态并且能够利用切换光在荧光标记的活跃和非活跃状态之间转换的荧光标记(8、9)，在活跃状态下，荧光标记能够被激发光(25)激发从而发射荧光(42)，在非活跃状态下，至少利用相同的激发光(25)，荧光标记不能被激发来发射荧光(42)。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于用于将最小值(26)定位在近距离范围(18)内的方式而言，通过另外的用于使最小值(26)相对于样品(13)相对运动的方式，使最小值(26)接近定位辅助件的位置(19)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，定位辅助件的位置(19)相对于样品(13)的固定点(29)固定，相对于样品(13)的所述固定点(29)使最小值(26)接近定位辅助件的位置(19)。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，定位辅助件的位置(19)布置成：
-使得定位辅助件的位置之间相距的最小距离不小于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限的两倍，以及
-在样品(13)中呈从循环性图案、六边形图案和方形图案中选择的预定图案。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，样品(13)中的定位辅助件(12)是固定的耦接位点(11)，结构(7)经由免疫反应被耦接到所述耦接位点(11)。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，定位辅助件(12)包括从金颗粒(14)、银颗粒和量子点中选择的光反射体。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，结构(7)包括等同的结构(7)，所述等同的结构(7)在样品(13)的不同区域中经受不同的环境条件。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中，针对不同的至少两个时间点从针对所述至少两个时间点记录的荧光(42)的强度确定各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置，
-结构(7)在所述至少两个时间点经受不同的环境条件，或者
-所述至少两个时间点跟随在结构(7)经受的环境条件的改变之后。
14.一种用于空间上测量样品(13)中的多个纳米级结构的设备，其中，结构(7)中的每一个都耦接到定位辅助件(12)，所述定位辅助件在样品(13)中的位置是已知的或者从定位辅助件(12)反射的光确定，所述设备包括：
-用于样品(13)的样品保持器(34)；
-指向样品保持器(34)的物镜(36)；
-光源(37)，该光源
-或者将激发光(25)耦入物镜(36)中，使得由物镜(36)聚焦的激发光(25)的强度分布包括局部的最小值(26)，
-或者将激发光(25)和对通过荧光标记(8、9)发射荧光(42)具有影响的另外的光耦入物镜(36)，使得由物镜(36)聚焦的所述另外的光的强度分布具有局部的最小值(26)，
-扫描仪(40)，所述扫描仪配置为能够使最小值的位置(20、21、22、23)相对于样品保持器(34)移动；
-检测器(45)，所述检测器配置为能够针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)单独地记录从样品(13)发射出的荧光(42)；
-评估单元(44)，所述评估单元配置为能够从针对相应的荧光标记(8、9)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光(42)的强度，确定各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置；以及
-控制器，所述控制器配置为能够将局部的最小值(26)在不同位置(20、21、22、23)处布置(3)在近距离范围(18)中，所述近距离范围(18)围绕相应的定位辅助件的位置(19)，近距离范围(18)的尺寸不大于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限。
15.一种空间上测量样品(13)中的纳米级结构的方法，所述方法包括步骤：
-利用荧光标记(8、9)在不同位置处标记(1)结构；
-在荧光抑制光(46)的强度分布(48)的局部的最小值的相应的位置处，利用激发光(25)激发荧光标记(8、9)从而发射荧光(42)，其中，局部的最小值(26)布置在样品(13)的近距离范围(18)中的不同位置处，所述近距离范围(18)的尺寸不大于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限；
-针对各个荧光标记(8、9)并且针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)单独地记录(4)从样品(13)发射出的荧光(42)；以及
-从针对相应的荧光标记(8、9)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光(42)的强度，确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述激发光(25)的强度分布(24)在荧光抑制光(46)的强度分布(48)的局部的最小值的相应的位置处具有最大值。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，近距离范围(18)的尺寸：
-不大于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限的一半或四分之一，以及
-不大于相应的荧光标记(8、9)发射的荧光(42)在荧光标记到局部的最小值(26)的距离上的强度的分布(50)的半极大处全宽度或者半极大处全宽度一半或四分之一。
18.根据权利要求15或16所述的方法，其中，从针对最小值(26)的不超过4n、不超过3n或者不超过2n个不同位置(20、21、22、23)记录的荧光(42)的强度，确定各个荧光标记(8、9)的位置，其中，n是下述空间方向的数量，在所述空间方向上确定各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置。
19.根据权利要求15或16所述的方法，其中，确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置的步骤包括：将包括局部最大值的空间函数拟合到针对相应的荧光标记(42)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光的强度，其中，所述空间函数表述荧光的强度与相应的荧光标记(42)到局部最小值(26)的距离的相关性。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，包括局部最大值的空间函数通过如下确定：
-利用最小值(26)扫描荧光标记(8、9)中的至少一个或另外的荧光标记，并且在扫描的同时利用时间分辨率记录(4)从样品(13)发射的荧光(42)；以及
-仅利用激发光(25)的最大值附加地扫描所述至少一个或者所述另外的荧光标记(8、9)，并且在扫描的同时利用时间分辨率记录(4)从样品(13)发射的荧光(42)。
21.根据权利要求15或16所述的方法，其中，利用荧光抑制光(46)的增大的强度至少重复一次激发、记录(4)和确定(5)的步骤。
22.根据权利要求15或16所述的方法，其中，从以下选择在不同位置处标记结构(7)的荧光标记(8、9)：
-在从荧光标记(8、9)的激发光谱和发射光谱中选择的光谱特性方面不相同的荧光标记(8、9)；以及
-具有活跃状态和非活跃状态并且能够利用切换光在荧光标记的活跃和非活跃状态之间转换的荧光标记(8、9)，在活跃状态下，荧光标记能够被激发光(25)激发从而发射荧光(42)，在非活跃状态下，至少利用相同的激发光(25)，荧光标记不能被激发来发射荧光(42)。
23.根据权利要求15或16所述的方法，其中，在针对各个荧光标记(8、9)单独地记录(4)从样品(13)发射的荧光(42)之前，将荧光标记(8、9)以如下方式个性化：
-利用切换光将荧光标记(8、9)中的一部分从荧光标记(8、9)的活跃状态切换到荧光标记(8、9)的非活跃状态；或
-利用切换光将荧光标记(8、9)中的一部分从荧光标记(8、9)的非活跃状态切换到荧光标记(8、9)的活跃状态。
24.根据权利要求15或16所述的方法，
-其中，从在样品(13)内可移动的并且在不同位置处单独地附着于结构(7)的荧光标记(8、9)中选择荧光标记(8、9)，
-其中，以使得荧光标记(8、9)单独地附着于结构(7)的浓度和空间分布将荧光标记(8、9)添加到样品(13)，以及
-其中，
-在附着于结构时，荧光标记(8、9)从非活跃状态转换到活跃状态，在所述非活跃状态下，荧光标记(8、9)不能被激发光(25)激发来发射荧光，在所述活跃状态下，荧光标记(8、9)能够被激发光(25)激发从而发射荧光(42)，或者
-荧光标记(8、9)仅暂时地附着于所述结构(7)，或者
-在激发光(25)和荧光抑制光(46)的长期影响下荧光标记(8、9)永久地转换到暗状态。
25.根据权利要求15或16所述的方法，所述方法附加地包括步骤：
-利用激发光(25)激发荧光标记(8、9)从而发射荧光(42)，其中，所述激发光(25)的强度分布(24)具有布置在样品(13)中的不同位置处的局部的另外的最小值(26)，
-针对各个荧光标记(8、9)以及激发光(25)的强度分布(24)的所述另外的最小值的不同位置(20、21、22、23)单独地记录(4)从样品(13)发射出的荧光(42)，以及
-从针对激发光(25)的强度分布(24)的所述另外的最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)对于相应的荧光标记(8、9)记录的所述荧光(42)的强度，确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，由各个荧光标记(8、9)从样本(13)发射出的荧光(42)的一方面在荧光抑制光(46)的强度分布(48)的最小值(20、21、22、23)的不同位置之上形成的与另一方面在激发光(25)的强度分布(24)的另外的最小值(26)的所述不同位置(20、21、22、23)之上形成的互补强度分布在确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置时进行比较。
27.根据权利要求25所述的方法，
-其中，在限定激发光(25)的强度分布(24)的所述另外的最小值(26)在之后所布置于的位置时，考虑到从针对荧光抑制光(46)的强度分布(48)的最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)对于相应的荧光标记(8、9)记录的荧光(42)的强度确定的各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置，或者
-其中，在限定荧光抑制光(46)的强度分布(48)的最小值(26)在之后所布置于的位置时，考虑到从针对激发光(25)的强度分布(24)的所述另外的最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)对于相应的荧光标记(8、9)记录的荧光(42)的强度确定的各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置。
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