CN105637348B - 对样本成像的方法 - Google Patents

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Abstract

一种测量样本(3)的方法，所述方法包括以下步骤：(ⅰ)提供第一组分的光；(ⅱ)从由在受到第一组分的光(4)的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组中选择微粒(2)；(ⅲ)形成第一组分的光以提供包括空间受限最小值(19)的光强度分布；(ⅳ)将光强度分布施加到样本上，以使得微粒位于光强度分布的空间受限最小值中；(ⅴ)检测由微粒发射的光子；利用光强度分布的最小值来跟踪微粒的运动，通过：(ⅵ)相对于样本移动光强度分布以使得由微粒发射的光子的速率保持最小，以及(ⅶ)将样本中光强度分布的最小值的实际位置作为样本中微粒的实际位置。为了对样本进行成像，所述方法还包括以下步骤：(ⅷ)针对样本的多个部分中的每个部分，确定微粒的驻留时间；以及(ⅸ)对样本上的驻留时间的分布进行绘图。

Description

对样本成像的方法
技术领域
本发明涉及一种对样本成像的方法。
背景技术
根据跟踪样本中的单个分子的运动的已知方法，利用光来激发分子以发射光子，并且利用对样本成像的二维检测器来检测由分子发射的光子。继而根据由检测器检测的光子的空间分布来确定分子的当前位置。在检测器的像素密度适当的情况下，可以根据处于超过衍射极限的空间分辨率或精度的光子的空间分布来确定分子的当前位置。然而，跟踪处于超过衍射极限的空间精度的微粒的前提是，对于分子的每个位置(即，在分子改变其位置之前)都检测到大量的光子。这是由于较大数量的光子提高了在确定分子的位置中所实现的空间精度的事实，只要在分子发射较大数量的光子的整个时间段内这个位置保持不变。
由以分子的位置为中心的圆的半径Δr给出空间精度，该位置是根据二维检测器检测到的由分子发射的光子所在的位置的分布的强度的中心来确定的。分子的真实位置位于这个圆内。半径Δr由下式给出：
Δr＝FWHM/N1/2 (1)
并且半径Δr取决于检测到的光子的数量N以及衍射图样的半最大值全宽度FWHM。
由于跟踪单个分子的运动的已知方法针对样本中的分子的每个位置都需要庞大数量N的光子，所以分子严重受压(stressed)，这会导致使分子漂白的风险增加。在漂白的过程中，分子发生化学变化从而在漂白之后分子不再提供光子。除光化学漂白之外，还有可能的是已经被强烈地和/或大量地激发以发射光子的分子转换至亚稳的暗状态中。在一段时间之后，分子可以从亚稳的暗状态返回。然而，在亚稳的暗状态下，分子不会发射用于连续跟踪分子所需的任何光子。
因此，仅存在一些分子(即，仅一些所谓的荧光染料或荧光团)适于在已知的方法中使用。许多荧光团漂白得太快，因而不能在延长的时间段或样本内所覆盖的较长距离内跟踪荧光团的运动或者用荧光团标记的分子的运动。
在上述方法中，根据二维检测器检测到的由分子发射的光子的所在位置的分布来确定分子的位置。这个方法称为定位。用于在确定光子发射型分子的空间位置方面实现高分辨率或精度的另一种方法是所谓的STED或RESOLFT荧光显微法。此处，有效地激发样本中的分子以发射光子的空间区域被减小到小于衍射极限的尺寸。因此，从样本发射的光子可以归因于尺寸减小的这一特定空间区域，而与检测到光子的位置无关并且与检测到的光子的数量无关。在实践中，有效地激发分子以发射光子的空间区域的减小是通过应用经聚焦的激发光束来实现的，该经聚焦的激发光束与荧光抑制光的一个或多个相干光束的干涉图样叠加。这个干涉图样包括位于激发光束的聚焦区中的基本上零强度的点。对于高绝对强度的荧光抑制光的光束，荧光抑制光的强度在除基本上零强度的点以外的任何地方都超过了饱和强度Is，从而借助于样本中的分子的光子的发射在除基本上零强度的点以外的基本上任何地方都得到抑制。所实现的空间分辨率或精度由下式给出：
Δr＝λ/(n sinα(1+I/Is)1/2) (2)
其中，I是样本中干涉图样的最大强度。
在STED荧光显微法中，对荧光的抑制通过受激发射来实现。在RESOLFT荧光显微法的情况下，对荧光的抑制通过将分子暂时地转换到分子不能够发荧光的构象或其它类型的状态中来实现。由于在STED荧光显微法中需要荧光抑制光的高绝对强度，所以漂白荧光团的风险是相对高的。对于RESOLFT荧光显微法，相对低强度的荧光抑制光是足够的。然而，这个方法仅可以适用于特殊的荧光团，该特殊的荧光团可以切换到荧光团不能够发荧光的构象或其它类型的状态中。
一般而言，像STED或RESOLFT荧光显微法这样的方法适用于跟踪样本中微粒的运动，因为微粒是以空间上尺寸减小的区域来进行跟踪的，其中，在该区域中有效地激发微粒以发射荧光。在这种情况下，微粒位于空间上尺寸减小的区域中的标准将会是，由所跟踪的微粒发射的光子的最大速率(rate)。尽管与微粒的连续定位相比根据这个方法进行跟踪需要较少的光子，但微粒和适用于在较长距离内对运动进行跟踪的标记物的数量不会显著增加。此外，在STED和RESOLFT荧光显微法中，必须施加不同的光束，以提供激发光和用于抑制荧光的光。通常，这需要额外的工作，因为不同的光束具有不同的波长并且不同的光束必须在空间上仔细地对齐。
根据DE 25 46 952 A1，已知基于所谓的衰减全反射的光学系统可以应用于跟踪样本中的微粒的运动。根据DE 25 46 952 A1，样本受到驱使微粒发射光子的光的照射。由于照射样本的光的强度分布并不均匀而且经空间调制，所以微粒的运动导致所发射的光子的数量的相应波动。因此，考虑到对强度分布的调制，可以根据检测到的所发射的光子的波动(即，对检测器信号的调制)来总结出微粒的运动。然而，无法跟踪沿光强度恒定的路径运动的微粒的运动。此外，完全无法跟踪在其运动期间从未受到或者很少受到光的照射的微粒。因此，对于利用从DE 25 46 952 A1获知的光学系统来跟踪样本中微粒的运动而言，使微粒频繁地受到光的照射是必要的。所以，漂白微粒或标记微粒的标记物的风险不能被有效地消除而必须被接受。
根据WO 2013/072273 A1已知一种包括有独立权利要求1的前序部分的特征的跟踪样本中单个分子的运动的方法。
需要一种基于在样本中运动的微粒对样本成像的方法。
发明内容
当前发明涉及一种对样本成像的方法。所述方法包括以下步骤：(ⅰ)提供第一组分的光；(ⅱ)从由在受到第一组分的光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组中选择微粒；(ⅲ)形成第一组分的光以提供包括空间受限最小值的光强度分布；(ⅳ)将光强度分布施加到样本上，以使得微粒位于光强度分布的空间受限最小值中；(ⅴ)检测由微粒发射的光子；利用光强度分布的最小值来跟踪微粒的运动，通过：(ⅵ)相对于样本移动光强度分布以使得由微粒发射的光子的速率保持最小，以及(ⅶ)将样本中光强度分布的最小值的实际位置作为样本中微粒的实际位置；(ⅷ)针对样本的多个部分中的每个部分，确定微粒的驻留时间；以及(ⅸ)对样本上的驻留时间的分布进行绘图。
本公开内容的有利的进一步发展归因于权利要求书、说明书以及附图。在本说明书中提及的特征和多个特征的组合的优点仅用作示例，并且可以在不需要根据本公开内容的实施例必须实现这些优点的情况下替代地或累积地使用。在不改变由所附权利要求书限定的保护范围的情况下，就原申请的公开内容和本专利而言以下适用：从附图尤其是从所例示的设计和多个部件相对于彼此的尺寸以及从它们的相对布置和它们的作用连接，可以得知其它特征。本公开内容的不同实施例的特征或者不同权利要求的特征的组合在偏离权利要求的所选择的引用关系的情况下也是可行的，在此被建议。这也涉及在单独附图中所例示的特征或在描述它们时所提及的特征。这些特征也可以与不同权利要求的特征结合。此外，本公开内容的其它实施例可能不具有在权利要求中所提及的所有特征。它们甚至可以不具有在独立权利要求中所提及的所有特征。
附图说明
在下文中，参考附图中所例示的优选示例性实施例对本公开内容进行了进一步的解释和描述。
图1例示了用于执行根据本公开内容的方法的实施例的根据本公开内容的装置的示例性实施例，所述装置包括一个光源、点检测器以及照相机。
图2示出了用于执行根据本公开内容的方法的另一个实施例的根据本公开内容的装置的另一个示例性实施例，所述装置包括一个光源和照相机。
图3示出了在用于驱使微粒发射光子的强度分布的最小值的区域中的微粒。
图4示出了沿着线轮廓的取决于位置的根据图3的强度分布的强度；还示出了由根据图3的微粒发射的光子的产生速率。
图5示出了在微粒运动到其根据图3的位置之外后的情形。
图6示出了在强度分布跟随微粒的运动之后的情形。
图7示出了用于执行根据本公开内容的方法的另一个实施例的根据本公开内容的装置的另一个示例性实施例，所述装置包括一个光源和三个邻近的点检测器，所述光源包括白光的光源和选择器。
图8示出了用于执行根据本公开内容的方法的又一个实施例的根据本公开内容的装置的又一个示例性实施例，所述装置包括两个光源和四个邻近的点检测器。
图9示出了在穿过焦平面的x截面中的光强度分布以及包含光强度分布的关断信号强度分布，以及
图10示出了由根据图9的强度分布而产生的有效点扩散函数heff。
具体实施方式
根据本发明跟踪其在样本中的运动的微粒，可以是单个分子、一起运动的一组分子、复合体、量子点、反射金微粒等等。
在受到光的照射时引起微粒对光子的发射的过程可以是荧光发射。然而，许多其它过程也可以用作发射光子的基本原理，例如光的散射。
引起光子的发射的相应过程可以与被跟踪的微粒本身的性质有关，或与使得微粒被跟踪的标记物(尤其是染料)有关。
在根据本发明的方法中，被施加到样本的光强度分布的特征为空间受限最小值。如同在STED或RESOLFT荧光显微法中使用荧光抑制光的情况下，这个强度分布可以由一束或多束相干光束的干涉图样形成，其中，空间受限最小值是干涉图样的基本上零强度的点。因此，最小值可以具有小空间尺寸。具体而言，最小值的空间尺寸可以小于衍射极限。
然而，与STED和RESOLFT荧光显微法相比，呈现这种特定强度分布的光并非用于抑制荧光。相反，其用于驱使所跟踪的微粒发射作为测量信号被检测到的光子。此外，不利用强度分布的最小值对样本进行扫描，但是强度分布仅相对于样本连续地移动，以使得由微粒发射并接下来被检测到的光子的速率最小化。光子的最小化速率或最小速率表示微粒还位于光强度分布的最小值的位置处。反之亦然，光子的增大的速率表示微粒趋向于离开光强度分布的最小值；并且必须对最小值的位置进行重新调整以跟踪微粒的运动。
在本发明的方法中，光子或光子的检测的位置并非用于确定样本中微粒的实际位置。因此，不需要针对样本中微粒的每个位置都获得大量的光子，来以高精度确定相应的位置。而是将样本中光强度分布的最小值的实际位置作为样本中微粒的实际位置。
在适当的条件下，可以以比衍射极限低得多的空间精度对微粒的运动进行跟踪。除最小值的小尺寸和在移动光强度分布方面的高精度以外，这些适当的条件包括最小值以外的光的强度足够急剧的增大，以及响应于增大的光子速率的对最小值的位置的足够快的重新调整。
由于在根据本发明的方法中不需要微粒发射很多光子，所以使微粒漂白的风险大大降低。所以，甚至可以在较长的时间段内或者在样本中由微粒所覆盖的较长距离内跟踪易于漂白的微粒。此外，与基于STED或RESOLFT荧光显微法的方法相比，样本仅受到了包括有最小值的强度分布的照射。因此，光不需要与另一束光对齐，无论是空间上还是针对其波长。因为如此，用于应用根据本发明的方法的光学设备比STED或RESOLFT荧光显微镜的光学设备简单得多。
还存在与STED和RESOLFT荧光显微法的另一个不同之处：在根据本发明的方法中，具有最小值的光强度分布仅需要具有小的绝对强度，如果光已经以低强度引起光子的发射。特别地，不需要在零点以外实现激发光子的发射的饱和，以便于实现低于衍射极限的空间精度。相反，在许多情况下，优选的是随着到零点的距离的增大该激发连续地增加。最后但同样重要的是，本发明的一个特征是使由所跟踪的微粒发射的光子的数量最小化并且因此使其漂白的风险最小化。
相对于(即，相对)样本移动或偏转强度分布以使由检测器检测的光子的速率连续地最小化可以基于试错方法，即采用小步长试验性地移动强度分布。如果移动导致检测到的光子的速率(与所发射的光子的速率类似)降低，那么将沿着相同的方向进一步移动强度分布。在相反的情况下，即如果移动导致检测到的光子的速率增加，那么沿着另一方向(例如，相反的方向)移动移动强度分布。各种适当的算法和实施例(例如，由关键词“跟踪算法”以及“模糊逻辑”指示的这些)对于本领域技术人员而言是已知的。
根据STED或RESOLFT荧光显微法，已知用于形成包括有最小值的荧光抑制光的光强度分布的各种技术，例如参见Klar等人的PNAS 97(2000)、Westphal等人的Phys.Rev.Lett.94(2005)以及Donnert等人的PNAS 103(2003)，这些参考文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。这些技术中的任何技术也可以用在根据本发明的方法中，该方法用于形成驱使所跟踪的微粒来发射光子的光的光强度分布。仅给出一些示例，可以采用相位滤波器、空间光调制器、使用对置透镜的4pi布置等，以形成包括有最小值的光强度分布。
为了相对于样本移动或偏转具有最小值的光强度分布，同样根据STED和RESOLFT荧光显微法获知可以应用扫描仪。例如，这种扫描仪包括声光或电光偏转器、旋转镜、通过其相对于光束对样本进行调整的压电致动器，或者致动物镜并且通过其相对于样本对光束进行调整的压电致动器。
对于使光强度分布偏转，替代地或另外地，相对于样本移动具有最小值的光强度分布也可以通过相对于具有最小值的特征的光强度分布移动样本来完成。相对于样本移动具有最小值的光强度分布仅需要在具有最小值的光强度分布与样本之间的相对移动。具体而言，相对于样本沿x方向和y方向移动具有最小值的光强度分布可以通过使光强度分布偏转来实现，并且相对于样本沿z方向移动具有最小值的光强度分布可以通过移动样本来实现。z方向可以是正交于样本的表面的主延伸平面的方向，光强度分布经由所述平面被施加到样本上，并且x方向和y方向可以沿着这个主延伸平面或者平行于这个主延伸平面而延伸。
根据本发明的方法，光强度分布的最小值可能在一个、两个或三个维度上空间受限，即该最小值可以沿着平面、沿着线或围绕着点延伸。为了跟踪微粒的运动，继而使强度分布相对于样本沿着最小值受限的维度的所有方向移动或偏转。沿最小值不受限的方向的移动将不会引起：由微粒发射的光子的速率降低，并且因此不能有效率地使用。这也意味着沿着这个方向的微粒的运动不能被跟踪。因此，优选使这个方向取向为使得沿着这个方向的微粒的运动并非是所期望的。在许多情况下，样本中微粒的运动无论如何都局限于沿特定结构的方向。在二维样本的情况下，出于原理，忽略沿第三维度的方向的微粒的运动。
已经提到的是，具有最小值的强度分布可以形成为一个或多个相干部分光束的干涉图样，在所述干涉图样中，空间受限的最小值是基本上零强度的点。干涉图样例如可以通过对其波前进行调制而由一个相干光束形成、或者由多个叠加的相干光束形成。
在本发明的方法的一个实施例中，动态地改变对一个相干光束的波前的调制，以使得光强度分布的仅一维或两维受限的最小值交替地在不同的空间维度上空间受限。例如，相位关系可以在第一相位关系与第二相位关系之间变化，以使得最小值在第一相位关系的情况下受到处于x-y平面的环的限制，并且使得最小值在第二相位关系的情况下在z方向上受限。在J.Keller等人的“Efficient fluorescence inhibition patterns forRESOLFT microscopy”(Optics Express 3361，Vol.15，No.6(2007))、以及B.HArke等人的NanoLetters，8，1309(2008)中，对用于沿x方向和y方向或沿z方向限制最小值的适当的光强度分布、并且对相干光束的波前的相应的调制进行了描述，这些参考文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。J.Keller等和B.Harke等使用它们的图样来进行荧光抑制。然而，相同的图样可以用在本发明的方法中，用作驱使微粒发射光子的光的光强度分布。在本发明的这个实施例的另一变型中，不同的、相继的相位关系可以产生沿不同方向取向的类似线或类似面的最小值。这些最小值可以被描述为转动的带(rotating stripe)并且包括点或线作为它们的空间交叉。如果一个最小值在这些相位关系之间快速地切换，并且如果针对每个相位关系对微粒所发射的光子的速率的最小值单独地进行定位或者在经过相位关系的完整变化之后对其进行定位，那么可以在所有三个维度上对样本中微粒的运动进行跟踪。
在本发明的方法中，光可以由不同波长的光成分(component)组成。此外，光可以是波长可变的从而能够跟踪属于由微粒构成的不同组的不同微粒。在所有的这些情况下，如果光强度分布以其空间受限的最小值的空间位置不会随光的波长发生变化的方式而形成，那么这会是优点。
在本发明的方法中，由微粒发射的光子不需要由二维检测器阵列检测。相反，由于跟踪主要取决于这些光子的速率，所以点检测器足够用于检测光子。将根据具有最小值的强度分布相对于样本的当前位置，来确定样本中微粒的当前位置。可以根据使强度分布相对于样本移动的这些设备的位置总结出这个位置，例如，通过用于移动强度分布的扫描仪的当前位置。例如还可以通过利用对样本成像的照相机来检测由微粒发射的光子，以及通过评估在照相机上的由这些光子组成的光强度分布的图像，来直接确定相对于样本的强度分布的位置。根据定位的原理，这种确定还允许实现超出衍射极限的位置精度。
此外，对样本成像的照相机可以用于通过用驱使微粒发射光子的光对样本进行照射来确定微粒的初始位置，而不用在空间上使光结构化。在确定了两个或更多个微粒(所述两个或更多个微粒发射光子并且不能彼此分离地被跟踪)的情况下，可以通过有意地应用(例如，如其在光强度分布的邻近于其最小值的最大点中所存在的)高光强度来对多余的微粒进行光化学漂白。还可以在检测到的光子的速率的增大不是因所跟踪的微粒移动而是因相似类型的另一微粒穿过所跟踪微粒的路径而产生的情况下，应用这种对干扰微粒的漂白。这个其它微粒可以由例如经由照相机由较远离光的强度分布的最小值发射的较高数量的光子所识别。
对样本成像的照相机还可以用于根据利用照相机检测到的微粒所发射的光子的位置来确定微粒的运动的方向。对于该确定，还可以执行对微粒的定位，其中，定位基于在微粒离开光的强度分布的最小值时由微粒发射的光子。然而，此处，不需要以高精度来执行定位。因此，不需要微粒发射许多光子，因为所发射的光子仅用于确定方向，其中，必须沿着所述方向移动光的强度分布的最小值以跟随微粒。然而，不需要所发射的光子在跟踪微粒方面实现期望的空间精度。相反，空间精度是通过随后对由微粒发射的光子的速率的最小化并且因此是通过光强度分布的最小值的形式和/或布置来实现的。该最小化还可以基于试错法，以重新调整光强度分布的空间受限最小值。
然而，不需要使用整个照相机，来基于检测到的由微粒发射的光子的位置确定微粒的运动的方向。还可以在使用至少两个邻近的点检测器来在一个维度上跟踪微粒时或在使用至少三个邻近的点检测器来在两个或三个维度上跟踪微粒时，获得用于这种确定的充足的信息。例如，类似的概念用于公知的四象限光电二极管中以确定激光束的位置。此外，其发明内容以全文引用的方式并入本文中的S.J.Sahl等人的Fast molecular trackingmaps nanoscale dynamics of plasma membrane lipids(PNAS，April 13，2010，Vol.107，No.15，6829-6834)，公开了由三个光纤输入面(fibre input face)提供的用于跟踪荧光微粒的三个邻近的点检测器在标准的分子跟踪过程中的使用。这些点检测器还可以用于本发明的用于检测由微粒发射的光子的方法中。
由于根据本发明的方法的目标在于对由微粒发射的光子的速率的最小化，所以除那些感兴趣的光子之外检测到的背景很重要。所述背景例如可以是因被施加到样本上以便驱使微粒发射光子的光以及散射到检测器的光而产生的，或者是因样本的自体荧光而产生的。为了使背景的影响最小化，可以将驱使微粒发射光子的光以脉冲的形式施加到样本上，并且可以在光的脉冲中的每个脉冲之后的有限的时间间隔内检测由微粒发射的光子。可以调整该时间间隔或门控从而实现最大的信噪比。减少背景的另一种方法是选择一微粒，以使得该微粒经由多光子过程被光驱使以发射光子。继而，由微粒发射的光子具有比施加到样本的光短得多的波长，并且因这个光而产生的背景可以容易地受到波长抑制。此外，多光子激发或吸收在所有三个维度上局限于微粒周围的区域。多光子激发不会遍布样本的增大的体积，从而使不想要的(自体)荧光激发最小化。根据多光子激发荧光显微法公知对多光子激发的限制。
在本发明的方法中，可以根据波长从白光中选择用于驱使微粒发射光子的光。通过改变这个选择，可以跟踪属于由微粒构成的不同组的不同微粒。提供白光的光源通常是已知的。它们例如可以从NKT Photonics，Denmark获得。这些光源提供在扩展的波长范围内强度基本上恒定的光脉冲。可以从这个范围中选择本发明的方法中所使用的光。
在根据本发明的方法的一个实施例中，对由所跟踪的微粒发射的光子进行另外地分析，以确定选自由以下特征构成的组中的至少一个特征：波长、偏振、绝对速率、由邻近的点检测器检测到的相对数量、一致性(coincidence)、以及在光的每个脉冲之后的时间点。这允许收集关于所跟踪的微粒的额外信息或所跟踪的微粒的细节。这些细节可能随微粒的轨迹发生变化。可以分析在光的脉冲之后光子的波长和光子的时间点的所产生的变化来监测这些细节。具体而言，可以应用如A.和S.W.Hell的Fluorescence nanoscopygoes multicolor(Nature Biotechnology，Vol.25，No.11，November 2007，1243-1235)中所述的类似的技术，其发明内容以全文引用的方式并入本文。用这种方式对微粒的细节进行分析是高度灵敏的。这是由于仅单个微粒对于所分析的光子有贡献的事实，即不存在来自具有其它细节的其它微粒的光子的稀释。这特别地允许基于由微粒发射的光子的波长或其它特性的细微的差异对所跟踪的微粒进行准确的分类。
对来自于微粒的光子进行分析还允许确定微粒是否包括一个或多个光发射中心，以及这些光发射中心是否在一起或者在某些时刻彼此远离。因此，可以分别针对结合体和复合体的单个结合配偶体(partner)或复合配偶体对结合体和复合体进行监测。
在本发明的方法中，用于检测微粒所发射的光子的检测器，还将检测由属于由微粒构成的相同组并同样位于检测器的检测体积中的其它微粒发射的所有光子。然而，本发明的方法仅在单个微粒发射为跟踪微粒而最小化的光子的速率下所检测到和所考虑的所有光子的情况下正常工作。为了确认满足这一条件，可以分析从检测器的检测体积当中(即，从包括光强度分布的最小值的体积当中)发射的光子以确定上述特征中的一个或多个特征，并且可以检查所确定的特征与发射所分析的光子的单个微粒的符合性(compliance)。特别地在这个背景下，由微粒发射的光子的绝对速率的特征也可以被称为微粒的亮度。如果光子由一个以上的微粒发射，那么除了一个微粒以外的所有微粒都应当被关断或漂白，或者应当在样本的另一部分中选择另一微粒。
根据本发明的方法可以应用于跟踪可切换的微粒(例如，可切换的分子)，其中，用于驱使发射光子的光可以使可切换的分子从不能驱使微粒发射光子的状态激活到可以驱使微粒发射光子的荧光状态中。这种可切换的分子的一个示例被称为PADRON，其为类绿色荧光蛋白(GFP)的蛋白质。尽管未要求，但在这个实施例中可以优选的是微粒快速回到非荧光暗状态中，因为这支持在驱使光子的发射的光的强度分布的最小值中所实现的使所发射的光子的速率最小化的效果。微粒回到暗状态中可以自发地发生，或者可以被物理信号或化学信号诱导。由于不需要这个诱导信号是空间结构化的，所以优选的是非空间结构化的。
在使用可切换的微粒的本发明的另一个实施例中，与驱使光子的发射的光的波长不同的另一波长的光，例如可以用于按照对单个微粒的任何跟踪的需要来调整样本中的被激活的微粒的小浓度，该被激活的微粒可以被驱使以发射光子。出于这个目的，可以使用被称为DRONPA、rsEGFP、EOS和Dendra2的光可切换的蛋白质，这些蛋白质可以在与它们的激发波长不同的另一波长下激活。DRONPA和rsEGFP不仅被激发以发射光子，而且在它们的激发波长下被去激活。由于本发明的方法所需的光子的数量低，然而尽管如此也可以在一些时间内利用激发光的光强度分布来成功地跟踪这些光子。首先并未使EOS和Dendra2在它们的激发波长下去激活；它们只可以漂白。
在使用可切换的微粒的本发明的所有实施例中，用于驱使光子的发射的光(形成该光以提供具有空间受限最小值的光强度分布)可以仅包括一个波长的一个光成分，或包括不同波长的两个成分。在仅有一个光成分的情况下，该光成分可以激发微粒以进行光子的发射，所述微粒已经用另一种方式被接通或激活；或者该光成分可以同时激活和激发微粒以进行光子的发射。在有两个光成分的情况下，这些两个光成分中一个光成分可以用于激活微粒，而光成分中的另一个光成分激发微粒以进行光子的发射。
在本发明的一个实施例中，单独的关断信号被提供具有信号强度分布并且包含光强度分布。这个关断信号关断属于由在受到光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组的其它微粒。例如，可以通过光化学漂白或者通过将可光去激活的微粒切换到稳定的暗状态来进行关断。本发明的这个实施例通过发射对将被最小化的光子的速率有贡献的光子，来确保穿过所跟踪的微粒的路径的微粒不会干扰它的跟踪。关断信号可以是关断光。关断信号通常可以采用与光相同的方式而形成，并且可以与光的强度分布的最小值同心地形成但在公共中心处具有关断信号的较大的最小值。关断信号的这个较大的最小值避免所跟踪的微粒被关断。
在本发明的方法的一个实施例中，对由微粒发射并被检测到的光子进行计数，并且指示已由微粒发射并被检测到的光子的绝对数量。通常，在微粒被漂白并从而不再是可跟踪的之前，可以驱使每个微粒发射一定数量的光子。这个数量的光子不是绝对固定的，但也不会在由微粒构成的每个组内强烈地变化。因此，由微粒发射并被检测到的光子的绝对数量，是微粒的可跟踪寿命的已经到期的部分以及可跟踪寿命的剩余的部分的良好的指示器，在所述可跟踪寿命的剩余的部分内依然可以对微粒进行跟踪。
在本发明的方法的一个实施例中，通过光强度分布的最小值交替地跟踪选自由在受到光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的相同组中的至少两个微粒。根据STED和RESOLFT荧光显微法已知的上述这些扫描仪，适用于比任何微粒可以在样本中运动的速度快得多地以高精度对光强度分布的最小值进行重新定位。其它适当的扫描仪是已经例如在光镊中用于跟踪和捕获多个微粒的这些扫描仪。因此，可以并行地跟踪多个微粒，这是因为针对多个微粒中的每个微粒交替地执行根据本发明的方法的步骤。
在前述段落中所述的本发明的实施的变型中，周期性地沿着穿过样本的线或轨线来回移动光强度分布，选自由微粒构成的相同组中的两个或更多个微粒位于所述线或轨线上。在垂直于这条线或轨线的所有方向上，对两个或更多个微粒进行直接跟踪，因为这条线的线程被重新调整以使由微粒发射的光子的速率最小化。然而，可以根据沿着线的由微粒发射的检测到的光子的速率的局部最小值的位置，来确定沿着线的微粒的位置。这个实施例还允许单独地跟踪互相非常靠近的微粒。在这种情况下，沿其来回移动光强度分布的线特别地可以在微粒之间的距离的方向上延伸。在这个实施例中，微粒的距离为沿着线的检测到的光子的速率的局部最小值的距离。
根据本发明的方法，还可以跟踪两个或更多个不同微粒的运动。出于这个目的，可以使用两种或更多种不同波长或偏振的光，并且可以检测为相应微粒的特性的波长或偏振的光子。除公共物镜以外，可以利用独立的设备来执行对两个或更多个不同微粒的这种跟踪。在本发明的另一个实施例中，仅存在独立的光源，然而跟踪设备的所有其它部分是共享的。所有的共享部分将以交替的方式用于微粒两者，即通过在对一个微粒的跟踪与另一个微粒的跟踪之间进行切换。
根据本发明，对微粒的跟踪用于对样本成像。出于这个目的，针对样本的多个部分中的每个部分，确定微粒的驻留时间。样本的这些部分可以特别地是由样本的整个体积细分成的体积元素或体素。当对样本上的驻留时间的分布进行绘图时，获得了样本的图像。在基本实施例中，样本的所产生的图像可以指示其中所跟踪的微粒已到过的样本的所有区域，或者所跟踪的微粒未到过的样本的所有区域。更加精细的图像可以指示不同驻留时间的不同区域。例如，与微粒经常到的区域分开来对微粒很少到的区域进行绘图。根据相应区域中的微粒的不同驻留时间，可以总结出样本的这些区域本身并不相同。这些区域在微粒的可及性(accessibility)或微粒的可动性或微粒的亲和性或甚至在结合微粒的倾向方面特别地不同。
在微粒的绝对驻留时间与暂时驻留时间之间可能另外存在差异，所述绝对驻留时间例如被计算为在样本的相应部分中的微粒的所有单个驻留时间的总和，所述暂时驻留时间例如被计算为在样本的相应部分中的微粒的单个驻留时间的平均值。绝对驻留时间可以更偏向于指示样本的相应部分对微粒的亲和性，而暂时驻留时间可以更偏向于指示在样本的相应部分中的微粒的可动性。
应当理解的是，对样本成像的这个方式不仅允许获得样本的一个固定图像。相反，在样本的不同部分中的驻留时间的时间发展还可以用于获得一系列图像，即指示样本的时间发展的影片。
对样本成像的这个方式的空间分辨率取决于确定驻留时间的体素的尺寸。由于可以以超过衍射屏障(diffraction barrier)的精度跟踪样本中的微粒的位置，所以该图像还可以具有超过衍射屏障的空间分辨率。
如果已经在样本中跟踪了微粒很长的距离，那么这可以足够对整个样本成像。然而，如果对多个微粒中的每个微粒重复对驻留时间进行绘图，那么可以识别样本的被隔离物分隔开的不同区域，所述隔离物是微粒不能通过或仅可以以低比率通过的。
如果在受到不同组分的光的照射时被驱使以发射光子的不同微粒被用于本发明的这个实施例中，则获得样本的多颜色图像。这个图像的每种“颜色”都与样本的不同特性相关联，针对样本的不同特性由微粒构成的各自组的微粒用作探针。
根据本公开内容的装置包括提供用于驱使微粒发射光子的光的光源，以及用于检测由微粒发射的光子的检测器。装置还包括光束整形模块，所述光束整形模块被配置为将具有以空间受限最小值为特征的强度分布的光施加到样本。此外，提供了光束偏转模块，根据检测器的信号对所述光束偏转模块进行控制。实际的相关性为：通过相对于样本移动或偏转光强度分布来使由检测器检测到的光子的速率保持最小。因此，利用光强度分布的最小值来跟踪运动中的微粒。
在本公开内容的装置的一个实施例中，光束整形模块对相干光束的波前进行调制，并且继而将光束聚焦至样本中以提供光强度分布的最小值作为光的干涉图样的基本上零强度的点。对于光束的波前的调制，光束整形模块可以包括动态可控的空间光调制器。
在本公开内容的装置的另一个实施例中，光束整形模块将至少两束相干光束聚焦至样本中的相同聚焦区中。同样在这种情况下，光束整形模块提供光强度分布的最小值作为干涉图样的基本上零强度的点。
此外，光束整形模块可以是不分光的，以使得空间受限最小值的空间位置不会随光的波长而变化。
可以提供照相机以用于对样本成像。照相机例如可以用于确定要跟踪的微粒在样本中所在的位置。对于该确定，样本可以在没有空间结构的情况下受到光的照射。当在样本中跟踪微粒时，照相机还可以用于确定光强度分布的位置。此外，照相机可以用于确定为了跟踪微粒必须沿着其移动强度分布的方向。代替照相机，可以提供一个或优选地两个或更多个邻近的点检测器，以用于确定为了对微粒进行跟踪强度分布开始沿着其移动的方向。特别地，如在S.J.Sahl等人的Fast molecular tracking maps nanoscale dynamics ofplasma membrane lipids(PNAS，April 13，2010，Vol.107，No.15，6829-6834)中所述的一组多模光纤可以用作邻近的点检测器。
为了跟踪两个不同的微粒，可以提供具有不同波长的光的两个光源。为了同时进行跟踪，可以为光源中的每个光源提供单独的光束整形模块和光束偏转模块。然而，还可以为光源两者提供公共模块，其以交替的方式被使用。还可以提供两个以上的光源，以对两个以上的微粒同时进行跟踪或快速交替地进行跟踪。
特别地，光源可以是如同脉冲激光器一样的脉冲光源，从而以脉冲的形式向样本施加光。继而，检测器可以被提供具有门并且与脉冲光源同步，以使得以最大信噪比在光的每个脉冲之后的有限的时间间隔内检测由微粒发射的光子。这个过程也被称为时间选通检测。
在根据本公开内容的装置的一个实施例中，光源包括被配置为例如按照波长或偏振从白光中选择光的选择器。继而特别地，白光可以由一些已知的脉冲光源(例如，可以从NKT Photonics，Denmark获得的)提供。
根据本公开内容的装置的检测器还可以包括分析器，所述分析器被配置为针对选自由以下特征构成的组中的至少一个特征来分析从包括光强度分布的最小值的体积当中发射的光子：波长、偏振、绝对速率、由邻近的点检测器检测到的相对数量、一致性、以及在光的每个脉冲之后的检测时间点。分析器允许收集关于微粒的永久性的细节和变化的细节的信息。基于该信息，可以识别微粒或将微粒分配到特定的微粒类。分析器还允许确定光子是否是由可能相关联的仅一个或多个微粒发射的。
根据本公开内容的装置的检测器还可以以基本上为光源所提供的光的波长的一半的波长来选择性地检测由微粒发射的光子。这意味着经由双光子过程来驱使微粒发射光子。由于驱使微粒发射光子的光与由微粒发射的光子之间在波长上差异大，所以在检测光子中抑制背景变得尤其简单。此外，在双光子过程驱使微粒以发射光子的情况下，大大降低了光在样本的其它区域中错误地驱使微粒以发射光子的可能性。这尤其适用于位于除了光所聚焦到的焦平面处之外位于z方向上的位置处的微粒，其中，z表示光轴，沿着该光轴对光进行聚焦。多光子诱导过程主要发生在最高强度的聚焦区处，从而在所有三个维度上对激发进行限制。
多光子过程的相同的z选择性特性还可以用于：经由多光子过程，通过被聚焦到聚焦区某个z位置(即，在光轴的方向上的这个深度处)处的激活光来在样本中的这个z位置处选择性地激活可激活的微粒。
此外，本公开内容的装置可以包括提供具有包含光强度分布的信号强度分布的关断信号(尤其是关断光)的信号源。如果关断信号关断了在受到光的照射时发射光子的其它微粒，那么由于光强度分布或其它微粒的移动，这些其它微粒在它们受到光的照射之前就已经被关断。因此，该其它微粒将不会发射可能干扰对微粒的跟踪的光子。关断信号例如可以将活性微粒去激活为去激活状态，在该状态下不再能够驱使微粒以用于光子的发射。在另一个实施例中，关断信号通过受激发射禁止占据激发分子态，微粒在该状态下发射所检测的光子。以这种方式，有效点扩散函数空间上限于包含光强度分布的最小值的小区域，所述有效点扩散函数指示样本的区域，在该区域中，通过光与关断信号的结合的强度分布有效地驱使微粒以用于光子的发射。
根据本公开内容的装置可以包括计数器，该计数器对从包括有光强度分布的最小值的体积当中所发射的并且被检测器检测到的光子进行计数，并且指示所计数的光子的绝对数量。对所计数的光子的绝对数量的指示可以是相对指示数，指示：在一个微粒被漂白之前，已经针对该微粒进行计数的光子相对于所期望的光子(可以期望的由微粒发射的光子)的数量的百分比。
根据本公开内容的装置可以包括用于为驱使其它微粒发射光子而提供其它光的至少一个其它光源。其它光可以在其光成分的至少其中之一的波长或偏振方面与所述光不同。光源和至少一个其它光源可以被配置为同时或交替地跟踪微粒和其它微粒的运动。
即使是在仅一个光源的情况下，根据本公开内容的装置可以用于并行地(即，基本上同时)跟踪许多微粒。这例如可以实现，因为光束偏转模块被配置为利用光强度分布的最小值交替地跟踪微粒和至少一个其它微粒。如果光束偏转模块例如包括声光偏转器或快速电光偏转器，那么可以比微粒的任何可能的运动都快得多地将光强度分布的空间受限最小值交替地调整至两个或甚至更多个微粒。
如以上已指出的，可以沿着线或轨线以高速度转移光强度分布的最小值，以使得检测到的时间相关性的测量信号(即，检测到的光子的速率)的特征在于最小值为时间或沿着轨线的位置的函数。每个最小值代表一个微粒。可以根据测量信号的相应最小值来直接确定或在数学评估之后确定相应微粒的位置。数学评估可以包括利用对单个微粒的数学响应来进行线性或非线性去卷积。因此，可以以高速并且以高空间分辨率来跟踪多个微粒。
由于根据本公开内容的装置仅需要为驱使微粒以进行发射来提供光，所以其设备可以保持简单。然而，还可以根据或结合(可能已经存在的)STED或RESOLFT荧光显微镜来实现根据本公开内容的装置。特别地，在STED或RESOLFT荧光显微镜中用于对荧光进行抑制的光的光束整形模块可以用于所述光，在本公开内容中通过所述光驱使微粒以发射光子。此外，用于对样本进行扫描的光束偏转模块可以通过使检测到的光子的速率最小化容易地适合用于对微粒的跟踪。当实施关于STED或RESOLFT荧光显微镜的本公开内容时，存在选项，即通过STED或RESOLFT荧光显微法在任何时间(例如，在执行本发明内容的方法之前或之后或者甚至在中间的某些时间)另外地对样本进行成像。
现在更详细地参考附图，图1示出了用于跟踪样本3中的微粒2的运动的装置1。微粒2例如可以是荧光标记物，或者微粒2可以通过这种荧光标记物来进行标记。通过来自光源5的光4，驱使荧光标记物发射光子。这基本上只发生在样本3中的光4的强度分布的最小值之外。参考图3至图6，对该强度分布进行更详细地描述。光源5包括激光器6。提供光束整形模块7以用于在物镜8的聚焦体积中形成期望的光强度分布；并且提供光束偏转模块9、光束偏转模块10和光束偏转模块11以用于调整在样本3中的光4的强度分布的最小值的位置。光束偏转模块9和光束偏转模块10直接作用于光4并且使最小值沿x方向和/或y方向(即，沿相对于光路的横向方向)移动或偏转。然而，光束偏转模块11直接作用于样本3，并且使光4的强度分布的最小值相对于样本3沿z方向移动或偏转。在二向色分束器13之后，提供了点检测器12以用于选择性地检测由微粒2发射的光子。分束器13位于激光器6与样本3之间的光路中，并且更具体而言在激光器6与光束偏转模块9和光束偏转模块10之间。另一个分束器14位于光束偏转模块9和光束偏转模块10与物镜8之间。包括有二维检测器的照相机15经由分束器14对样本3进行监测。为了初始定位微粒2，将光4施加到样本3的大片区域上，并且根据由微粒2发射的光子对微粒2进行定位并且利用照相机15对微粒2成像。继而，相对于微粒2对光4的强度分布进行调整，以使得微粒2位于光4的强度分布的最小值的位置处。通过相对于样本3试验性地移动光4的强度分布，来检查微粒2确实位于最小值的位置处。在这些移动之后，被点检测器12检测到的由微粒2发射的光子的速率应当增大。然而，速率的增大指示必须调整光4的强度分布以利用最小值来跟踪微粒2，因为微粒2运动了。在没有光4的强度分布的移动的情况下光子的速率的增大，也意味着微粒2在样本3中运动了。继而，必须移动光4的强度分布以便利用最小值跟踪微粒2直到光子的速率再次达到其最小值为止。为了该跟踪，根据检测器12的信号，由控制器16控制光束偏转模块9至11。在跟踪期间所确定的光4的强度分布的最小值的位置和/或移动与样本3中的微粒的运动相似。可以根据照相机15检测到的由微粒2发射的光子的这些位置(即，微粒脱离最小值的位置)来确定微粒2的运动的方向，以支持利用最小值的对微粒的跟踪。
在图1中，指示了控制器16还对光束整形模块7进行控制。在实践中，光束整形模块7可以是空间光调制器，其中，通过该空间光调制器可以适当地调整样本3中的光4的不同的强度分布。这些光强度分布的最小值均在一个或两个维度上受限，并且只包括公共的交叉点，利用所述公共的交叉点可以在样本3中对微粒2进行跟踪。这个实施例能够在所有的三个维度上以最大空间精度相对于微粒2在样本3中的运动来跟踪微粒2。
图2中所例示的装置1的实施例不包括根据图1的点检测器12。此处，仅提供照相机15，以用于检测由样本3中的微粒2发射的光子。此外，样本3是基本上仅二维延伸的样本。光4的强度分布包括被类环形最大值包围的中央最小值，利用所述最小值对微粒2进行跟踪。借助于静态光束整形模块7来产生光4的这种甜甜圈形状的强度分布。在二维样本3的平面中，利用直接作用于光4的光束偏转模块9和光束偏转模块10对光4的强度分布的最小值进行定位。照相机15被布置在其它物镜17后面，物镜17被布置在样本3侧与物镜8相对。此处，照相机15另外用于确定样本3中的光4的强度分布的位置。这一方面允许确定光束偏转模块9和光束偏转模10的当前位置。另一方面，这可以用于确定样本中的光4的强度分布的最小值的位置。具体而言，样本中的最小值的位置因此还可以以超过衍射极限的空间精度来确定。
为了确定微粒沿光轴的Z方向的运动的方向，可以提供附加的光学模块(此处并未绘出)。这种模块是根据基于中心的单个微粒的跟踪和运动已知的。该模块例如利用像散(例如，参见Huang等人的Science 319(2008))或双螺旋检测PSF(例如，参见Pavani等人的PNAS 106(2009))。例如可以通过在由微粒发射的光子的路径中(即，在样本与检测器或照相机之间的某个位置)插入柱面透镜来提供像散。
图3示意性地示出了样本3中的光4的强度分布，微粒2位于光强度分布18的中央最小值19处。图4是(以增大的比例)示出了根据图3的沿着穿过样本3的线轮廓的光强度分布18的强度I(直线)的图。在最小值19的区域中，光强度分布18具有相对于最小值19对称的基本上正弦的曲率。除了光强度分布18以外，图3还示出了在假设微粒2受到光4的相应的强度I的照射的情况下所产生的由微粒2发射的光子的速率R(虚线)。在最小值19的位置处，速率R也具有其最小值Rmin。一旦微粒2离开这个最小值19，速率R就会快速增大。具体而言，即使在到最小值19小的距离处，速率R也已经达到了接近或等于其最大值Rmax的值。这个表现有利地用于利用光强度分布18的最小值19以高空间精度来跟踪样本3中的微粒2。
当如图5中所例示的微粒2已经相对于强度分布18改变其位置并且已经离开最小值19时，检测到由微粒2发射的光子的增大的速率R。通过试验性地移动样本3中的强度分布18，速率再次减小并保持最小。以这种方式，确定微粒2运动的方向和距离，因为在具有最小值19的光强度分布18如图6中所例示的相对于样本3沿相同的方向移动并移动了相同的距离之前未实现速率的最小值。也可以根据利用照相机检测到的由微粒2发射的光子所在的位置，来确定为了跟踪微粒2具有最小值19的强度分布18必须沿着其进行移动的方向。
图7中所示的装置1的实施例与图1中所示的装置的实施例在以下细节上有所不同。光源5包括白光21的光源20以及按照波长从白光21中选择光4的选择器。此外，代替根据图1的仅一个点检测器12，三个邻近的点检测器23到25提供到控制器16的输入。由微粒2发射并且被点检测器23到25检测到的光子的相对数量，指示微粒2沿着其在样本3内运动的方向。此外，图7的装置1包括附加的分束器27以及针对由微粒2发射的光子的波长的分析器28。在这个实施例中，光束偏转模块9和光束偏转模块10被配置为交替地跟踪样本3中的微粒2和其它微粒29的运动。这意味着光4的光强度分布的空间受限最小值分别交替地用于跟踪微粒2和微粒29。
根据图8的装置1的实施例也是基于根据图1的装置1，并且因此在此仅针对其差异进行描述。根据图1的点检测器12由四个邻近的点检测器23到26代替。除了包括有激光器6并且提供光4的光源5以外，其它光源30包括其它激光器31，其提供与光4的波长组分不同的另一种波长组分的其它光32。经由二向色分束器33将其它光32与光4合并。其它光32以与光4相同的方式通过光束整形模块7形成为其它光分布。出于这个目的，光束整形模块7是不分光的。由于光源5和光源30两者都为脉冲式，所以可以在点检测器23到26处从时间上区分响应于光4由微粒2发射的光子与响应于光32由其它不同微粒34发射的光子。点检测器23到26还可以分别用于在光4和光32的每个脉冲之后的时间内分析某个点的光子。图8的装置1还包括如图7的装置1所示的相同的附加分束器27和针对由微粒2发射的光子的波长的分析器28。
图9示出了穿过光4的甜甜圈形状的光强度分布18的x方向上的截面图，该光4驱使或激发微粒以发射光子。这个光强度分布18与关断信号的强度分布35叠加，所述关断信号阻止在本公开内容的方法中检测到的这些光子的发射。特别地，关断信号是STED光36，其通过受激发射禁止占据微粒的激发分子态。光强度分布18和光强度分布35同心，即，它们两者都在公共中心处呈现最小值19。然而，x方向上的光强度分布18的最大值的距离稍小于x方向上的STED光36的强度分布35的最大值之间的距离。与光4对比，这对应于STED光36的较长的波长。此外，强度分布35超过了在某个区域之外的饱和强度Is，所述区域的直径在图9中由双头箭头37指示。因此，只要位于这个区域内，光4就有效地驱使微粒以发射光子，因为检测到的光子的发射在其它任何地方都被STED光36抑制。
图10示出了由图9的两个叠加的光强度分布18和35产生的有效点扩散函数heff。仅在微粒位于由双头箭头37所指示的区域内的情况下，该微粒被驱使以发射光子。因此，只要没有其它微粒位于相同的窄区域中，就可以通过本公开内容的方法对微粒进行单独地跟踪。不需要由根据图9的光强度分布18所覆盖的全部体积都不含有其它微粒，所述其它微粒也可以被光4驱使以发射光子。
可以在基本上不脱离本公开内容的精神和原理的情况下，对本公开内容的实施例做出许多变型和修改。本文中所有的这些修改和变型旨在包括在由所附权利要求书所限定的本公开内容的范围内。
附图标记列表
1 装置
2 微粒
3 样本
4 光
5 光源
6 激光器
7 光束整形模块
8 物镜
9 光束偏转模块
10 光束偏转模块
11 光束偏转模块
12 点检测器
13 分束器
14 分束器
15 照相机
16 控制器
17 物镜
18 强度分布
19 最小值
20 源
21 白光
22 选择器
23 点检测器
24 点检测器
25 点检测器
26 点检测器
27 分束器
28 分析器
29 微粒
30 光源
31 激光器
32 光
33 分束器
34 微粒
35 强度分布
36 箭头
I 强度
R 速率

Claims (28)

1.一种对样本成像的方法，所述方法包括以下步骤：
提供第一组分的光；
从由在受到所述第一组分的所述光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组中选择微粒；
形成所述第一组分的所述光以提供包括有空间受限最小值的光强度分布；
将所述光强度分布施加到所述样本，以使得所述微粒位于所述光强度分布的所述空间受限最小值中；
检测由所述微粒发射的光子；以及
通过以下方式利用所述光强度分布的所述最小值来跟踪所述微粒的运动：
相对于所述样本移动所述光强度分布，以使得由所述微粒发射的所述光子的速率保持最小，以及
将在所述样本中的所述光强度分布的所述最小值的实际位置作为所述样本中的所述微粒的实际位置；
所述方法的特征在于以下步骤：
针对所述样本的多个部分中的每个部分，确定所述微粒的驻留时间；以及
对所述样本上的所述驻留时间的分布进行绘图。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，针对选自由微粒构成的所述组中的多个微粒中的每个微粒重复跟踪、确定和绘图的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括：
提供与所述第一组分不同的第二组分的其它光；
从由在受到所述其它光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的其它组中选择其它微粒；
形成所述其它光以提供包括有其它空间受限最小值的其它光强度分布；
将所述其它光强度分布施加到所述样本，以使得所述其它微粒位于所述其它光强度分布的所述其它空间受限最小值中：
检测由所述其它微粒发射的光子；
通过以下方式利用所述其它光强度分布的所述最小值来跟踪所述其它微粒的运动：
相对于所述样本移动所述其它光强度分布，以使得由所述其它微粒发射的所述光子的速率保持最小，以及
将所述样本中的所述其它光强度分布的所述其它最小值的实际位置作为所述样本中的所述其它微粒的实际位置；
针对所述样本中的多个部分中的每个部分，确定所述其它微粒的其它驻留时间；以及
对所述样本上的所述其它驻留时间的分布进行绘图。
4.根据权利要求3所述方法，其中，针对选自由微粒构成的所述组中的多个微粒中的每个微粒并且针对选自由微粒构成的所述其它组中的多个其它微粒中的每个微粒，重复跟踪、确定和绘图的步骤。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述光强度分布的所述最小值在至少一个空间维度上空间受限；其中，利用所述光强度分布的所述最小值在所述最小值在空间上受限的所有维度的所有方向上对所述微粒进行跟踪，并且其中，所述样本的所述多个部分中的每个部分在所述最小值在空间上受限的所有维度的所有方向上都空间受限，针对所述样本的所述多个部分中的每个部分确定了所述微粒的所述驻留时间。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，形成所述光以提供所述光强度分布，因为对所述光的相干光束的波前进行调制，并且因为将具有经调制的波前的所述光的光束聚焦到所述样本中，以提供所述光强度分布的所述最小值，所述最小值为干涉图样的基本上零强度的点。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，动态地改变所述波前的调制，以使得所述光强度分布的所述最小值在不同的空间维度上交替地空间受限。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，形成所述光以提供所述光强度分布，因为将所述光的至少两束相干光束聚焦到所述样本中的相同聚焦区中，以提供所述光强度分布的所述最小值，所述最小值为干涉图样的基本上零强度的点。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，形成所述光以提供所述光强度分布，以使得所述空间受限最小值的空间位置不会随着所述光的波长而变化。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过点检测器来检测所述光子。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过至少两个邻近的点检测器来检测所述光子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，根据由所述微粒发射并且被所述邻近的点检测器检测到的光子的相对数量来确定所述微粒的初始运动的方向。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，利用照相机对所述样本进行成像。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，当所述样本均匀地受到所述光的照射时，利用所述照相机来确定所述微粒的起始位置。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，根据利用所述照相机检测到的由所述样本反射的所述光所在的位置，来确定所述样本中的所述光强度分布的所述最小值的实际位置。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，根据用于相对于所述样本移动所述光强度分布的扫描仪的实际设置，来确定所述样本中的所述光强度分布的所述最小值的实际位置。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其中，根据由所述照相机检测到的由所述微粒发射的光子所在的位置，来确定所述微粒的初始运动的方向。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中，以脉冲的形式将所述光施加到所述样本，并且其中，在所述脉冲中的每个脉冲之后的有限的时间间隔内检测由所述微粒发射的光子。
19.根据权利要求18所述方法，其中，从白光中选择所述光。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其中，从由通过多光子过程在受到所述光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成组中选择所述微粒。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对由所述微粒发射的光子进行分析，以确定选自由以下特征构成的组中的至少一个特征：
波长，
偏振，
绝对速率，
由邻近的点检测器检测到的相对数量，
一致性，以及
在所述光的每个脉冲之后的检测时间点。
22.根据权利要求1或2所述的方法，其中，分析从包括有所述光强度分布的所述最小值的检测体积当中发射的光子，以确定选自由以下特征构成的组中的至少一个特征：
波长，
偏振，
绝对速率，
由邻近的点检测器检测到的相对数量，
一致性，以及
在所述光的每个脉冲之后的检测时间点，并且
其中，检查所确定的至少一个特征与发射所分析的光子的单个微粒的符合性。
23.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过漂白一数量的微粒中的至少一个微粒，来减少所述样本中的、属于由微粒构成的所述组的微粒的所述一数量。
24.根据权利要求1或2所述的方法，其中，从由能够从第一状态激活至第二状态中的微粒构成的子组中选择所述微粒，在所述第一状态中不能通过所述光来驱使所述微粒以发射光子，在所述第二状态中可以通过所述光来驱使所述微粒以发射光子。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，从由能够在多光子过程中通过激活光从所述第一状态激活至所述第二状态中的微粒构成的亚子组中选择所述微粒，并且其中，通过被聚焦到所述样本中的激活光来激活所述微粒。
26.根据权利要求1或2所述的方法，其中，关断信号被提供有包含所述光强度分布的信号强度分布，所述关断信号将属于由在受到所述光的照射下被驱使以发射光子的微粒构成的所述组的另外的微粒关断。
27.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对由所述微粒发射并且被检测到的光子进行计数，并且其中，指示已经由所述微粒发射并且被检测到的所述光子的绝对数量。
28.根据权利要求1或2所述的方法，其中，利用所述光强度分布的最小值，来交替地跟踪选自由微粒构成的所述组的两个微粒的运动。
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