WO2013031377A1 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム Download PDF

Info

Publication number
WO2013031377A1
WO2013031377A1 PCT/JP2012/066943 JP2012066943W WO2013031377A1 WO 2013031377 A1 WO2013031377 A1 WO 2013031377A1 JP 2012066943 W JP2012066943 W JP 2012066943W WO 2013031377 A1 WO2013031377 A1 WO 2013031377A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
light
detection region
light detection
time
measurement unit
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/066943
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
秀孝 中田
田邊哲也
Original Assignee
オリンパス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オリンパス株式会社 filed Critical オリンパス株式会社
Priority to CN201280042499.1A priority Critical patent/CN103765197B/zh
Priority to EP12828331.4A priority patent/EP2752654A4/en
Priority to JP2013531149A priority patent/JP6010035B2/ja
Publication of WO2013031377A1 publication Critical patent/WO2013031377A1/ja
Priority to US14/190,780 priority patent/US9528923B2/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1429—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its signal processing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence

Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, and uses atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in a solution ( These are hereinafter referred to as “particles”), for example, biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate objects such as viruses and cells, or non- It relates to optical analysis technology that can detect light from biological particles and obtain useful information in the analysis or analysis of those states (interaction, binding / dissociation state, etc.).
  • the present invention relates to an optical analysis device, an optical analysis method, and an optical analysis computer program that enable various optical analyzes by individually detecting light from a single light emitting particle using the optical system as described above.
  • a particle that emits light (hereinafter referred to as “luminescent particle”) is either a particle that emits light itself, or a particle to which an arbitrary luminescent label or luminescent probe is added.
  • the light emitted from the luminescent particles may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or the like.
  • the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, and the average number of staying molecules Based on this, acquisition of information such as the speed or size of movement of fluorescent molecules, concentration, concentration, molecular structure or size change, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation, etc.
  • fluorescence intensity distribution analysis Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA.
  • Patent Document 4 Non-Patent Document 4 and Photon Counting Histogram (PCH.
  • Patent Document 5 are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the confocal volume generated is generated, and by fitting a statistical model formula to the distribution of the histogram, the average of the intrinsic brightness of the fluorescent molecules etc.
  • the average value of the value and the number of molecules staying in the confocal volume is calculated, and based on this information, changes in the structure or size of the molecule, binding / dissociation state, dispersion / aggregation state, etc. are estimated. It will be.
  • Patent Documents 6 and 7 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 8 describes the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by measuring weak light from fluorescent fine particles distributed in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate using a photon counting technique. A signal arithmetic processing technique for detecting the signal is proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method. It can be very small (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). . Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc. When the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the light to be measured is light emitted from one or several fluorescent molecules.
  • statistical processing such as calculation of fluctuation of fluorescence intensity such as calculation of autocorrelation function of fluorescence intensity data measured in time series or fitting to histogram is executed, and light signals from individual fluorescent molecules etc. are processed. It is not individually referenced or analyzed. That is, in these photoanalysis techniques, light signals from a plurality of fluorescent molecules and the like are statistically processed, and statistical average characteristics of the fluorescent molecules and the like are detected.
  • the concentration or number density of the fluorescent molecules or the like to be observed in the sample solution is equal to one second in the equilibrium state.
  • the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time of the order length enters and exits the micro area, and preferably there is always about one fluorescent molecule in the micro area.
  • the concentration of fluorescent molecules or the like in the sample solution used in the above optical analysis technique is typically about 1 nM or more. When it is significantly lower than 1 nM, a time when the fluorescent molecule or the like is not present in the confocal volume occurs, and a statistically significant analysis result cannot be obtained.
  • the detection methods for fluorescent molecules and the like described in Patent Documents 6 to 8 do not include statistical calculation processing of fluctuations in fluorescence intensity, and even if the fluorescent molecules in the sample solution are less than 1 nM, the fluorescent molecules However, it has not been achieved to quantitatively calculate the concentration or number density of fluorescent molecules that are moving randomly in the solution.
  • the applicant of the present application deals with the optical analysis technique including the statistical processing such as FCS, FIDA, etc. in the concentration or number density of the luminescent particles to be observed in Japanese Patent Application No. 2010-044714 and PCT / JP2011 / 53481.
  • An optical analysis technique based on a novel principle that makes it possible to quantitatively observe the state or characteristics of luminescent particles in a sample solution below a certain level is proposed.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, like FCS, FIDA and the like.
  • the photodetection area When used, while moving the position of a minute region (hereinafter referred to as “light detection region”) that is a light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region,
  • the photodetection area includes luminescent particles that are dispersed in the sample solution and move randomly, the light emitted from the luminescent particles is detected, and each of the luminescent particles in the sample solution is detected individually.
  • the sample required for measurement is a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the optical analysis techniques such as FCS and FIDA.
  • the measurement time is short, and the presence of luminescent particles having a lower concentration or number density is detected as compared with the case of optical analysis techniques such as FCS and FIDA, and the concentration, number density or Other characteristics can be detected quantitatively.
  • the light intensity value (or photon count value) sequentially measured with the movement of the position of the light detection region in the sample solution is a time-series light intensity. It is recorded as data, and on the data, an increase in the light intensity value representing the light emitted from the luminescent particles (a signal representing the light of the luminescent particles) is detected.
  • the intensity of light emitted from a single luminescent particle and reaching the photodetector depends on the position of the luminescent particle in the light detection region.
  • the light intensity becomes maximum when the position of the light emitting particle is in the substantially central region of the light detection region (hereinafter, the light intensity of the light emitting particle in the light detection region becomes maximum).
  • the position is referred to as a “maximum intensity point”.
  • the light intensity gradually decreases as the position of the luminescent particle approaches the periphery of the light detection region. That is, the intensity distribution of light emitted and detected from the luminescent particles in the light detection region (hereinafter simply referred to as “light intensity distribution in the light detection region”) is the intensity from the maximum intensity point toward the periphery.
  • the increase profile of the light intensity value representing the light emitted from the luminescent particles on the time-series light intensity data is the light intensity in the light detection region. Since it has a substantially bell-shaped profile corresponding to the distribution, an increase in the light intensity value representing light emitted from the light emitting particles, that is, the signal of the light emitting particle has a certain light intensity value increase profile. It can be detected by determining whether or not it has a substantially bell-shaped profile assumed when passing through the region.
  • the signal profile of the luminescent particles appearing on the time-series light intensity data is also affected by the time resolution when generating the time-series light intensity data.
  • the light intensity is measured by the amount of light received by a photodetector per predetermined measurement unit time.
  • the light intensity usually reaches the light detector and is detected every measurement unit time (bin time) arbitrarily set in the order of submicroseconds to milliseconds. It is expressed by the number of photons.
  • the shorter the measurement unit time that is, the higher the time resolution, the higher the accuracy. It is possible to obtain a substantially bell-shaped increase profile of the light intensity, and if the measurement unit time is too long, that is, if the time resolution is too low, a substantially bell-shaped profile cannot be obtained. That is, in order to detect the signal of the luminescent particles with high accuracy, it is preferable that the measurement unit time is short. However, as the measurement unit time is short, the amount of time-series light intensity data increases and the cost increases. It will be.
  • the signal profile of the luminescent particles obtained on the time-series light intensity data also depends on the moving speed of the light detection region. That is, the higher the moving speed of the light detection region, the shorter the time taken for the light emission particles to be included in the light detection region, and the shorter the time for a single light emission particle signal to appear.
  • a main object of the present invention is to provide a scanning molecule counting method so that a substantially bell-shaped profile of a signal of a luminescent particle can be reliably detected and an excessive increase in the amount of time-series light intensity data can be avoided. It is intended to provide a method for setting a measurement unit time at the time of light measurement at an appropriate value.
  • the above-described problem is an optical analyzer that detects light from luminescent particles that are dispersed in a sample solution and randomly move using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a light detection region moving unit that moves the position of the light detection region of the optical system of the microscope in the sample solution, a light detection unit that detects the amount of light coming from the light detection region every measurement unit time, Generate time-series light intensity data of light from the light detection area detected at each measurement unit time by the light detection unit while moving the position of the light detection area in the sample solution.
  • a signal processing unit that individually detects a signal representing light from each of the luminescent particles in the data, and the measurement unit time is determined based on the size of the light detection region and the moving speed of the position This is achieved by the device.
  • a light-emitting particle dispersed in a sample solution and moving randomly is a particle that emits light, such as atoms, molecules, or aggregates thereof dispersed or dissolved in a sample solution. Any particle may be used as long as it is not fixed to the substrate or the like and freely moves in the solution in Brownian motion.
  • luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes.
  • the illumination light is Corresponds to the focused region (in the confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the luminescent particles emit light without illumination light, for example, chemiluminescence or biological In the case of particles that emit light by light emission, illumination light is not required in the microscope.
  • the light detection unit detects light from the light detection region by photon counting that counts the number of photons that arrive every predetermined measurement unit time (bin time), and in this case, the light intensity in time series The data becomes time-series photon count data.
  • the term “light emitting particle signal” refers to a signal representing light from the light emitting particles unless otherwise specified.
  • the scanning molecule counting method which is the basic configuration of the present invention, first, the position of the photodetection region is moved in the sample solution, that is, the light is passed through the sample solution. Light is sequentially detected while scanning with the detection region. Then, when the light detection region that moves in the sample solution includes light emitting particles that are moving randomly, the light from the light emitting particles is detected, thereby detecting the presence of one light emitting particle. There is expected. Therefore, the light signals from the luminescent particles are detected individually in the sequentially detected light, thereby detecting the presence of the particles individually one by one, and in the solution of particles. Various information regarding the state is acquired.
  • the light detection unit when detecting light, detects the amount of light coming from the light detection region every measurement unit time, and the amount of light detected per measurement unit time or The light intensity is converted into an electrical signal and sent to the signal processing unit to constitute time-series light intensity data.
  • the measurement unit time is too long, the characteristic profile of the signal of the luminescent particles disappears, and if the measurement unit time is too short, the amount of data becomes enormous.
  • whether or not the characteristics of the signal profile of the luminescent particles disappear on the time-series light intensity data depends on the length of the signal of the luminescent particles appearing on the time-series light intensity data and the length of the measurement unit time.
  • the length of the signal of the luminescent particles is determined by the relationship, and depends on the size of the light detection region and the moving speed of the position. Therefore, in the present invention, the length of the measurement unit time is the size of the light detection region and the moving speed of the position so that a characteristic profile of the signal of the luminescent particles can be captured and the amount of data can be suppressed. Is set based on
  • the length of the measurement unit time is determined so that the signal of the luminescent particles in the time-series light intensity data is captured in order to capture the characteristic profile of the luminescent particle signal. It should be set relatively short with respect to the length.
  • the signal length of the luminescent particles is longer as the size of the light detection region is larger, and shorter as the moving speed is higher.As a result, the measurement unit time is set longer as the size of the light detection region is larger, The higher the moving speed, the shorter it may be set.
  • the signal length of the luminescent particles corresponds to the transit time when one luminescent particle passes through the photodetection region, and the transit time is [size of photodetection region] / [movement of photodetection region].
  • [the size of the light detection region] is a dimension or diameter in a direction parallel to the traveling direction of the light detection region). Therefore, the measurement unit time may be set longer as the passage time of the luminescent particles is longer.
  • the measurement unit time in order to capture the characteristics of the profile of the signal from the signal of the luminescent particles on the time-series light intensity data, at least two data points in the time direction are used. (If there is one data point, only the presence or absence of the signal is determined, and the signal profile information is completely lost). Therefore, the measurement unit time is preferably set to be less than half of the passage time when one luminescent particle passes through the light detection region. In this regard, a theoretical approximate value may be used as the transit time of the luminescent particles. As described above, the transit time of the luminescent particles is given by [size of the light detection region] / [moving speed of the light detection region].
  • the moving speed of the light detection region is determined by changing the direction of the mirror in the optical system or the moving speed of the sample container, and the value is estimated with relatively high accuracy.
  • the wavelength of light and the aperture of the objective lens are defined as the outer diameter of a spherical or elliptical sphere in which the intensity of the excitation light in the light detection region is 1 / e 2 of the center intensity. As estimated by using a number, it is difficult to accurately define a surface region where the intensity of the excitation light is substantially zero.
  • the maximum dimension in a direction parallel to the traveling direction of the photodetection area of a spherical body or an elliptical sphere whose excitation light intensity is 1 / e 2 of the intensity at the center is used, and the value given by [approximate diameter of the photodetection area] / [moving speed of the photodetection area] is adopted as the transit time of the luminescent particles. May be.
  • the measurement unit time may be set so that the transit time when one luminescent particle passes through the light detection region overlaps at least three measurement unit times.
  • the passage time when one luminescent particle passes may be the above approximate passage time, or may be a time value obtained experimentally in advance. (The approximate transit time is usually shorter than the experimentally obtained transit time.)
  • the determination as to whether one luminescent particle has entered the light detection region from the detection value signal from the sequential light detection unit is as described above. This may be done based on a signal profile representing time-series light detected by the light detection unit.
  • a signal profile representing time-series light detected by the light detection unit typically, when a signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, it is detected that one luminescent particle has entered the light detection region. It's okay.
  • the signal profile representing the light from the luminescent particles is usually the time-series detection value of the light detection unit, that is, the light intensity data.
  • the signal processing unit of the apparatus of the present invention is configured to detect a pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold as a signal representing light from a single luminescent particle on the time-series light intensity data. It may be.
  • the “predetermined threshold value” can be set to an appropriate value experimentally.
  • the detection target of the apparatus of the present invention is light from a single luminescent particle, the light intensity is very weak, and when one luminescent particle is a single fluorescent molecule or several molecules, The light emitted from the luminescent particles is probabilistically emitted, and there is a possibility that a signal value may be lost in a very short time. When such a lack occurs, it becomes difficult to specify a signal corresponding to the presence of one luminescent particle. Therefore, the signal processing unit smoothes the time-series light intensity data, processes the data so that the missing signal value at a minute time can be ignored, and then uses the smoothed time-series light intensity data. A bell-shaped pulsed signal having an intensity exceeding a predetermined threshold value may be detected as a signal representing light from a single luminescent particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution in the above-described apparatus of the present invention may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the mode of light detected from the luminescent particles can vary depending on the properties of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution. In particular, as the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from one light emitting particle decreases, so that the light from one light emitting particle can be measured with high accuracy or sensitivity. It is preferable that the moving speed can be appropriately changed.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected (average moving speed of particles due to Brownian motion).
  • the apparatus of the present invention detects the light emitted from the light emitting particles when the light detection region passes the position where the light emitting particles exist, and individually detects the light emitting particles.
  • the luminescent particles move randomly in the solution due to Brownian motion and enter and exit the photodetection region multiple times, a signal (representing the presence of the luminescent particles) is emitted multiple times from one luminescent particle.
  • it becomes difficult to make the detected signal correspond to the presence of one luminescent particle.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles, so that one luminescent particle can correspond to one signal (indicating the presence of the luminescent particle). It becomes. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent particles, as described above, according to the characteristics of the luminescent particles (particularly, the diffusion constant), the apparatus of the present invention can appropriately change the movement speed of the light detection region. It is preferable to be configured.
  • the movement of the position of the light detection region in the sample solution may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path of the optical system of the microscope by using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope, or
  • the position of the sample solution may be moved (for example, by moving a microscope stage) to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope, the movement of the light detection region is quick, and mechanical vibrations and hydrodynamic actions are applied to the sample solution. Therefore, it is advantageous in that light can be measured in a stable state without the influence of the mechanical action of the luminescent particles to be detected.
  • the number of light-emitting particles included in the light detection region may be counted by counting the number of signals (particle counting).
  • information on the number density or concentration of the identified luminescent particles in the sample solution can be obtained by combining the number of detected luminescent particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration ratio of a plurality of sample solutions, or the relative number density or concentration ratio with respect to the standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated, or An absolute number density value or concentration value may be determined using a relative number density or concentration ratio relative to a standard sample solution that is a reference for concentration or number density.
  • the total volume of the movement locus of the light detection region position is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the luminescent particles can be reduced. It can be calculated specifically.
  • photodetection is performed by detecting light while moving the position of the light detection region in the sample solution, and individually detecting signals from individual light emitting particles.
  • the processing of the optical analysis technique in which the measurement unit time for light detection is set in consideration of the size of the region and the moving speed of the position can be realized by a general-purpose computer. Therefore, according to another aspect of the present invention, for optical analysis for detecting light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a computer program that causes a computer to execute a procedure for individually detecting a signal representing light from each of the above.
  • light is generated by photon counting that counts the number of photons that arrive at each measurement unit time (bin time). Light from the detection region is detected, and in this case, time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • the measurement unit time is set longer as the size of the light detection region is larger, and is set shorter as the moving speed is higher, or is set longer as the passage time of the luminescent particles is longer. May be.
  • the measurement unit time is less than half of the approximate transit time when one light emitting particle passes through the light detection region, and more preferably when one light emitting particle passes through the light detection region.
  • the measurement unit time may be set so as to overlap with at least three measurement unit times.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on a time-series signal profile.
  • a signal having an intensity greater than a predetermined threshold it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • a bell-shaped pulse-like signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle, and preferably, time-series light
  • the intensity data is smoothed, and a bell-shaped pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the smoothed time-series light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles, the number density or concentration in the sample solution, and preferably in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • a procedure for counting the number of light-emitting particles detected during movement of the position of the light detection region by counting the number of signals from the individually detected light-emitting particles and / or A procedure for determining the number density or concentration of luminescent particles in the sample solution based on the number of detected luminescent particles may be included.
  • an optical analysis method for detecting light of individual luminescent particles while moving the position of the light detection region in the sample solution A novel method is realized in which the measurement unit time for light detection is set in consideration of the size and the moving speed of the position.
  • an optical analysis method for detecting light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution by using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the process of moving the position of the light detection area of the microscope optical system in the solution and the amount of light coming from the light detection area at every measurement unit time while moving the position of the light detection area in the sample solution Time-series light intensity data, and a process for individually detecting signals representing light from individual light-emitting particles in the time-series light intensity data.
  • a method is provided that is determined based on the size of the region and the moving speed of the position.
  • the measurement unit time may be set longer as the size of the light detection region is larger, may be set shorter as the moving speed is higher, or may be set longer as the passage time of the luminescent particles is longer.
  • the measurement unit time is less than half of the approximate transit time when one light emitting particle passes through the light detection region, and more preferably when one light emitting particle passes through the light detection region.
  • the measurement unit time may be set so as to overlap with at least three measurement unit times.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on the time-series signal profile.
  • a signal having an intensity greater than a predetermined threshold it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • a bell-shaped pulse-like signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle, and preferably, time-series light
  • the intensity data is smoothed, and a bell-shaped pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the smoothed time-series light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles, the number density or concentration in the sample solution, and preferably in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • a step of determining the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution based on the number of luminescent particles formed may be included.
  • the optical analysis technique of the present invention described above is typically a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell. It is used for analysis or analysis of the state of matter in solution, but it may also be used for analysis or analysis of the state of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) in solution. It should be understood that such cases are also within the scope of the present invention.
  • a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell. It is used for analysis or analysis of the state of matter in solution, but it may also be used for analysis or analysis of the state of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) in solution. It should be understood that such cases are also within the scope of
  • the measurement unit time at the time of light detection is large in the light detection region so that a characteristic profile of the signal of the luminescent particles on the light intensity data can be captured and the amount of data can be suppressed. It is set based on the height and the moving speed of the position. According to such a configuration, in detecting the signal of the luminescent particles, it is avoided that the time resolution of the data is unnecessarily increased and the amount of data is increased, thereby saving the cost. In addition, when trying to save the amount of data, it is possible to set the measurement unit time while grasping the limit that can capture the characteristics of the signal profile of the luminescent particles more reliably, and the separation of the luminescent particle signal and noise can be performed. Accuracy can be maintained. Furthermore, since the amount of data can be saved while maintaining the accuracy of separation of the light emitting particle signal and noise, the load of signal processing in the light emitting particle signal detection processing is reduced.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIG. 1D is a schematic diagram of a mechanism for moving the position of the photodetection region in the sample solution by moving the horizontal position of the microplate.
  • FIGS. 2A and 2B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection in the scanning molecule counting method to which the present invention is applied, and a schematic diagram of time variation of the measured light intensity, respectively.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region
  • FIG. 2C is a diagram illustrating the relationship between the change in the intensity of light from the luminescent particles and the measurement unit time.
  • FIG. 2D is a schematic diagram of the light detection region, and schematically shows that the transit time of the luminescent particles varies depending on the passage position.
  • FIG. 3 is a flowchart showing the processing procedure of the scanning molecule counting method executed in accordance with the present invention.
  • 4A and 4B show the case where the luminescent particles traverse the light detection region while performing Brownian motion, and the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. It is a model figure showing the mode of movement of particles when luminous particles cross a photodetection region by moving.
  • FIG. 4C shows the signal processing process of the detection signal in the processing procedure for detecting the presence of the luminescent particles from the measured time-series light intensity data (time change of the photon count) according to the scanning molecule counting method.
  • FIG. 5 shows an actual measurement example (bar graph) of measured photon count data, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the pulse existence region.
  • a signal labeled “noise” is ignored as it is a signal due to noise or foreign matter.
  • FIG. 6 shows the distribution of the number of data points included in the pulse signal detected as the luminescent particle signal.
  • FIG. 7 is an example of the time change of photon count (light intensity) obtained in the conventional optical analysis technique for calculating the fluctuation of fluorescence intensity.
  • FIG. 7A shows that the concentration of particles in the sample is sufficient. This is a case where measurement accuracy is given, and (B) is a case where the concentration of particles in the sample is significantly lower than in (A).
  • optical analysis apparatus 1 that realizes the optical analysis technique according to the present invention is capable of executing FCS, FIDA, and the like as schematically illustrated in FIG.
  • the apparatus may be a combination of an optical system of a confocal microscope and a photodetector.
  • optical analysis apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8. Is incident on.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • luminescent particles that are the object of observation typically particles to which luminescent labels such as fluorescent particles or fluorescent dyes have been added are dispersed or dissolved, and these luminescent particles enter the excitation region.
  • the luminescent particles are excited and light is emitted.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14. (Here, only the light component of a specific wavelength band is selected.), Introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, is converted into a time-series electrical signal, and then to the computer 18.
  • Input and processing for optical analysis is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and as a result, as shown in FIG. Only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region as schematically shown, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • the focal region of the laser beam illustrated in FIG. 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is in the region).
  • the photodetector 16 is preferably an ultra-high light that can be used for photon counting.
  • a sensitive photodetector is used.
  • the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • a mechanism for scanning the sample solution with the light detection region that is, for moving the position of the focal region, that is, the light detection region in the sample solution.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. A method of moving the absolute position of the light detection area).
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • FIG. 1D the horizontal position of the container 10 (microplate 9) into which the sample solution is injected is moved to detect light in the sample solution.
  • the stage position changing device 17a may be operated to move the relative position of the region (a method of moving the absolute position of the sample solution).
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a cooperates with the light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18 in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18). It may be.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 or the stage up and down.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed. Further, when the luminescent particles to be observed emit light regardless of excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence phenomenon, the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted. When the luminescent particles emit light by phosphorescence or scattering, the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light may be appropriately selected according to the excitation wavelength of the luminescent particles.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a plurality of types of light emitting particles having different wavelengths are included in the sample, light can be separately detected based on the wavelengths. It's okay.
  • light detection light polarized in a predetermined direction may be used as excitation light, and a component in a direction perpendicular to the polarization direction of excitation light may be selected as detection light.
  • a polarizer (not shown) is inserted in the excitation light optical path, and the polarization beam splitter 14a is inserted in the detection light optical path. According to this configuration, it is possible to significantly reduce the background light in the detection light.
  • optical analysis technique of the present invention As described in the column “Summary of the Invention”, the optical analysis technique of the present invention is simply described as follows.
  • the unit of measurement of the light detection process so that the characteristics of the substantially bell-shaped profile of the signal of the luminescent particles on the data are not lost, the signal of the luminescent particles can be detected accurately, and the amount of data is not excessive.
  • Time photon counting bin time
  • the principle of setting the measurement unit time and the scanning molecule counting method of the present invention will be described.
  • the spectroscopic analysis technology such as FCS and FIDA is superior to the conventional biochemical analysis technology in that it requires a very small amount of sample and can perform inspection quickly. ing.
  • the concentration and characteristics of the luminescent particles are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity. As shown schematically in FIG. 11A, the concentration or number density of the luminescent particles is a level at which about one luminescent particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. As shown on the right side of the figure, it is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the luminescent particles is lower than that, for example, as shown in FIG. 11B, the luminescent particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV. As illustrated on the right side of the figure, a significant light intensity signal (photon count) appears only during a part of the measurement time, making it difficult to accurately calculate the fluctuation of the light intensity. Also, if the concentration of the luminescent particles is much lower than the level at which about one luminescent particle is always present in the light detection area during measurement, the light intensity fluctuation is affected by the background. The measurement time is long to easily obtain significant light intensity data sufficient for calculation.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region is driven to change the optical path, or the sample solution is changed.
  • the horizontal position of the injected container 10 (microplate 9) is moved, and the position of the light detection region CV in the sample solution as schematically illustrated in FIG. , That is, light detection is performed while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • the light detection region CV moves (time to to t2 in the figure) and passes through the region where one light emitting particle exists (t1), light is emitted from the light emitting particle, A pulse-like signal having a significant light intensity (Em) appears on the time-series light intensity data as depicted in FIG.
  • Em significant light intensity
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection are executed, and pulse-like signals (significant light intensity) appearing in the meantime illustrated in FIG. 2B are detected one by one.
  • the luminescent particles are individually detected, and the number of the luminescent particles is counted to obtain information on the number, concentration, or number density of the luminescent particles present in the measured region.
  • the light intensity value is the amount of light received by the photodetector per predetermined measurement unit time.
  • the light intensity reaches the photodetector and is detected for each measurement unit time (bin time) arbitrarily set in the order of submicroseconds to milliseconds. It is represented by Therefore, the time-series light intensity data is actually a data point representing the light quantity or the number of photons per measurement unit time arranged in time series, so the signal profile of the luminescent particles appearing there is measured It will change depending on the length of unit time or bin time.
  • the length of the measurement unit time or bin time is set so that the shape characteristic of the luminescent particle signal can be captured. It is sufficient to make it sufficiently shorter than the length.
  • the length of the measurement unit time or bin time becomes shorter, the number of data points increases and the amount of data becomes enormous, which can lead to an increase in data processing load and cost.
  • the length of the measurement unit time or bin time at the time of light measurement can be discriminated between the light emitting particle signal and the noise signal according to the shape characteristic of the light emitting particle signal. And it is set so as not to unnecessarily increase the number of data points.
  • FIG. 2 (C) the profile I R and length Tp of the pulse signal of the light emission particles, shows the relationship between the measurement unit time .DELTA..tau. Referring to the figure, first, when the measurement unit time is longer than the length Tp of the pulse signal of the luminescent particles, that is, [I] Tp ⁇ 1 For, the profile I R of the pulse signal of luminescent particles, the data point Dp is only the single point.
  • the substantially bell-shaped feature of the pulse signal profile of the light-emitting particle disappears, and the information is only the magnitude of the intensity value. Therefore, the pulse signal of the light-emitting particle is based on the shape feature of the pulse signal of the light-emitting particle. Is extremely difficult to detect.
  • the measurement unit time is [Ii] Tp> ⁇ 2 ⁇ 1/2 Tp
  • the data point Dp is a two-point, also in this case, the value of the data point Dp is substantially bell-shaped characteristic, that is, the time direction Therefore, it is difficult to detect the pulse signal of the luminescent particles based on the shape characteristic of the pulse signal of the luminescent particles.
  • the measurement unit time is shorter than 1 ⁇ 2 of the length Tp of the pulse signal of the luminescent particles, that is, [Iii] 1/2 Tp> ⁇ 3 ⁇ 1/3 Tp, [Iv] 1/3 Tp> ⁇ 4 ⁇ 1/4 Tp, [V] 1/4 Tp> ⁇ 5 ⁇ 1/5 Tp, ... And so on.
  • the number of data points Dp is at least 3, and approximately bell-shaped features whose values change in the order of small, large, and small along the time direction are stored, and are based on the shape characteristics of the pulse signal of the luminescent particles.
  • the pulse signal of the luminescent particles can be detected.
  • the length of the measurement unit time may be set so that three or more data points Dp are included in the generation time of the pulse signal of the luminescent particles.
  • the generation time of the pulse signal of the luminescent particles corresponds to the time during which the luminescent particles pass through the light detection region.
  • One data point corresponds to one measurement unit time. Therefore, after all, the length of the measurement unit time may be set so that the transit time when one luminescent particle passes through the light detection region overlaps at least three measurement unit times.
  • the length of the measurement unit time may be set so that four or more data points Dp are included in the passage time when one luminescent particle passes through the light detection region. (That is, the length of the measurement unit time may be set so that the passage time when one luminescent particle passes through the light detection region overlaps at least four measurement unit times.)
  • the specific setting of the measurement unit time or bin time may be made based on the size of the light detection area and the moving speed of the light detection area.
  • the length of the signal of the luminescent particle that is a reference for an appropriate measurement unit time or bin time that is, when one luminescent particle passes through the light detection region.
  • the transit time is theoretically [Size of photodetection area] / [Movement speed of photodetection area] (1) Therefore, the measurement unit time or bin time may be appropriately determined with reference to the theoretical value.
  • the transit time of the luminescent particles becomes longer as the size of the light detection region is larger, and becomes shorter as the moving speed of the light detection region is higher.
  • the measurement unit time or bin time may be increased or decreased.
  • the moving speed of the light detection region can be calculated uniquely and accurately from the locus and period of the light detection region.
  • the size of the light detection region can be calculated by emitting light if necessary.
  • the distance of the trajectory in the light detection area of the particle that is, the length in the direction parallel to the moving direction (scanning direction) of the light detection area, and varies depending on the passing position of the light emitting particle in the light detection area. It becomes.
  • the light detection area is a sphere or an ellipsoid
  • [the size of the light detection area] in the equation (1) corresponding to the distance across the sphere or ellipsoid.
  • the passing distances of the light emitting particles ⁇ , ⁇ , and ⁇ become shorter in order.
  • ⁇ is the excitation wavelength
  • D is the incident light beam diameter
  • f is the focal length of the objective lens. Therefore, the value calculated from equation (1) using the value calculated from equation (2) as an approximate value of the size of the light detection region is the transit time when one luminescent particle passes through the light detection region.
  • the measurement unit time or bin time may be determined by referring to an approximate value (approximate transit time) (that is, the length Tp of the pulse signal of the luminescent particles).
  • the transit time when one luminescent particle passes through the light detection region should include at least three data points
  • the measurement unit time or bin time may be set to, for example, less than half of the approximate transit time, and preferably about 1/3.
  • the measurement unit time or bin time may be determined so as to include at least three data points within the approximate transit time.
  • the measurement unit time or bin time is more reliable for the signal of the luminescent particles passing through the periphery of the light detection region in consideration of the fact that the passage time becomes shorter as the passing position of the luminescent particles approaches the periphery of the light detection region.
  • a time sufficiently shorter than 1/3 of the estimated transit time so that at least three data points are included in the transit time of the luminescent particles passing through the periphery of the photodetection region may be set to about 1/6 of the time.
  • the passage time when one luminescent particle passes through the light detection region can be determined in advance by experiment, at least three data points are included in the passage time of the luminescent particle obtained experimentally.
  • the measurement unit time or the bin time may be determined.
  • FIG. 3 shows processing in this embodiment expressed in the form of a flowchart.
  • the particles to be observed in the optical analysis technique of the present invention are arbitrary as long as they are dispersed particles in the sample solution and move randomly in the solution, such as dissolved molecules.
  • biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells, metal colloids, other non-biological molecules, etc. It's okay.
  • a luminescent label fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical / bioluminescent molecule
  • the sample solution is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution are started.
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a drives the mirror 7 (galvanomirror) or the microplate 9 on the stage of the microscope, and the wells.
  • the position of the light detection region is moved, and at the same time, the light detector 16 sequentially converts the detected light into an electric signal and transmits it to the computer 18.
  • time-series light intensity data is generated from the transmitted signal and stored.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, and therefore when the light detection is based on photon counting, the time-series light intensity data is a time-series data. It may be photon count data.
  • the bin time in photon counting is appropriately set so that at least three data points are included in the approximate transit time or the experimentally obtained particle transit time.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so that the movement distance can be grasped.
  • the movement of the position of the light detection area is executed at.
  • the movement speed is basically a constant speed.
  • the present invention is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to quantitatively and accurately execute individual detection of luminescent particles from the measured time-series light intensity data, or counting of the number of luminescent particles.
  • the moving speed is preferably set to a value faster than the random movement of the luminescent particles, that is, the moving speed due to the Brownian movement.
  • the observation target particle of the optical analysis technique of the present invention is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely and randomly, the position moves with time by Brownian motion. Accordingly, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the moving speed of the position of the light detection region is the average moving speed (diffusion due to the Brownian motion of the particle) It is set faster than (moving speed).
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s or more, which is 10 times or more.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 detects the signal of the luminescent particles and detects the luminescent particles by processing according to the program stored in the storage device. Various analyzes such as counting and concentration calculation are executed.
  • step 110 to 160 Individual detection of luminescent particle signals
  • a process for individually detecting a signal of the luminescent particles is executed on the light intensity data.
  • the locus of one luminescent particle passing through the light detection region is substantially linear as shown in FIG. 4B
  • the light intensity in the signal corresponding to the particle is substantially linear as shown in FIG. 4B
  • the change in the light intensity on the data has a substantially bell-shaped profile reflecting the light intensity distribution in the light detection region determined by the optical system. Therefore, in the scanning molecule counting method, basically, when the time width ⁇ in which the light intensity value exceeding the threshold Ith set appropriately is continued in the predetermined range on the light intensity data, the light intensity profile is obtained.
  • the signal it has corresponds to the passage of one particle through the light detection region and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose light intensity does not exceed the threshold value Ith or whose time width ⁇ is not within a predetermined range is determined as a noise or foreign matter signal.
  • the light intensity profile corresponds to the passage of one particle through the light detection region, and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose intensity A and width a are outside the predetermined range is determined as a noise or foreign object signal and may be ignored in the subsequent analysis or the like.
  • smoothing is performed on the light intensity data (FIG. 4C, “detection result (unprocessed)” at the uppermost stage).
  • Processing is performed (FIG. 3-step 110, upper part “smoothing” in FIG. 4C).
  • the light emitted by the luminescent particles is probabilistically emitted, and data values may be lost in a very short time. Therefore, such a data value loss can be ignored by the smoothing process.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • the parameters for executing the smoothing process are the moving speed (scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data Speed) and BIN TIME may be set as appropriate.
  • a primary differential value with respect to time of the light intensity data is calculated (step 120).
  • the time differential value of the light intensity data has a large change in the value at the time of change of the signal value as illustrated in the lower “time differential” in FIG.
  • the significant signal start and end points can be advantageously determined.
  • step 130 significant pulse signals are sequentially detected on the light intensity data. Specifically, first, the start and end points of one pulse signal are searched and determined sequentially on the time differential value data of the light intensity data to identify the pulse existence region. (Step 130). When one pulse existence area is specified, a bell-shaped function fitting is performed on the smoothed light intensity data in the pulse existence area (FIG. 4 (C), lower section “bell-shaped function fitting”). Parameters such as the intensity Ipeak of the peak (maximum value) of the pulse of the bell-shaped function, the pulse width (full width at half maximum) Wpeak, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function. Whether or not the calculated bell-shaped function parameter is within a range assumed for the bell-shaped profile parameter drawn by the pulse signal detected when one luminescent particle passes through the light detection region, That is, it is determined whether or not the peak intensity, pulse width, and correlation coefficient of the pulse are within predetermined ranges (step 150). Thus, as shown in the left of FIG. 5, the signal determined that the calculated bell-shaped function parameter is within the range assumed in the signal corresponding to one luminescent particle is one luminescent particle. Thus, one luminescent particle is detected. On the other hand, as shown in the right of FIG. 5, a pulse signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise. Note that the counting of the number of signals, that is, the counting of the luminescent particles may be performed simultaneously with the detection of the signal of the luminescent particles.
  • the search and determination of the pulse signal in the processing of the above steps 130 to 150 may be repeatedly executed over the entire area of the light intensity data (step 160).
  • the process which detects the signal of a luminescent particle separately from light intensity data is not restricted to said procedure, You may perform by arbitrary methods.
  • the total volume of the region through which the light detection region passes may be theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • control solution a plurality of solutions having different concentrations of luminescent particles are prepared, measurement is performed for each, and the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be like this.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the relationship between the concentration C of various standard luminescent particles and the number N of luminescent particles (formula (7)) regarding the assumed movement pattern of the light detection region. ) May be stored in advance in the storage device of the computer 18 so that the user can use the information stored as appropriate when the user of the device performs optical analysis.
  • the influence of the measurement unit time on the detection of the luminescent particle signal was verified by variously changing the measurement unit time in the light detection process.
  • a solution containing a fluorescent buffer ATTO633 (ATTO-TEC) at 10 pM as a luminescent particle in a phosphate buffer (containing 0.1% Pluronic F-127) was prepared.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device, and the above-mentioned “(2) Sample solution In accordance with the embodiment described in “Measurement of Light Intensity”, time-series light intensity data (photon count data) was obtained for the sample solution.
  • laser light of 633 nm was used as excitation light, and light in a wavelength band of 660 to 710 nm was measured using a bandpass filter to generate time-series photon count data.
  • the laser power of the excitation light was 200 ⁇ W.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 15 mm / second, BIN TIME was 1 ⁇ sec, and measurement was performed for 1 second.
  • the time-series photon count data is obtained so that the BIN TIME is 10, 20, 30, 50, and 100 ⁇ sec for the acquired time-series photon count data, respectively.
  • reconstruction data with a BIN TIME of 10 ⁇ s was generated by adding the number of 10 photons at a data point of BIN TIME 1 ⁇ s to generate one data point).
  • individual detection of the luminescent particle signal and counting of the number of signals were performed.
  • the detection of the luminescent particle signal is performed by performing smoothing processing on the time-series photon count data according to the procedure described in “(i) Individual detection of luminescent particle signal” and steps 110 to 160 in FIG. After determining the start and end points of the pulse signal, fitting a Gaussian function to each pulse signal by the method of least squares, (in the Gaussian function) peak intensity, pulse width (full width at half maximum), correlation coefficient It was determined. And the following conditions: 20 ⁇ sec ⁇ pulse width ⁇ 400 ⁇ sec peak intensity> 1 [pc / 10 ⁇ s] (A) Correlation coefficient> 0.90 Only pulse signals satisfying the above conditions were extracted as luminescent particle signals, and the number of signals was counted.
  • Table 1 shows the number of signals detected as the luminescent particle signal and the amount of reconstruction data in each of the reconstructed time-series photon count data.
  • the BIN TIME is preferably set to less than half of the approximate transit time, more preferably about 1/3, so that the substantially bell-shaped profile characteristics of the luminescent particle signal are maintained. This suggests that luminescent particles can be detected with high accuracy. In addition, the amount of data can be suppressed by making BIN TIME shorter than necessary.
  • FIG. 6A shows the number of detected pulse signals with respect to the number of data points included in the detected pulse signal when BIN TIME is 20 ⁇ s
  • FIG. 6B shows the case when BIN TIME is 30 ⁇ s.
  • the number of detection pulse signals with respect to the number of data points included in the detection pulse signal is shown.
  • the signal detected as the signal of the luminescent particles contained at least three data points. The number of detected pulse signals including 4 to 5 data points was particularly large.
  • the reason why the number of detected pulse signals when the BIN TIME is 30 ⁇ s is reduced compared to the case where the BIN TIME is 20 ⁇ s is that the BIN TIME is 30 ⁇ s.
  • the number of data points included in the signal of each luminescent particle is reduced, and as a result, the luminescent particle having a short transit time passing through a position close to the periphery of the light detection region. This is thought to be because the characteristics of the bell-shaped profile of the signal disappeared.
  • the signal of the luminescent particle is based on its substantially bell-shaped profile. It can be detected with high accuracy, and an excessive increase in the amount of time-series light intensity data can be avoided.

Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、発光粒子の信号の略釣鐘状のプロファイルが確実に検出され、且つ、時系列光強度データのデータ量の過剰な増大を回避できるように、光測定の際の計測単位時間が適正な値に設定される光分析技術が提供される。本発明による試料溶液中の発光粒子の光を検出する光分析技術は、試料溶液内に於いて顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列光強度データを生成し、そのデータに於いて、個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する。光検出領域からの光の検出に於ける計測単位時間が光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定される。

Description

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
　本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１－３、非特許文献１－３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特開２００９－２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要　１９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.　Kask,　K.　Palo,　D.　Ullmann,　K.　Gall　PNAS　96,　13756-13761　(1999)）
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６～８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。
　上記の走査分子計数法では、より具体的には、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動と共に、逐次的に計測された光強度値（若しくはフォトンカウント値）が時系列の光強度データとして記録され、そのデータ上に於いて、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大（発光粒子の光を表す信号）が検出される。この点に関し、一般に、走査分子計数法を実施する光分析装置に於いて、単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域に於ける発光粒子の位置によって異なっており、典型的には、発光粒子の位置が光検出領域の略中心領域に在るときに光強度は最大となり（以下、光検出領域内に於ける発光粒子の光強度が最大となる位置を「最大強度点」と称する。）、発光粒子の位置が光検出領域の周縁へ近づくほど、光強度は徐々に低減する。即ち、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布（以下、単に「光検出領域内の光強度分布」と称する。）は、最大強度点から周縁に向かって強度が低減する略釣鐘状のプロファイルを有している。従って、発光粒子が略直線状に光検出領域内を通過するとすれば、時系列光強度データ上の発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大のプロファイルは、光検出領域内の光強度分布に対応した略釣鐘状のプロファイルとなるので、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大、即ち、発光粒子の信号は、或る光強度値の増大のプロファイルが発光粒子の光検出領域内の通過時に想定される略釣鐘状のプロファイルとなっているか否かを判定することにより検出可能となる。
　一方、時系列光強度データ上に現れる発光粒子の信号のプロファイルは、時系列光強度データ生成時の時間分解能にも影響される。典型的には、走査分子計数法を実施する光分析装置に於いて、光強度は、所定の計測単位時間当たりに光検出器にて受光された光量により計測される。例えば、光の計測がフォトンカウンティングによる場合には、光強度は、通常、サブマイクロ秒～ミリ秒のオーダーにて任意設定される計測単位時間（ビンタイム）毎に、光検出器に到達し検知された光子の数にて表される。従って、かかる計測単位時間当たりの光量にて光強度値の測定を逐次的に行い、時系列光強度データを生成する場合、計測単位時間が短いほど、即ち、時間分解能を高くするほど、高精度にて略釣鐘状の光強度値の増大のプロファイルを取得することが可能となり、計測単位時間が長過ぎると、即ち、時間分解能を低く過ぎると、略釣鐘状のプロファイルが得られなくなってしまう。つまり、発光粒子の信号を高精度にて検出するためには、計測単位時間が短い方が好ましいところ、計測単位時間が短いほど、時系列光強度データのデータ量が増大し、コストが増大することとなる。また、時系列光強度データ上で得られる発光粒子の信号のプロファイルは、光検出領域の移動速度にも依存する。即ち、光検出領域の移動速度が高いほど、発光粒子の光検出領域内に包含される時間が短くなり、単一の発光粒子の信号の出現する時間は短くなる。
　かくして、本発明の主な課題は、発光粒子の信号の略釣鐘状のプロファイルが確実に検出され、且つ、時系列光強度データのデータ量の過剰な増大を回避できるように、走査分子計数法に於ける光測定の際の計測単位時間を適正な値に設定する手法を提供することである。
　本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、計測単位時間毎に光検出領域から到来する光量を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて計測単位時間毎に検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、計測単位時間が光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定されることを特徴とする装置によって達成される。
　かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、典型的には、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
　上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。かかる構成に於いて、既に述べた如く、光の検出に際しては、光検出部が計測単位時間毎に光検出領域から到来する光量を検出し、計測単位時間当たりに検出された光量の大きさ又は光強度が電気信号に変換されて信号処理部へ送られ、時系列光強度データを構成する。その場合に、計測単位時間が長過ぎると、発光粒子の信号の特徴的なプロファイルが消失し、計測単位時間が短過ぎると、データ量が膨大となる。この点に関し、発光粒子の信号のプロファイルの特徴が時系列光強度データ上で消失するか否かは、時系列光強度データ上に出現する発光粒子の信号の長さと計測単位時間の長さとの関係によって決定され、発光粒子の信号の長さは、光検出領域の大きさと位置の移動速度とに依存する。そこで、本発明に於いては、発光粒子の信号の特徴的なプロファイルが捉えられ、且つデータ量が抑制できるように、計測単位時間の長さが、光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて設定される。
　上記の計測単位時間の設定に関して、より詳細には、計測単位時間の長さは、発光粒子の信号の特徴的なプロファイルを捉えるために、時系列光強度データ上に於ける発光粒子の信号の長さに対して相対的に短く設定すべきである。発光粒子の信号の長さは、光検出領域の大きさが大きいほど長くなり、移動速度が高いほど短くなるので、結局、計測単位時間は、光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、移動速度が高いほど短く設定されてよい。また、発光粒子の信号の長さは、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間に相当し、かかる通過時間は、［光検出領域の大きさ］／［光検出領域の移動速度］にて与えられる（ここで、［光検出領域の大きさ］とは、光検出領域の進行方向に平行な方向の寸法又は径である。）。従って、計測単位時間は、発光粒子の通過時間が長いほど長く設定されてよいこととなる。
　また、計測単位時間の設定について、更に詳細には、時系列光強度データ上に於ける発光粒子の信号からその信号のプロファイルの特徴を捉えるためには、時間方向に於いて少なくとも２つのデータ点が必要である（もしデータ点が一つであれば、信号の存在の有無のみが判別されるだけで、信号のプロファイルの情報は完全に消滅する。）。従って、計測単位時間は、好適には、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間の半分未満に設定される。この点に関し、発光粒子の通過時間としては、理論的な概算値が用いられてよい。上記の如く、発光粒子の通過時間は、［光検出領域の大きさ］／［光検出領域の移動速度］にて与えられる。ここで、光検出領域の移動速度は、後に詳細に述べる如く、光学系内のミラーの向きの変更又は試料容器の移動の速度により決定され、その値は、比較的精度良く見積もられる。しかしながら、光検出領域の大きさについては、光検出領域に於ける励起光の強度がその中心の強度の１／ｅ２となる球面体又は楕円球体の外径として光の波長と対物レンズの開口数を用いて概算されるが、正確に励起光の強度が実質的に０となる面領域を画定することは困難である。そこで、［光検出領域の大きさ］の概算値として、励起光の強度がその中心の強度の１／ｅ２となる球面体又は楕円球体の光検出領域の進行方向に平行な方向の最大寸法又は最大径（光検出領域の概算径）が用いられ、発光粒子の通過時間として、［光検出領域の概算径］／［光検出領域の移動速度］により与えられる値（概算通過時間）が採用されてよい。
　更に、後に示す実施例の実験の結果によれば、一つの発光粒子が光検出領域を通過する間に少なくとも３つのデータ点、より好適には、４つ以上のデータ点が含まれていると、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号をより精度良く検出できることが示された。ここで、一つの計測単位時間に於いて、一つのデータ点が与えられる。従って、上記の装置に於いては、好適には、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの計測単位時間と重複するよう計測単位時間が設定されてよい。なお、一つの発光粒子が通過する際の通過時間は、上記の概算通過時間であってもよく、予め実験的に得られた時間値であってもよい。（概算通過時間は、通常、実験的に得られた通過時間よりも短い。）。
　上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの発光粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、既に述べた如く、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号のプロファイルに基づいて為されてよい。この点に関し、実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、発光粒子からの光を表す信号のプロファイルは、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度以上の強度を有する釣鐘型のパルス状となり、ノイズのプロファイルは、釣鐘型のパルス状ではないか、その強度が小さくなる。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有するパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。
　更に、本発明の装置の検出対象は、単一の発光粒子からの光であるため、光強度は、非常に微弱であり、一つの発光粒子が、蛍光一分子又は数分子などである場合、発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いて信号の値の欠落が生じる可能性がある。そして、そのような欠落が生ずると、一つの発光粒子の存在に対応する信号の特定が困難となる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、微小な時間に於ける信号値の欠落を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。
　上記の本発明の装置に於ける試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
　また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
　試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。
　上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
　上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、光検出領域の大きさ及び位置の移動速度を考慮して光検出の計測単位時間が設定される光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動中に光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定された計測単位時間毎に光検出領域から到来する光量を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。なお、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光が検出され、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである。
　かかる構成に於いても、より詳細には、計測単位時間は光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、移動速度が高いほど短く設定され、或いは、発光粒子の通過時間が長いほど長く設定されてよい。また、好適には、計測単位時間は、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満であり、より好適には、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくともの三つの計測単位時間と重複するよう計測単位時間が設定されてよい。
　また、上記のコンピュータプログラムに於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号のプロファイルに基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよく、好適には、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。
　更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。
　上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、個々の発光粒子の光の検出を行う光分析方法であって、光検出領域の大きさ及び位置の移動速度を考慮して光検出の計測単位時間が設定される新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら計測単位時間毎に光検出領域から到来する光量を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程とを含み、計測単位時間が光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定されることを特徴とする方法が提供される。
　かかる方法に於いても、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光が検出され、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである。そして、より詳細には、計測単位時間は光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、移動速度が高いほど短く設定され、或いは、発光粒子の通過時間が長いほど長く設定されてよい。また、好適には、計測単位時間は、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満であり、より好適には、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくともの三つの計測単位時間と重複するよう計測単位時間が設定されてよい。
　更に、上記の方法に於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号のプロファイルに基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよく、好適には、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。
　また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記の方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。
　上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　かくして、本発明によれば、光強度データ上の発光粒子の信号の特徴的なプロファイルが捉えられ、且つデータ量が抑制できるように、光検出の際の計測単位時間が、光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて設定されることとなる。かかる構成によれば、発光粒子の信号の検出する上で、無駄にデータの時間分解能を高くしてデータ量を増やしてしまうといったことが回避され、コストの節約となる。また、データ量の節約を試みる際にも、発光粒子の信号のプロファイルの特徴をより確実に捉えられる限界を把握しながら計測単位時間の設定が可能となり、発光粒子の信号とノイズとの分離の精度の維持が可能となる。更に、発光粒子の信号とノイズとの分離の精度の維持しながら、データ量の節約が可能となるので、発光粒子の信号の検出処理に於ける信号処理の負荷が低減される。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、発光粒子からの光の強度変化と、計測単位時間との関係を説明する図である。図２（Ｄ）は、光検出領域の模式図であり、発光粒子の通過時間が、通過位置によって異なることを模式的に示している。 図３は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図５は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図６は、発光粒子信号として検出されたパルス信号が包含するデータ点の数の分布を示している。（Ａ）は、ＢＩＮＴＩＭＥが２０μ秒に設定された場合あり、（Ｂ）は、ＢＩＮＴＩＭＥが３０μ秒に設定された場合である。 図７は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
　本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
　観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。更にまた、光の検出に関して、励起光として所定の方向に偏光した光が用いられ、検出光として励起光の偏光方向と垂直な方向の成分が選択されてよい。その場合、励起光光路には、ポーラライザ（図示せず）が挿入され、検出光光路に偏光ビームスプリッタ１４ａが挿入される。かかる構成によれば、検出光に於ける背景光を大幅に低減することが可能となる。
本発明の光分析技術の原理
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データ上にて発光粒子の信号の略釣鐘状のプロファイルの特徴が消失せず、発光粒子の信号を精度よく検出でき、且つ、データ量を過大にしないようにすべく、光検出処理の計測単位時間（フォトンカウンティングのビンタイム）が設定される。以下、本発明の走査分子計数法及びの計測単位時間の設定の原理について説明する。
１.走査分子計数法の原理
　ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図１１（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図１１（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
　走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ～ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
２．計測単位時間設定の原理
　上記の走査分子計数法により光検出器１６により経時的に取得された光強度のデータ（時系列光強度データ）に於いては、発光粒子からの光によるパルス状の信号の他に、光検出器の熱ノイズや背景光等に起因にするノイズが混入する。そこで、時系列光強度データから発光粒子の信号を検出する際には、典型的には、時系列光強度データに於いて見出されるパルス状の信号の形状的特徴、例えば、ピーク強度、幅、ガウス関数等の釣鐘型関数の形状に対する近似の程度（ガウス関数フィッティングに於ける相関係数）が参照される。そして、発光粒子によるパルス信号に於いて想定される範囲の形状的特徴を有するパルス信号を発光粒子の信号として判別し、それ以外のパルス信号は、ノイズ信号として判別する。
　ところで、上記の如き走査分子計数法に於ける逐次的に実行される光測定では、光強度値は、所定の計測単位時間当たりに光検出器にて受光された光量である。光の計測がフォトンカウンティングによる場合には、光強度は、サブマイクロ秒～ミリ秒のオーダーにて任意設定される計測単位時間（ビンタイム）毎に、光検出器に到達し検知された光子の数にて表される。従って、時系列光強度データは、実際には、計測単位時間毎の光量又は光子数を表すデータ点を時系列に並べたものとなるので、そこに出現する発光粒子の信号のプロファイルは、計測単位時間又はビンタイムの長さによって変化することとなる。即ち、計測単位時間又はビンタイムの長さが長くなるほど、発光粒子によるパルス信号の形状的特徴が消失し、発光粒子の信号とノイズ信号との間の判別を精度よく実行することが困難となる。かくして、精度の良い発光粒子の信号とノイズ信号との間の判別のためには、発光粒子の信号の形状的特徴が捉えられるように、計測単位時間又はビンタイムの長さを発光粒子の信号の長さよりも十分に短くすればよいこととなる。しかしながら、計測単位時間又はビンタイムの長さが短くなるほど、データ点数が増大し、データ量が膨大となって、データ処理負荷やコストの増大に繋がり得る。
　そこで、本発明に於いては、光測定の際の計測単位時間又はビンタイムの長さが、発光粒子の信号の形状的特徴によって発光粒子の信号とノイズ信号との間の判別が実行可能であり、且つ、データ点数を無用に増大させないように設定される。図２（Ｃ）は、発光粒子のパルス信号のプロファイルＩＲ及び長さＴｐと、計測単位時間Δτとの関係を示している。同図を参照して、まず、発光粒子のパルス信号の長さＴｐよりも計測単位時間が長い場合、即ち、
　［ｉ］Ｔｐ＜Δτ１
の場合、発光粒子のパルス信号のプロファイルＩＲに対して、データ点Ｄｐは、一点のみとなる。この場合、発光粒子のパルス信号のプロファイルの略釣鐘状の特徴が消失し、情報が強度値の大きさのみとなるので、発光粒子のパルス信号の形状的特徴に基づいて、発光粒子のパルス信号を検出することは極めて困難である。また、計測単位時間が、
　［ii］Ｔｐ＞Δτ２≧１／２Ｔｐ
であるとき、発光粒子のパルス信号のプロファイルＩＲに対して、データ点Ｄｐは、２点となるが、この場合も、データ点Ｄｐの値には、略釣鐘状の特徴、即ち、時間方向に沿って、小、大、小の順に値が変化する特徴が消失しているので、発光粒子のパルス信号の形状的特徴に基づいて、発光粒子のパルス信号を検出することは困難である。一方、計測単位時間が、発光粒子のパルス信号の長さＴｐの１／２よりも短い場合、即ち、
　［iii］1/2Ｔｐ＞Δτ３≧1/3Ｔｐ、
　［iv］1/3Ｔｐ＞Δτ４≧1/4Ｔｐ、
　［ｖ］1/4Ｔｐ＞Δτ５≧1/5Ｔｐ、
　…以下、同様。
であるときには、データ点Ｄｐが少なくとも３点となり、時間方向に沿って、小、大、小の順に値が変化する略釣鐘状の特徴が保存され、発光粒子のパルス信号の形状的特徴に基づいて、発光粒子のパルス信号を検出することが可能となる。
　実際、後に説明される実施例１に於ける実験結果によれば、発光粒子の信号として検出されたパルス信号に於いては、各信号の発生期間内にデータ点Ｄｐが少なくとも３点以上含まれていた。かくして、上記の考察及び実施例１の実験結果から、計測単位時間の長さは、発光粒子のパルス信号の発生時間内にデータ点Ｄｐが３点以上包含するよう設定されればよいこととなる。ここで、発光粒子のパルス信号の発生時間は、発光粒子が光検出領域内を通過している時間に相当する。また、１つのデータ点は、１つの計測単位時間に対応する。従って、結局、計測単位時間の長さは、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの計測単位時間と重複するように設定されればよいこととなる。なお、かかる条件は、発光粒子の通過時間が三つの計測単位時間の和以上でなくてもよいことは理解されるべきである。上記の条件に於いて、重要なことは、発光粒子の通過時間に於いて、データ点が３以上存在していることであるので、この条件が満たされる限り、三つの計測単位時間の和が発光粒子の通過時間を上回っていてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属する。更に、後に説明される実施例１に於ける実験結果によれば、発光粒子のパルス信号は、その発生時間内にデータ点Ｄｐが４点以上包含される場合に、より精度良く検出することが可能であった。従って、計測単位時間の長さは、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間内に４点以上のデータ点Ｄｐが包含されるよう設定されてよい。（即ち、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも４つの計測単位時間と重複するように計測単位時間の長さが設定されてよい。）。
　計測単位時間又はビンタイムの具体的な設定は、光検出領域の大きさと光検出領域の移動速度とに基づいて為されてよい。「発明の概要」の欄に於いて記載されている如く、適切な計測単位時間又はビンタイムの基準となる発光粒子の信号の長さ、即ち、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間は、理論的には、
　　［光検出領域の大きさ］／［光検出領域の移動速度］　　…（１）
により与えられるので、計測単位時間又はビンタイムは、かかる理論値を参照して適宜決定されてよい。上記の式（１）から理解される如く、発光粒子の通過時間は、光検出領域の大きさが大きいほど、長くなり、光検出領域の移動速度が高いほど短くなるので、これに追従して、計測単位時間又はビンタイムが増減されてよい。
　なお、上記の式（１）に関して、光検出領域の移動速度は、光検出領域の軌跡及び周期から精度よく一義的に算定可能であるが、光検出領域の大きさは、要すれば、発光粒子の光検出領域内に於ける軌跡の距離、即ち、光検出領域の移動方向（走査方向）に平行な方向に於ける長さであり、光検出領域内の発光粒子の通過位置によって異なることとなる。図２（Ｄ）に示されている如く、光検出領域は、球体又は楕円体であるので、球体又は楕円体を横切る距離に相当する式（１）に於ける［光検出領域の大きさ］は、光検出領域の走査方向と垂直な方向に於ける位置によって異なることとなる。例えば、図２（Ｄ）中、発光粒子α、β、γの通過距離は、順に短くなる。また、光検出領域の境界を厳密に定義することも困難である。即ち、光検出領域は、励起光の集光状態（及びピンホールの径）で画定されるところ、理論的に励起光強度（又は検出光強度）が実質的に０になる境界を精度良く定めることは容易ではない。そこで、光検出領域の境界として、光検出領域内の光強度が中心強度の１／ｅ２となる球面又は楕円面ＣＶｎが採用されてよい。そして、光検出領域の光強度が中心強度の１／ｅ２となる球面又は楕円面の直径２Ｗｏは、概ね
　　２Ｗｏ＝１．２２・λ／（Ｄ／２ｆ）　　…（２）
により与えられる（ここで、λは、励起波長、Ｄは、入射光ビーム径、ｆは、対物レンズの焦点距離である。）。従って、式（２）により算出される値を光検出領域の大きさの概算値として用いて式（１）から算出される値が、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間（即ち、発光粒子のパルス信号の長さＴｐ）の概算値（概算通過時間）として参照され、計測単位時間又はビンタイムが決定されてよい。概算通過時間から計測単位時間又はビンタイムを決定する際には、既に述べた如く、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも３つのデータ点を包含すべきであるで、計測単位時間又はビンタイムは、例えば、概算通過時間の半分未満、好適には、１／３程度に設定されてよい。或いは、概算通過時間内に少なくとも３つのデータ点を包含するよう計測単位時間又はビンタイムが決定されてもよい。また、発光粒子の通過位置が光検出領域の周縁に近づくほど、通過時間が短くなることを考慮して、計測単位時間又はビンタイムは、光検出領域の周縁を通過する発光粒子の信号をより確実に検出すべく、少なくとも３つのデータ点が光検出領域の周縁を通過する発光粒子の通過時間内に包含されるように、概算通過時間を参考にして、その１／３よりも十分に短い時間、例えば、その１／６程度の時間などに設定されてよい。もちろん、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間は、予め実験によっても決定可能であるので、実験的に得られた発光粒子の通過時間内に少なくとも３つのデータ点が包含されるように、計測単位時間又はビンタイムが決定されてもよい。
走査分子計数法の処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
（１）試料溶液の調製
　本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
（２）試料溶液の光強度の測定（図３－ステップ１００）
　本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。フォトンカウンティングに於けるビンタイムは、上記の如く、概算通過時間又は実験的に得られた粒子の通過時間内に少なくとも３つのデータ点が包含されるよう適宜設定される。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（３）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　　…（４）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（５）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（３）光強度の分析
　上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
（ｉ）発光粒子の信号の個別検出（ステップ１１０～１６０）
　時系列光強度データが生成されると、かかる光強度データ上にて、発光粒子の信号を個別に検出する処理が実行される。既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（６）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（６）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
　光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３－ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０～１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図５左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図５右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
　上記のステップ１３０～１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（iii）発光粒子濃度の決定
　検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。
　光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（７）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（８）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（７））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　走査分子計数法に於いて、光検出処理に於ける計測単位時間を種々変更して発光粒子信号の検出に対する計測単位時間の影響を検証した。
　試料溶液として、リン酸緩衝液（０．１％　Pluronic　F-127を含む）に発光粒子として蛍光色素ＡＴＴＯ６３３(ATTO-TEC)を１０ｐＭにて含む溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０－７１０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列フォトンカウントデータを生成した。励起光のレーザーパワーは、２００μＷとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１μ秒とし、１秒間の測定を行った。
　光計測後のデータ処理に於いては、まず、取得された時系列フォトンカウントデータについて、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが、それぞれ、１０、２０、３０、５０、１００μ秒となるように、時系列フォトンカウントデータを再構成した（例えば、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが１０μ秒の再構成データは、ＢＩＮ　ＴＩＭＥ１μ秒のデータ点に於いて１０点の光子数を加算して１点のデータ点を生成した。）。次いで、再構成された時系列フォトンカウントデータの各々に於いて、発光粒子の信号の個別検出と信号数のカウンティングを行った。発光粒子の信号の検出は、「（ｉ）発光粒子の信号の個別検出」及び図３のステップ１１０～１６０に記載された要領に従って、時系列フォトンカウントデータにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞１［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９０
を満たすパルス信号のみを発光粒子の信号として抽出し、その信号数を計数した。
　表１は、再構成された時系列フォトンカウントデータの各々に於いて、発光粒子信号として検出された信号数と、再構成データのデータ量とを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　上記の結果を参照して、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが１０μ秒～２０μ秒の場合には、検出信号数に大幅な変化はないところ、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが３０μ秒の場合には、検出信号数が大きく減少し、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが５０μ秒以上になると、信号が検出できなかった。光検出領域の直径は、約１μｍに調整されており、光検出領域の移動速度が１５ｍｍ／秒であることから、発光粒子が光検出領域を通過する概算通過時間は約６７μ秒となる。上記の結果は、ＢＩＮ　ＴＩＭＥは、好適には、概算通過時間の半分未満、より好適には、１／３程度に設定されることにより、発光粒子信号の略釣鐘状のプロファイルの特徴が維持され、精度良く発光粒子の検出が可能となることを示唆している。また、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを必要以上に短くしないことで、データ量を抑制することも可能となった。
　更に、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが２０μ秒の場合と、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが３０μ秒の場合とについて発光粒子の信号として検出された各信号に於いて包含されたデータ点の数を確認した。図６（Ａ）は、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが２０μ秒の場合の検出パルス信号内に包含されたデータ点の数に対する検出パルス信号数を示し、図６（Ｂ）は、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが３０μ秒の場合の検出パルス信号内に包含されたデータ点の数に対する検出パルス信号数を示している。同図を参照して理解される如く、発光粒子の信号として検出された信号に於いては、少なくとも３つのデータ点が包含されていた。また、４つ乃至５つのデータ点が包含されているパルス信号の検出数が特に多かった。このことは、検出パルス信号内に包含されたデータ点が４つ以上の場合には、発光粒子信号の釣鐘状のプロファイルの特徴がより良く維持されたためであると考えられる。更に、図６（Ａ）、（Ｂ）を比較して、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが３０μ秒の場合の検出パルス信号数が、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが２０μ秒の場合に比して低減した理由は、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが３０μ秒の場合には、ＢＩＮ　ＴＩＭＥが長くなったために、各発光粒子の信号内に包含されるデータ点が減少し、これにより、光検出領域の周縁に近い位置を通過した通過時間の短い発光粒子の信号の釣鐘状のプロファイルの特徴が消失したためであると考えられる。
　かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、走査分子計数法に於ける計測単位時間を設定することにより、発光粒子の信号がその略釣鐘状のプロファイルに基づいて精度良く検出され、且つ、時系列光強度データのデータ量の過剰な増大を回避できることとなる。

Claims (30)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
    　計測単位時間毎に前記光検出領域から到来する光量を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて前記計測単位時間毎に検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    　前記計測単位時間が前記光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定されることを特徴とする装置。
  2. 　請求項１の装置であって、前記計測単位時間が前記光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、前記移動速度が高いほど短く設定されることを特徴とする装置。
  3. 　請求項１又は２の装置であって、前記計測単位時間が前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満であることを特徴とする装置。
  4. 　請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの前記計測単位時間と重複するよう前記計測単位時間が設定されることを特徴とする装置。
  5. 　請求項１乃至４のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
  6. 　請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  7. 　請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする装置。
  9. 　請求項１乃至８のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記時系列光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出することを特徴とする装置。
  10. 　請求項１乃至９のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
  11. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら計測単位時間毎に前記光検出領域から到来する光量を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
    　前記時系列光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程と
    を含み、
    前記計測単位時間が前記光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定されることを特徴とする方法。
  12. 　請求項１１の方法であって、前記計測単位時間が前記光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、前記移動速度が高いほど短く設定されることを特徴とする方法。
  13. 　請求項１１又は１２の方法であって、前記計測単位時間が前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満であることを特徴とする方法。
  14. 　請求項１１乃至１３のいずれかの方法であって、前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの前記計測単位時間と重複するよう前記計測単位時間が設定されることを特徴とする方法。
  15. 　請求項１１乃至１４のいずれかの方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
  16. 　請求項１１乃至１５のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
  17. 　請求項１１乃至１６のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とする方法。
  18. 　請求項１１乃至１７のいずれかの方法であって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする方法。
  19. 　請求項１１乃至１８のいずれかの方法であって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出されることを特徴とする方法。
  20. 　請求項１１乃至１７のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  21. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定された計測単位時間毎に前記光検出領域から到来する光量を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
    　前記時系列光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  22. 　請求項２１のコンピュータプログラムであって、前記計測単位時間が前記光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、前記移動速度が高いほど短く設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  23. 　請求項２１又は２２のコンピュータプログラムであって、前記計測単位時間が前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満であることを特徴とするコンピュータプログラム。
  24. 　請求項２１乃至２３のコンピュータプログラムであって、前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの前記計測単位時間と重複するよう前記計測単位時間が設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  25. 　請求項２１乃至２４のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  26. 　請求項２１乃至２５のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  27. 　請求項２１乃至２６いずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とするコンピュータプログラム。
  28. 　請求項２１乃至２７のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する前記手順に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  29. 　請求項２１乃至２８のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する前記手順に於いて、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  30. 　請求項２１乃至２９のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
PCT/JP2012/066943 2011-08-30 2012-07-03 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム WO2013031377A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280042499.1A CN103765197B (zh) 2011-08-30 2012-07-03 利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
EP12828331.4A EP2752654A4 (en) 2011-08-30 2012-07-03 OPTICAL ANALYZER WITH SINGLE DETECTION OF LIGHT-EMITTING PARTICLES, OPTICAL ANALYSIS PROCEDURE AND COMPUTER PROGRAM FOR OPTICAL ANALYZES
JP2013531149A JP6010035B2 (ja) 2011-08-30 2012-07-03 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
US14/190,780 US9528923B2 (en) 2011-08-30 2014-02-26 Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-187502 2011-08-30
JP2011187502 2011-08-30

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/190,780 Continuation US9528923B2 (en) 2011-08-30 2014-02-26 Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013031377A1 true WO2013031377A1 (ja) 2013-03-07

Family

ID=47755885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/066943 WO2013031377A1 (ja) 2011-08-30 2012-07-03 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9528923B2 (ja)
EP (1) EP2752654A4 (ja)
JP (1) JP6010035B2 (ja)
CN (1) CN103765197B (ja)
WO (1) WO2013031377A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11119022B2 (en) 2017-03-28 2021-09-14 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method, and recording medium

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012144528A1 (ja) * 2011-04-18 2012-10-26 オリンパス株式会社 標的粒子の定量方法、光分析装置及び光分析用コンピュータプログラム
EP2752654A4 (en) * 2011-08-30 2015-04-15 Olympus Corp OPTICAL ANALYZER WITH SINGLE DETECTION OF LIGHT-EMITTING PARTICLES, OPTICAL ANALYSIS PROCEDURE AND COMPUTER PROGRAM FOR OPTICAL ANALYZES
US20150226573A1 (en) * 2014-02-11 2015-08-13 Qualcomm Incorporated Pedometer integrated pedestrian positioning
GB2573692B (en) * 2017-02-20 2022-02-16 Hitachi High Tech Corp Analysis system and analysis method

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008116440A (ja) * 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
JP2010190730A (ja) * 2009-02-18 2010-09-02 Olympus Corp 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
JP2011508219A (ja) * 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
WO2011108369A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
WO2012014778A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4251733A (en) 1978-06-29 1981-02-17 Hirleman Jr Edwin D Technique for simultaneous particle size and velocity measurement
CA2035703A1 (en) * 1991-01-22 1992-07-23 Pedro Lilienfeld System and method for determining and printing airborne particle concentration
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
FI98765C (fi) 1995-01-16 1997-08-11 Erkki Soini Virtaussytometrinen menetelmä ja laite
US5866336A (en) 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
EP0836090A1 (en) 1996-10-12 1998-04-15 Evotec BioSystems GmbH Method of analysis of samples by determination of the distribution of specific brightnesses of particles
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US6710871B1 (en) 1997-06-09 2004-03-23 Guava Technologies, Inc. Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples
GB2326229A (en) 1997-06-13 1998-12-16 Robert Jeffrey Geddes Carr Detecting and analysing submicron particles
SE9800360D0 (sv) 1998-02-06 1998-02-06 Goeteborg University Science I Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules
US20030036855A1 (en) 1998-03-16 2003-02-20 Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey Method and apparatus for screening chemical compounds
IL138496A0 (en) 1998-03-16 2001-10-31 Praelux Inc Confocal microscopy imaging system
US6388788B1 (en) 1998-03-16 2002-05-14 Praelux, Inc. Method and apparatus for screening chemical compounds
US6376843B1 (en) * 1999-06-23 2002-04-23 Evotec Oai Ag Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
WO2000066985A1 (en) 1999-04-29 2000-11-09 Evotec Biosystems Ag A method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
US8264680B2 (en) 1999-05-28 2012-09-11 Yokogawa Electric Corporation Biochip reader and electrophoresis system
US6965113B2 (en) 2000-02-10 2005-11-15 Evotec Ag Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness
US20010035954A1 (en) 2000-03-10 2001-11-01 Rahn John Richard Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering
DE10035190C5 (de) 2000-07-20 2009-07-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung
DE10038528A1 (de) 2000-08-08 2002-02-21 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung
US6947133B2 (en) 2000-08-08 2005-09-20 Carl Zeiss Jena Gmbh Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors
HU226937B1 (en) 2000-11-17 2010-03-29 Mta Szegedi Biolog Koezpont Method and apparatus for determining polarization amount of material by a laser scanning microscope
EP1351048A4 (en) 2000-12-14 2007-02-28 Olympus Corp FLUOROMETRIC ANALYZER AND FLUOROMETRIC ANALYSIS
US6782297B2 (en) 2001-05-24 2004-08-24 Eric Paul Tabor Methods and apparatus for data smoothing
WO2003025546A2 (en) * 2001-09-19 2003-03-27 Joule Microsystems Canada Inc. A spectrometer incorporating signal matched filtering
US6750963B2 (en) 2002-05-21 2004-06-15 Agilent Technologies, Inc. Imaging systems for signals on a surface
EP1561114B1 (en) 2002-11-07 2008-05-07 Erasmus Universiteit Rotterdam Fret probes and methods for detecting interacting molecules
US7038848B2 (en) 2002-12-27 2006-05-02 Olympus Corporation Confocal microscope
JP4315794B2 (ja) 2002-12-27 2009-08-19 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
EP1805500A4 (en) 2004-09-28 2008-05-07 Singulex Inc SYSTEM AND METHOD FOR THE SPECTROSCOPIC ANALYSIS OF INDIVIDUAL PARTICLES
KR20070107743A (ko) * 2005-01-31 2007-11-07 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 투과성 있는 혼탁한 매질 내의 입자들을 특성화하는 방법및 그 장치
JP4757103B2 (ja) 2005-06-13 2011-08-24 学校法人関西文理総合学園 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
EP1906172A4 (en) 2005-07-15 2014-01-08 Olympus Corp LIGHT METER
WO2007118209A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Kim Laboratories Apparatus and method for rapid detection of analytes
US8445655B2 (en) 2006-06-16 2013-05-21 Cornell Research Foundation, Inc. Functional nucleic acid ligands to fluorescent proteins
WO2008007580A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Olympus Corporation Procédé d'analyse de particules fines
US20080052009A1 (en) 2006-08-23 2008-02-28 Washington, University Of Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements
GB0618057D0 (en) 2006-09-14 2006-10-25 Perkinelmer Ltd Improvements in and relating to scanning confocal microscopy
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JPWO2008099778A1 (ja) 2007-02-14 2010-05-27 株式会社ニコン スリット走査共焦点顕微鏡
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
US8159670B2 (en) * 2007-11-05 2012-04-17 Abbott Laboratories Method and apparatus for rapidly counting and identifying biological particles in a flow stream
JP2009145242A (ja) 2007-12-14 2009-07-02 Olympus Corp 光測定装置
JP5139885B2 (ja) 2008-05-21 2013-02-06 浜松ホトニクス株式会社 蛍光解析装置及び解析方法
JP2009288161A (ja) 2008-05-30 2009-12-10 Olympus Corp 光測定装置及び光測定方法
JP5590781B2 (ja) 2008-07-10 2014-09-17 オリンパス株式会社 標的核酸比率推定方法
US20100177190A1 (en) 2008-12-16 2010-07-15 Ann-Shyn Chiang Microscopy system with revolvable stage
CN101655460B (zh) * 2009-08-28 2011-06-22 山西大学 用于快速光学跟踪单分子的方法及其装置
WO2012032981A1 (ja) 2010-09-10 2012-03-15 オリンパス株式会社 単一発光粒子の光強度を用いた光分析方法
EP2602612A4 (en) 2010-09-10 2018-05-16 Olympus Corporation Optical analysis method using optical measurement in multiple wavelength bands
WO2012039352A1 (ja) 2010-09-21 2012-03-29 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析方法
JP5885738B2 (ja) * 2011-04-13 2016-03-15 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
EP2752654A4 (en) * 2011-08-30 2015-04-15 Olympus Corp OPTICAL ANALYZER WITH SINGLE DETECTION OF LIGHT-EMITTING PARTICLES, OPTICAL ANALYSIS PROCEDURE AND COMPUTER PROGRAM FOR OPTICAL ANALYZES

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008116440A (ja) * 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
JP2011508219A (ja) * 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
JP2010190730A (ja) * 2009-02-18 2010-09-02 Olympus Corp 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
WO2011108369A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
WO2012014778A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2752654A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11119022B2 (en) 2017-03-28 2021-09-14 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method, and recording medium

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2013031377A1 (ja) 2015-03-23
US9528923B2 (en) 2016-12-27
US20140175262A1 (en) 2014-06-26
CN103765197A (zh) 2014-04-30
CN103765197B (zh) 2016-03-02
EP2752654A1 (en) 2014-07-09
EP2752654A4 (en) 2015-04-15
JP6010035B2 (ja) 2016-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5885738B2 (ja) 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP5687684B2 (ja) 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
JP5904947B2 (ja) 単一発光粒子検出を用いた粒子の拡散特性値の測定方法
JP5904996B2 (ja) 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
JP5914341B2 (ja) 単一発光粒子検出を用いた光分析方法
JP6013338B2 (ja) 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP5893564B2 (ja) 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法
JP5941923B2 (ja) 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP5907882B2 (ja) 単一発光粒子の偏光特性を観測する光分析装置、光分析方法及びそのための光分析用コンピュータプログラム
JP6010035B2 (ja) 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP5945506B2 (ja) 単一発光粒子の光の波長特性を用いた光分析装置及び光分析方法
JP2013036765A (ja) 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2013021984A1 (ja) 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置及び光分析方法
JP2014202550A (ja) 複数の波長帯域に於ける単一発光粒子検出を用いた光分析装置及び光分析方法
JP2013019764A (ja) 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置及び光分析方法
JP2012154885A (ja) 単一発光粒子の光を検出し分析するための光分析装置及び光分析方法
JP2012150020A (ja) 単一発光粒子からの光の検出を用いた光分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12828331

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013531149

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE