CN101655460B - 用于快速光学跟踪单分子的方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的用于快速光学跟踪单分子的方法和装置涉及单分子荧光光谱的检测与信号处理技术。通过单光子探测技术对分子荧光进行探测，分析探测到的荧光强度最强位置确定单分子的位置，通过计算机反馈控制纳米平移台跟踪分子位置，实现分子运动轨迹的快速跟踪。采用低频正弦波调制用于激发单分子样品的激光信号的方法来提高信噪比。与现有技术相比，本发明采用单光子探测技术能够比较精细地确定与快速跟踪单分子位置，光电反馈控制纳米平移台中心位置随单分子位置变化可以实时反映出单分子运动轨道，调制与解调技术的使用有效抑制了背景噪声对单分子荧光信号探测的影响。
Description
技术领域
本发明涉及一种单分子荧光光谱的检测与信号处理技术，具体为用于快速光学跟踪单分子的方法及其装置。
背景技术
多年以来，人们对微观世界的观测和研究都是建立在多分子系综平均的基础上。直到二十世纪八十年代扫描隧道显微镜和光镊技术等的出现，进而九十年代单分子科学的形成与发展才使人们在原子、分子尺度上观察和操纵微观物质世界。单分子探测可以揭示生物大分子的结构和运动状态，对于空间分布的样品，例如一个活体细胞，单分子探测能够提供被研究分子的精确位置，可以直接、无介入地观察活体细胞中微量的生物高聚物以及定量测量复杂生物过程的动力学和统计行为。
单分子快速跟踪与定位是研究分子探针、纳米材料和分子反应动力学等的重要手段和关键技术。目前，单分子的光学探测与定位的一般方法是由激光器输出激光脉冲，激光首先经过二向色镜反射进入显微镜物镜，然后聚焦到置于平移台的样品上对被研究的分子进行激发，分子被激光激发后，自发辐射的荧光光子被该物镜收集，沿着激发光相反的方向透射通过二向色镜，然后进入探测系统，通过采用对分子荧光长时间积分的CCD成像测量方法确定分子的空间位置。但是这种方法需要长的积分时间，一般为几分钟至数十分钟，会掩盖单分子的精细动态变化过程，不能满足快速、实时跟踪单分子运动轨迹的测量要求。
发明内容
为了能够实时显示单分子的空间位置和快速跟踪单分子的运动轨迹，本发明提供一种快速光学跟踪单分子的方法以及实现这一方法的装置，可应用于材料科学、生物学、医学、环境科学等涉及单分子实时测量与跟踪方面的领域。
本发明采用的技术方案是：用于快速光学跟踪单分子的方法，由脉冲激光对单分子样品进行扫描，样品中的单分子被共振激发后辐射荧光，接收单分子发出的荧光光子，将荧光光子到达的事件通过光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号，在采样时间内对逻辑电脉冲进行计数，获得荧光的光子计数光谱，对获得的光子计数光谱结果转换成相应的模拟电压信号后进行高斯拟合得到荧光强度最大点的位置即为单分子所处的空间位置，把相应的单分子位置坐标反馈到三维纳米平移台，以此点为中心在在单分子移动范围内重新扫描，确定单分子新的空间位置，通过记录每次扫描获得的单分子的中心位置，实现单分子的跟踪定位。
为了抑制背景噪声对单分子荧光信号探测的影响，从而获得实际被测荧光的荧光光谱，本发明采用的一种优选的技术方案是采用正弦调制电压作为激光强度调制信号，用调制后的激光照射单分子样品，将获得的荧光光子计数光谱结果转换成相应的模拟电压信号后输入锁相放大器，同时将正弦波形调制电压输入锁相放大器，对信号进行解调，通过解调获得实际被测单分子的荧光光谱，再对实际被测单分子的荧光光谱进行高斯拟合。
本发明还提供一种实现上述方法的装置，脉冲激光器产生的激光由一个二向色镜反射后通过显微镜物镜聚焦于样品单分子上，分子被激光激发产生的荧光由显微镜物镜收集，通过二向色镜进入单光子探测器转化为逻辑电脉冲信号，单光子探测器与单光子计数与数模转换系统连接，进行光子计数采集并将这些数字信号线性转换成模拟信号进行处理，计算机控制系统连接三维纳米平移台和单光子计数与数模转换系统，计算机控制系统对信号分析后把单分子位置反馈给三维纳米平移台。
抑制背景噪音的调制解调的装置是声光调制器连接脉冲激光器，信号发生器输出的正弦信号加载在声光调制器的驱动模块上，声光调制器对脉冲激光器输出的激光进行强度调制，单光子计数与数模转换系统和信号发生器分别连接锁相放大器对被调制的模拟信号进行解调，解调后的信号输入与锁相放大器相连的计算机控制系统。
与现有技术相比，本发明的特点是：
(1)采用单光子探测技术能够快速地确定与跟踪单分子位置。
(2)光电反馈控制纳米平移台中心位置随单分子位置变化可以实时反映出单分子运动轨道。
(3)调制与解调技术的使用有效抑制了背景噪声对单分子荧光信号探测的影响。
附图说明
图1为实现本发明所述的装置结构示意图；
图2(1)为单分子荧光计数的1.2×1.2μm空间扫描成像；
图2(2)为y＝-0.12μm位置的荧光光子计数结果；
图2(3)为y＝-0.12μm位置经过调制与解调后的荧光光谱(虚线)和高斯拟合结果(实线)。
图3为跟踪测量分子位置图。
图1中：1-脉冲激光器；2-声光调制器；3-单光子探测器；4-单光子计数与数模转换系统；5-锁相放大器；6-函数信号发生器；7-计算机控制系统；8-三维纳米平移台；9-显微镜物镜。
具体实施方式
以下具体实施方式以SRfluor染料荧光分子为例，对本发明所述的方法和装置做具体说明。SRfluor染料荧光分子结构式为：
其吸收峰为640nm，荧光发射峰为670nm。染料荧光分子被溶解稀释至10-9mol/mol后置于丙三醇溶液中。将混合的溶液滴在清洗干净的盖玻片中央，染料荧光分子随机分布在溶液中，大约每10μm2中有一个染料分子。
本发明可采用多种公知的仪器实现，具体实施方式中采用的仪器为：1-脉冲激光器(PicoQuant，PDL808)，2MHz，输出的激光波长为633nm，功率密度为1.5kW/cm2；2-声光调制器(Crystal Technology，3080-122)；3-单光子探测器(SPCM-15)；4-单光子计数与数模转换系统(SRS SR400)，单光子计数约为50kHz；5-锁相放大器(SRS SR830)；6-函数信号发生器(HP，33120A型)；7-计算机控制系统；8-三维纳米平移台(Tritor 200/20 SG)；9-显微镜物镜(100×，N.A.1.3)，显微镜物镜的空间分辨率为0.3μm。
脉冲激光器1产生的脉冲激光或将连续激光斩波后获得的脉冲激光对置于三维纳米平移台8上的单分子样品进行扫描，扫描的空间为1.2×1.2μm，由于样品浓度很小，可以保证在此空间内仅有一个单分子，扫描步长为为40nm。激光经一个二向色镜反射后通过显微镜物镜9聚焦于单分子上，单分子被共振激发后辐射荧光，荧光由显微镜物镜9收集，通过二向色镜后进入单光子探测器3转化为逻辑电脉冲信号。单光子探测器3与单光子计数与数模转换系统4连接，单光子计数与数模转换系统4在采样时间τ＝50μs内对逻辑电脉冲进行计数，获得荧光的光子计数光谱，并将光子计数光谱结果转换成相应的模拟电压信号，采样时间的重复周期高于激光脉冲序列的重复周期，为了采集到更准确的同步计数信号，激光脉冲序列的重复频率为采样时间的重复频率的整数倍。计算机控制系统7对模拟电压信号进行高斯拟合得到荧光强度最大点的位置即为单分子所处的空间位置(如图2(1)所示)。计算机控制系统7再将此位置反馈给三维纳米平移台8，控制三维纳米平移台8以此点为中心在1.2×1.2μm空间范围内，扫描步长为40nm重新进行扫描，再次扫描得到其荧光最强的中心位置，计算得到相对起始位置的坐标并记录，每次确定中心位置坐标大约需要1.2秒。多次重复上述过程，可得到一组坐标值(xi，yi.i为测量次数)，据此可确定单分子的运动轨迹。图3为扫描15次的记录结果，从图中可以看出分子的运动轨迹，从而实现对单分子进行快速精密跟踪与定位测量。
纳米平移台8是通过调制高压放大模块输出的加载于平移台压电陶瓷上的电压，使得压电陶瓷可以在纳米量级的范围上进行伸缩变化，从而对放置在扫描平台的样品进行三维纳米量级的移动，用于确定分子所处的精确位置。单分子移动范围与单分子的扩散速度相关，在具体测量过程中，扫描步长和空间扫描范围可以根据单分子扩散速度进行优化调节，较大的扫描步长和较小的空间扫描范围可以提高单分子跟踪的速度，但是会降低空间分辨率。本发明选择的扫描步长为40nm，在xy平面扫描纳米平移台8(z＝0)，扫描的空间为1.2×1.2μm，对应在xy平面分别扫描30个步长。
如图2(2)所示y＝-0.12μm所示，扫描过程中直接光子技术测量得到的结果信噪比很低(约为2)。为了抑制背影噪声，获得实际被测单分子的荧光光谱，要对激光和荧光信号进行调制解调。函数信号发生器6输出的正弦波调制信号(1kHz，3.8Vpp)加载到声光调制器2的驱动模块上，对皮秒脉冲激光器1输出的激光进行强度正弦波调制，调节加载到声光调制器2的偏置电压，使得正弦波调制的激光强度范围处于线性激发单分子的区域。被调制后的激光经显微镜物镜9聚焦后照射分子样品，显微镜物镜9收集分子发出的荧光，单光子探测器3收集入射荧光单光子信号，并将探测到的光子转化为逻辑电脉冲信号。单光子计数与数模转换系统4将测量到的计数结果线性转化为相应的模拟信号，即将计数结果线性转换为与计数结果成正比的模拟电压信号，输入锁相放大器5(积分时间为1ms)，同时将信号发生器6的正弦波形调制电压输入锁相放大器5，对信号进行解调，记录荧光信号的强度分布情况，确定荧光信号的最大值所处位置并记录，得到中心位置坐标。调制解调后得到如图2(3)虚线所示荧光光谱结果，具有较高的信噪比(达到20)，通过高斯拟合后如图2(3)实线所示。
Claims (7)
1.用于快速光学跟踪单分子的方法，由脉冲激光对单分子样品进行扫描，样品中的单分子被共振激发后辐射荧光，接收单分子发出的荧光光子，其特征在于：将荧光光子到达的事件通过光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号，在采样时间内对逻辑电脉冲进行计数，获得荧光的光子计数光谱，对获得的光子计数光谱结果转换成相应的模拟电压信号后进行高斯拟合得到荧光强度最大点的位置即为单分子所处的空间位置，把相应的单分子位置坐标反馈到三维纳米平移台(8)，以此点为中心在单分子移动范围内重新扫描，确定单分子新的空间位置，通过记录每次扫描获得的单分子的中心位置，实现单分子的跟踪定位。
2.根据权利要求1所述的用于快速光学跟踪单分子的方法，其特征在于：采用正弦调制电压作为激光强度调制信号，用调制后的激光照射单分子样品，将获得的荧光光子计数光谱结果转换成相应的模拟电压信号后输入锁相放大器（5），同时将正弦波形调制电压输入锁相放大器(5)，对信号进行解调，通过解调获得实际被测单分子的荧光光谱，再对实际被测单分子的荧光光谱进行高斯拟合。
3.根据权利要求1或2所述的用于快速光学跟踪单分子的方法，其特征在于：所述的脉冲激光通过对连续激光进行斩波获得。
4.根据权利要求1或2所述的用于快速光学跟踪单分子的方法，其特征在于：所述的采样时间的重复周期高于激光脉冲序列的重复周期。
5.根据权利要求4所述的用于快速光学跟踪单分子的方法，其特征在于：所述的激光脉冲序列的重复频率为采样时间的重复频率的整数倍。
6.实现如权利要求1所述的用于快速光学跟踪单分子的方法的装置，包括脉冲激光器(1)、单光子探测器(3)，单光子计数与数模转换系统(4)，计算机控制系统(7)，三维纳米平移台(8)，显微镜物镜(9)，其特征在于：脉冲激光器(1)产生的激光由一个二向色镜反射后通过显微镜物镜(9)聚焦于样品单分子上，分子被激光激发产生的荧光由显微镜物镜(9)收集，通过二向色镜进入单光子探测器(3)转化为逻辑电脉冲信号，单光子探测器(3)与单光子计数与数模转换系统(4)连接，进行光子计数采集并将这些数字信号线性转换成模拟信号进行处理，计算机控制系统(7)连接三维纳米平移台(8)和单光子计数与数模转换系统(4)，计算机控制系统(7)对信号分析后把单分子位置反馈给三维纳米平移台(8)。
7.根据权利要求6所述的用于快速光学跟踪单分子的装置，其特征在于：还包括声光调制器(2)、锁相放大器(5)和信号发生器(6)，所述的声光调制器(2)连接脉冲激光器(1)，信号发生器(6)输出的正弦信号加载在声光调制器(2)的驱动模块上，声光调制器(2)对脉冲激光器(1)输出的激光进行强度调制，单光子计数与数模转换系统(4)和信号发生器(6)分别连接锁相放大器(5)对被调制的模拟信号进行解调，解调后的信号输入与锁相放大器(5)相连的计算机控制系统(7)。
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Inventor after: Zhao Yanting Inventor after: Jia Suotang Inventor after: Wang Xiaobo Inventor after: Wei Zhifeng Inventor after: Zhang Guofeng Inventor after: Xiao Liantuan Inventor before: Xiao Liantuan Inventor before: Jia Suotang Inventor before: Wang Xiaobo Inventor before: Wei Zhifeng Inventor before: Zhang Guofeng Inventor before: Zhao Yanting |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110622 |