WO2011108369A1 - 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム Download PDF

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山口光城
聖二 近藤
田邊哲也
堀邦夫
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オリンパス株式会社
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1456—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the present invention analyzes or analyzes the state of particles in a solution by detecting light from atoms, molecules or aggregates thereof (hereinafter referred to as “particles”) dispersed or dissolved in the solution.
  • the present invention relates to an optical analysis apparatus, an optical analysis method, and a computer program therefor, and more particularly, using an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the present invention relates to an optical analysis apparatus, an optical analysis method, and an optical analysis computer program capable of acquiring information useful for analyzing or analyzing states (interactions, binding / dissociation states, etc.).
  • the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, and the average number of staying molecules Based on this, acquisition of information such as the speed or size of movement of fluorescent molecules, concentration, concentration, molecular structure or size change, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation, etc.
  • the detection of various phenomena is achieved.
  • the fluorescence intensity analysis (Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA, for example, Patent Document 3) and the Photon Counting Histogram (PCH, for example, Patent Document 4) are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the volume is generated, and by fitting a statistical model formula to the distribution of the histogram, the average value of the intrinsic brightness of the fluorescent molecules and the confocal
  • An average value of the number of molecules staying in the volume is calculated, and based on such information, a change in the structure or size of the molecule, a bound / dissociated state, a dispersed / aggregated state, and the like are estimated.
  • Patent Documents 5 and 6 propose a method of detecting a fluorescent substance based on the time lapse of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 7 describes the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by measuring weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate using a photon counting technique. A signal arithmetic processing technique for detecting the signal is proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method. It can be very small (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). . Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc. When the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the magnitude of the temporal fluctuation of the measured fluorescence intensity is calculated by statistical processing, and the sample solution is based on the magnitude of the fluctuation.
  • Various characteristics such as fluorescent molecules entering and exiting the minute region are determined. Therefore, in order to obtain a significant result in the above optical analysis technique, the concentration or number density of the fluorescent molecules to be observed in the sample solution must be as long as one second in the equilibrium state. In order for the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time to enter and exit the micro area, it is preferable that there is always approximately one fluorescent molecule in the micro area.
  • the volume of the confocal volume is typically about 1 fL, so that the concentration of the fluorescent molecule or the like is preferably about 1 nM or more.
  • the concentration or number density of the particles to be observed in the sample solution is significantly lower than the level capable of statistical processing (for example, significantly lower than 1 nM)
  • the observation target is measured in a minute region. A state that rarely enters in time occurs, and in the measurement result of fluorescence intensity, a state where the observation object is not present in the minute region is included for a long period of time, and is significant. Therefore, the optical analysis technique based on the statistical fluctuation of the fluorescence intensity as described above cannot expect a significant or accurate analysis result.
  • Patent Documents 5 and 6 the statistical processing relating to the fluctuation of the fluorescence intensity as described above is not performed, and the measurement time over several seconds is used.
  • the presence or absence of fluorescent molecules to be observed in the sample can be specified by the presence or absence of generation of a fluorescent signal with a significant intensity.
  • the frequency of the fluorescent signal with a significant intensity and the number of fluorescent molecules or the like in the sample It is disclosed that a correlation can be obtained.
  • Patent Document 6 suggests that detection sensitivity is improved by generating a random flow that stirs the sample solution.
  • these methods are also limited to detecting the presence of fluorescent molecules or the like that enter the microregion stochastically by diffusion or random flow.
  • Patent Document 7 The behavior cannot be grasped, and for example, particle counting and particle concentration or number density are not quantitatively calculated.
  • the technique described in Patent Document 7 is to individually detect the presence of fluorescent fine particles in a flow in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate, and in a normal state in a sample solution. This is not a technique for detecting molecules or colloid particles dissolved or dispersed in the sample solution, that is, particles moving randomly in the sample solution. Quantitative calculation of concentration or number density has not been achieved.
  • the technique of Patent Document 7 includes a process such as measurement in a flow cytometer or immobilization of fluorescent particles on a substrate, the amount of sample required for inspection is optical analysis such as FCS, FIDA, PCH, etc. It is considered to require a complicated and sophisticated operation technique for the practitioner as well as the number of techniques.
  • one object of the present invention does not include statistical processing, such as that performed in optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH, etc., and therefore the concentration or number density of the particles to be observed is their optical analysis. It is to provide a novel optical analysis technique capable of detecting the state or characteristics of particles to be observed in a sample solution lower than the level handled by the technique.
  • Another subject of the present invention is an optical analysis apparatus, method or computer program for realizing the above-described novel optical analysis technology, which is measured in the same manner as optical analysis technologies such as FCS, FIDA, and PCH.
  • the amount of sample required for the measurement may be a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L), and the measurement time is short and the optical analysis capable of quantitatively specifying the characteristics such as the concentration or number density of the particles to be observed
  • An apparatus, an optical analysis method, or a computer program for optical analysis is provided.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, is used to randomly disperse in a sample solution.
  • This is an optical analysis technique for detecting light from particles that emit moving light (hereinafter referred to as “luminescent particles”), while moving the position of a micro area, which is a light detection area, within a sample solution. That is, light from the micro area is detected while scanning the sample solution by the micro area, and thereby, the luminescent particles crossing the micro area are individually detected to count the luminescent particles and emit light in the sample solution.
  • a new type of optical analysis technique is proposed that enables the acquisition of information on the concentration or number density of particles.
  • an optical analyzer that detects light from luminescent particles that are dispersed in a sample solution and randomly move using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, A light detection region moving unit that moves the position of the light detection region of the optical system in the sample solution by changing the optical path of the optical system, a light detection unit that detects light from the light detection region, and a sample solution And a signal processing unit for individually detecting light signals from the individual light emitting particles from the light detected by the light detection unit while moving the position of the light detection region inside the device. Is done.
  • the luminous particles dispersed in the sample solution and moving randomly are particles that emit light, such as atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution, Any particle may be used as long as it is not fixed to the substrate or the like and freely moves in the solution in Brownian motion.
  • luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes.
  • the illumination light is Corresponds to the focused region (in the confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the luminescent particles emit light without illumination light, for example, chemiluminescence or biological In the case of particles that emit light by light emission, illumination light is not required in the microscope.
  • the term “light signal from light emitting particles” means “signal representing light from light emitting particles”.
  • the position of the light detection region is moved in the sample solution, that is, the sample solution is scanned by the light detection region.
  • light is detected sequentially.
  • the moving light detection region includes randomly moving luminescent particles
  • the light from the luminescent particles is detected by the light detection unit, thereby detecting the presence of one luminescent particle. It becomes.
  • the signal processing unit of the apparatus detects the light signal from the light emitting particles in the signal of the light detecting unit that is sequentially detected, thereby sequentially detecting the presence of the light emitting particles one by one.
  • Various information regarding the state of the luminescent particles in the solution is obtained by detection.
  • the signal processing unit counts the number of light signals from the individually detected luminescent particles and is detected while the position of the light detection region is moving.
  • the number of luminescent particles may be counted (counting of luminescent particles).
  • information on the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution can be obtained by combining the number of luminescent particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the total volume of the movement locus of the light detection region is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the luminescent particles is reduced. It can be calculated specifically.
  • the absolute number density value or concentration value is not directly determined, but the relative number density or concentration ratio with respect to a plurality of sample solutions or a standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated. It may be like this.
  • the optical detection area is moved to change the position of the photodetection area by changing the optical path of the optical system. Because there is virtually no mechanical vibration or hydrodynamic action, light can be measured in a stable state without being affected by the mechanical action of the luminescent particles.
  • the determination as to whether one luminescent particle has entered the light detection region from the sequential signal from the light detection unit is performed when the light detection unit detects it. This may be done based on the shape of the series of optical signals. In the embodiment, typically, when a light signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution can be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution. Good.
  • the manner of light detected from the luminescent particles can vary depending on the properties of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from one light emitting particle decreases, so that the light from one light emitting particle can be measured with high accuracy or sensitivity. It is preferable that the moving speed can be appropriately changed.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected (average moving speed of particles due to Brownian motion). Higher than.
  • the apparatus of the present invention detects the light emitted from the light emitting particles when the light detection region passes the position where the light emitting particles exist, and individually detects the light emitting particles.
  • the luminescent particles move randomly in the solution due to Brownian motion and enter and exit the photodetection region multiple times, an optical signal (representing the presence of the luminescent particles) from one luminescent particle multiple times Is detected, and it becomes difficult to make the detected optical signal correspond to the presence of one luminescent particle.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the light emitting particles, and thereby one light emitting particle can correspond to one light signal (representing the presence of the light emitting particle). It becomes possible. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent particles, as described above, according to the characteristics of the luminescent particles (particularly, the diffusion constant), the apparatus of the present invention can appropriately change the movement speed of the light detection region. It is preferable to be configured.
  • the change of the optical path of the optical system for moving the position of the light detection area may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • an optical analyzer that detects light from luminescent particles in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope according to the present invention is provided by changing the optical path of the optical system. From the individual light emitting particles that have entered the light detection region while moving the light detection region of the optical system in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the light emitting particles in the sample solution. The number of luminescent particles that have entered the light detection region may be detected by individually detecting the light signals and counting the light signals.
  • the light detection is performed while moving the position of the light detection region in the sample solution, and the light signal from each light emitting particle is individually detected.
  • the processing can also be realized by a general-purpose computer. Therefore, according to another aspect of the present invention, for optical analysis for detecting light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a computer program for changing the optical path of the optical system to move the position of the optical detection region of the optical system in the sample solution, and during the movement of the position of the light detection region in the sample solution There is provided a computer program that causes a computer to execute a procedure for detecting light from a light detection region and a procedure for individually detecting light signals from individual light emitting particles from the detected light.
  • the procedure and / or the number of luminescent particles detected during the movement of the position of the light detection area by counting the number of light signals from the individually detected luminescent particles is detected.
  • a procedure may be included that determines the number density or concentration of luminescent particles in the sample solution based on the number of luminescent particles.
  • the position of the light detection area is moved at a predetermined speed or at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the fact that one luminescent particle has entered the light detection region is detected based on the shape of the detected time-series light signal, for example, an optical signal having an intensity greater than a predetermined threshold value. It may be determined when The movement locus of the position of the light detection region may be selectable from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the optical analysis method for detecting light from light-emitting particles dispersed and moving randomly in a sample solution using the confocal microscope or multiphoton microscope optical system of the present invention changes the optical path of the optical system.
  • the number of light signals from the individually detected light emitting particles is counted and the number of light emitting particles detected during the movement of the position of the light detection region is counted and / or detected.
  • a step of determining the number density or concentration of luminescent particles in the sample solution based on the number of luminescent particles may be included. Further, in the process of moving the position of the light detection region, the position of the light detection region may be moved at a predetermined speed or at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. The moving speed of the position of the detection region may be set based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the fact that one luminescent particle has entered the light detection region is, for example, an optical signal having an intensity greater than a predetermined threshold based on the shape of the detected time-series optical signal. This may be determined when it is detected.
  • optical analysis technique realized by the above-described apparatus, method or computer program according to the present invention is the same as in the case of optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH, etc. Since it is configured to detect light from the light detection region of the microscope, the amount of the sample solution may be small as well. However, in the present invention, since statistical processing such as calculating fluctuations in fluorescence intensity is not performed, the photoanalysis technique of the present invention uses photoanalysis such as the number density or concentration of luminescent particles of FCS, FIDA, PCH, etc. Applicable to sample solutions significantly below the level required for the technology.
  • each of the luminous particles dispersed or dissolved in the solution is individually detected. Therefore, the information is used to quantitatively count the luminous particles or the luminous particles in the sample solution. It is possible to calculate the concentration or the number density of the above or to acquire information on the concentration or the number density. For example, in the techniques described in Patent Documents 5 and 6, the correlation between the total value of the frequency of fluorescent signals having an intensity equal to or higher than a predetermined threshold within a predetermined time and the number of particles such as fluorescent molecules in the sample solution is obtained. However, it is not possible to grasp the dynamic behavior of particles passing through the measurement region (whether the particles have passed straight through the measurement region or whether the particles have stayed in the measurement region).
  • the luminescent particles that pass through the light detection region and the detected optical signals are made to correspond one-to-one to detect the luminescent particles one by one. It is possible to count the luminescent particles to be determined, and to determine the concentration or number density of the particles in the sample solution with higher accuracy than before.
  • the sample solution is not affected by mechanical vibration or hydrodynamic action.
  • the sample solution is observed in a mechanically stable state, for example, when a flow is generated in the sample (when applying a flow, it is difficult to always give a uniform flow rate.
  • a required amount of sample is greatly increased, and particles or substances in the solution may be altered or denatured by hydrodynamic action due to flow).
  • the reliability of the quantitative detection result is improved, and measurement can be performed in a state where there is no influence or artifact due to a dynamic action on the luminescent particles to be detected in the sample solution.
  • the optical analysis technique of the present invention typically involves the production of particulate biological objects such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells and the like. Used for analysis or analysis of conditions in solution, but may be used for analysis or analysis of conditions in solution of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) It should be understood that such a case also belongs to the scope of the present invention.
  • particulate biological objects such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells and the like.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIGS. 2A and 2B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection by the optical analysis technique according to the present invention and a schematic diagram of a temporal change in measured light intensity, respectively.
  • FIGS. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIGS. 2A and 2B are a schematic diagram
  • FIGS. 4A and 4B are a model diagram in the case where the luminescent particle crosses the light detection region while performing a Brownian motion, and a diagram showing an example of a temporal change in photon count (light intensity) in that case. is there.
  • FIGS. 4A and 4B show models in which the luminescent particles cross the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. It is a figure which shows the example of the time change of a figure and the photon count (light intensity) in that case.
  • FIG. 5 illustrates an example of a signal processing process including binarization processing of a detection signal for counting luminescent particles from time variation of photon count (light intensity) measured by the optical analysis technique according to the present invention. It is a figure to do.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining an example of a signal processing process including differential processing of a detection signal for counting luminescent particles from time variation of photon count (light intensity) measured by the optical analysis technique according to the present invention. It is.
  • FIG. 7 is a diagram for explaining a model of a calculation experiment of detection and counting of luminescent particles by the optical analysis technique according to the present invention.
  • FIG. 8A, 8B, and 8C show time-series photon count data measured by the optical analysis technique of the present invention and data obtained by smoothing the time-series photon count data (smoothing processing is applied), respectively.
  • the obtained data) shows an example of a Gaussian function curve fitted to the smoothed time-series photon count data.
  • FIG. 8D shows a process for determining the pulse existence region in the smoothed time-series photon count data.
  • FIG. 9 shows an actual measurement example (bar graph) of photon count data measured by the optical analysis technique of the present invention, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the peak existence region. ).
  • FIG. 10 (A) and 10 (B) show the results of a fluorescence intensity measurement experiment of luminescent particles using a plate reader, respectively, as a result of the luminescent particle number detection experiment according to the present invention.
  • each vertical graph represents an average value of three measurements
  • each error bar represents an SD value of three measurements.
  • FIG. 10C shows the number of pulse signals corresponding to the luminescent particles detected in the time-series photon count data obtained by executing the luminescent particle number detection experiment according to the present invention for each sample solution (pulses).
  • FIG. 2 is a graph plotting the total number of photons detected in the same time-series photon count data (number of photons) against the concentration of luminescent particles in a sample solution.
  • FIG. 11 is an example of the time change of the photon count (light intensity) obtained in the conventional optical analysis technique for calculating the fluctuation of the fluorescence intensity.
  • FIG. 11A shows that the concentration of particles in the sample is sufficient. This is a case where measurement accuracy is given, and (B) is a case where the concentration of particles in the sample is significantly lower than in (A).
  • optical analysis apparatus 1 that realizes the optical analysis technique according to the present invention is capable of executing FCS, FIDA, and the like as schematically illustrated in FIG.
  • the apparatus may be a combination of an optical system of a confocal microscope and a photodetector.
  • optical analysis apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8. Is incident on.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • light-emitting particles that are the observation target typically particles to which fluorescent labels such as fluorescent particles or fluorescent dyes are added are dispersed or dissolved, and these light-emitting particles enter the excitation region.
  • the luminescent particles are excited and light is emitted.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14. (Here, only the light component of a specific wavelength band is selected.), Introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, is converted into a time-series electrical signal, and then to the computer 18.
  • Input and processing for optical analysis is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and as a result, as shown in FIG. Only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region as schematically shown, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • the focal region of the laser beam illustrated in FIG. 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is in the region).
  • the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere bounded by the plane where the light intensity is 1 / e 2 )), and is called confocal volume.
  • the photodetector 16 is preferably an ultra-high light that can be used for photon counting. A sensitive photodetector is used.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed. The operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • the optical path of the optical system is changed and the inside of the sample solution is scanned by the light detection region, that is, the focal region, that is, the light detection region in the sample solution.
  • a mechanism for moving the position is provided.
  • a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG.
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • the mirror deflector 17 is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18). It may be.)
  • the objective lens is typically a water immersion objective lens, but may be an oil immersion objective lens, a silicone immersion objective lens, or a dry (air immersion) objective lens. In the case of a water immersion objective lens, although not shown, the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed. Further, when the luminescent particles to be observed emit light regardless of excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence phenomenon, the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted. When the luminescent particles emit light by phosphorescence or scattering, the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light may be appropriately selected according to the excitation wavelength of the luminescent particles.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a plurality of types of light emitting particles having different wavelengths are included in the sample, light can be separately detected based on the wavelengths. It's okay.
  • the spectroscopic analysis technology such as FCS, FIDA and the like is superior to the conventional biochemical analysis technology in that the required amount of sample is extremely small and inspection can be performed quickly. ing.
  • the concentration and characteristics of the observation target particles are calculated based on the fluctuation of the fluorescence intensity. Therefore, in order to obtain an accurate measurement result, the sample solution
  • the concentration or number density of the observation target particles therein is always about one observation target particle in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity.
  • it is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that, for example, as shown in FIG. 11B, the observation target particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV. As illustrated on the right side of the figure, a significant light intensity (photon count) appears only in a part of the measurement time, making it difficult to accurately calculate the fluctuation of the light intensity.
  • the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which about one observation target particle is always present in the light detection area during measurement, the influence of the background is considered in the calculation of the light intensity fluctuation.
  • the measurement time is long in order to obtain significant light intensity data sufficient for calculation.
  • the concentration of the observation target particles is lower than the level required by the spectral analysis technology such as FCS or FIDA as described above, the characteristics such as the number density or the concentration of the observation target particles.
  • the optical path is changed by driving a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the photodetection region, as described briefly.
  • a mechanism for moving the position of the photodetection region, as described briefly.
  • light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV. .
  • the light detection region CV moves (time to to t2 in the figure), it passes through a region where one luminescent particle (fluorescent dye in the figure) exists.
  • a significant light intensity (Em) is detected as depicted in FIG.
  • the particles to be observed in the optical analysis technique of the present invention are particles such as dissolved molecules that are dispersed in the sample solution and move randomly in the solution.
  • a biomolecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, virus, cell, metal colloid, or other non-biological molecule may be used. And so on.
  • a luminescent label fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical / bioluminescent molecule
  • the sample solution is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • the light intensity measurement in the optical analysis of the present invention is performed except that the mirror deflector 17 is driven during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution (scan in the sample solution). It may be executed in the same manner as the light intensity measurement process in FCS or FIDA.
  • the operation process typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18. Then, the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and during the movement of the position of the light detection region).
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanomirror) to move the position of the light detection region within the well 10.
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18, and in the computer 18, time-series light is transmitted from the transmitted optical signal in an arbitrary manner. Generate and save intensity data. Note that, since the photodetector 16 is typically an ultrasensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, the time-series light intensity data may be time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so that the movement distance can be grasped.
  • the movement of the position of the light detection region is executed at.
  • the movement speed is basically a constant speed.
  • the present invention is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to quantitatively and accurately execute individual detection of luminescent particles from the measured time-series light intensity data, or counting of the number of luminescent particles.
  • the moving speed is preferably set to a value faster than the random movement of the luminescent particles, that is, the moving speed due to the Brownian movement. Since the observation target particle of the optical analysis technique of the present invention is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely and randomly, the position moves with time by Brownian motion. Therefore, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement due to the Brownian motion of the particle, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the particle crosses the light detection region in a substantially straight line, so that the time-series light intensity data is illustrated in FIG. 4 (B).
  • the light intensity change profile corresponding to each light emitting particle becomes substantially uniform (if the light emitting particle passes through the light detection region substantially linearly, the light intensity change profile is the excitation light intensity distribution).
  • the movement speed of the position of the light detection region is the average movement speed (diffusion movement speed) due to the Brownian motion of the particles so that the correspondence between the individual luminescent particles and the light intensity can be easily identified. Set faster than.
  • the moving speed of the position of the photodetection region may be set to 15 mm / s, which is 10 times or more.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 stores the program stored in the storage device (from the detected light from each light emitting particle.
  • the light intensity analysis as described below may be executed by the processing according to the procedure for individually detecting optical signals.
  • the locus when one luminescent particle passes through the light detection region is substantially linear as shown in FIG.
  • the change in the light intensity corresponding to the luminescent particle is a profile reflecting the light intensity distribution in the light detection region (determined by the optical system), as schematically depicted in FIG. Usually, it has a substantially bell shape). Therefore, in one method of detecting luminescent particles, when a threshold Io is set for the light intensity, and the time width ⁇ in which the light intensity exceeding the threshold continues is within a predetermined range, the light intensity profile Is determined to correspond to the passage of one luminescent particle through the light detection region, and one luminescent particle may be detected.
  • the predetermined range for the threshold value Io and the time width ⁇ for the light intensity is determined on the basis of a profile assumed as the intensity of light emitted from the luminescent particles moving relative to the light detection region at a predetermined speed.
  • the specific value may be arbitrarily set experimentally, or may be selectively determined according to the characteristics of the observation target particle.
  • Counting of luminescent particles may be performed by counting the number of luminescent particles detected by the above-described detection method of luminescent particles by any method. However, when the number of luminescent particles is large, for example, the following modes may be used.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • time-series photon count data subjected to the smoothing process 1 is assigned to a data point (time) having an intensity greater than or equal to a predetermined threshold, and 0 is assigned to a data point having an intensity less than the threshold.
  • the time-series photon count data is binarized (lower stage). In all data, the number of luminescent particles that have crossed the light detection region during the measurement is counted by counting the number of locations that transition from 1 to 0 or from 0 to 1.
  • time-series photon count data In another example of a method for counting luminescent particles from time-series light intensity (photon count) data, time-series photon count data (smoothed as in FIG. 5B) ( A differentiation process is performed on FIG. 6A (FIG. 6B).
  • the intensity peak point is a point where the value decreases in the direction of increasing time and the value is 0 or the second derivative value is 0.
  • the number of luminescent particles crossing the light detection area during measurement is counted.
  • control solution a plurality of solutions having different concentrations of luminescent particles are prepared, measurement is performed for each, and the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be like this.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the relationship between the concentration C of various standard luminescent particles and the number N of luminescent particles (formula (5)) with respect to the assumed movement pattern of the light detection region. ) May be stored in advance in the storage device of the computer 18 so that the user can use the information stored as appropriate when the user of the device performs optical analysis.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a model assumed in the calculation experiment.
  • a cube having a length L on one side is arranged with the center as the origin, and the sample is placed in the cube.
  • the light intensity obtained from the actual luminescent particles is typically assumed to change according to the Gaussian distribution in the radial direction with the center of the light detection region as the apex.
  • a sphere having a radius Wo is equivalent to an effective light detection region, and its volume is set to about 1 fL.
  • the position of the light detection region is moved relative to the sample solution. That is, it can also be said that the space of the sample solution moves relative to the light detection region.
  • FIG. 5B shows the light obtained when the particles in the cube are displaced for 2 msec in accordance with the above model, assuming that the moving speed of the light detection region is 15 mm / s and the particle concentration is 10 pM. As is understood from the figure, it was confirmed that the two particles intuitively passed through the light detection region, and the profiles of the intensity change were approximately Gaussian distributions.
  • the particle concentration is set to 10 pM and 0.1 pM
  • the moving speed of the light detection region is set to 15 mm / s
  • the measurement time is set to 10 seconds to perform the counting of the luminescent particles.
  • the average value and the CV value (standard deviation / average value) of the count number of particles when the above was repeated 5 times were as follows. Concentration 10pM 0.1pM Count number 3668 35.6 CV value 1.7% 13.3% As understood from this result, a particle count number approximately proportional to the set particle concentration was obtained.
  • this result shows that a luminescent particle such as a dye having a certain characteristic is excited with excitation light of a given intensity, and the luminescent particle is obtained under the conditions of a given light detection region moving speed and measurement time.
  • counting is performed, a count corresponding to the concentration of the luminescent particles is obtained quantitatively, indicating that the concentration of the luminescent particles can be determined.
  • the average value of the particle count and the CV value were as follows. It was.
  • the position of the micro area which is the photo detection area in the sample solution is moved, that is, the sample solution is scanned while traversing the photo detection area. It does not include statistical processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity performed in FCS, FIDA, etc. by the method of detecting luminescent particles individually or counting such luminescent particles. It is possible to detect the state or characteristics of the observation target particles in the sample solution whose particle concentration or number density is lower than the level handled by FCS, FIDA, or the like.
  • the optical analysis technique of the present invention basically uses the same optical system as FCS, FIDA, etc., it may be executed in combination with FCS, FIDA, etc.
  • FCS optical analysis technique
  • the optical analysis technique of the present invention in the case of detecting an interaction between a plurality of types of substances in a solution containing a plurality of types of substances, and when the concentration difference between the substances is large, for example, the concentration of one of the substances is on the order of nM.
  • the other substance is on the order of pM
  • the high concentration substance is measured and analyzed by FCS or FIDA, and the low concentration substance is measured using the optical analysis technique of the present invention.
  • an analysis aspect such as performing an analysis will be performed. In such a case, it is advantageous to prepare a plurality of photodetectors as illustrated in FIG.
  • Fluorescent dye ATTO633 (Signa-Aldrich Cat. No. 18620) was used as the luminescent particles, and the measurable range of the concentration of the luminescent particles in the sample solution according to the present invention was verified. As a control experiment, the measurable range of the luminescent particle concentration by the fluorescence intensity measured by a plate reader was also measured.
  • a phosphate buffer including 0.05% Tween 20
  • ATTO 633 had a concentration of 0 fM (no dye), 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM.
  • a solution containing ATTO633 at 10 nM and 100 nM was also prepared.
  • a single molecule fluorescence measurement apparatus MF-20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as the optical analysis apparatus.
  • time-series light intensity data was obtained for each sample solution.
  • the photodetector 16 uses an ultrasensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, and light detection is performed sequentially for a predetermined unit time (BIN TIME) over a predetermined time.
  • the photon counting is performed in such a manner that the number of photons arriving at the photodetector is measured. Therefore, the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • the excitation light was 633 nm laser light
  • the detection light wavelength was 660-710 nm using a bandpass filter.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 15 mm / second
  • the BIN TIME was 10 ⁇ sec
  • the measurement for 2 seconds was performed three times.
  • An example of time-series photon count data obtained by measurement for 2 seconds is shown in FIG.
  • FIG. 8B shows the result of smoothing the data of FIG.
  • B Detection of existence region of pulsed signal in time series photon count data—Start point and end point of pulsed signal in time series photon count data after smoothing processing obtained by the process of (a) And a region where a pulse-like signal exists was defined.
  • a primary differential value with respect to time was calculated over the entire area of the time-series photon count data after the smoothing process, and differential value data of the time-series photon count data was prepared. Then, referring to the value on the differential value data of the time-series photon count data, as schematically illustrated in FIG. 8D, the point where the change in the differential value of the pulsed signal becomes large is pulsed. Select the starting point of the pulse-shaped signal, select the point where the change in the differential value of the pulse-shaped signal is small as the end point of the pulse-shaped signal, and the area between the starting point and the end point as the existence area of the pulse-shaped signal Defined.
  • FIG. 9 shows an example of a signal determined as an optical signal of luminescent particles and a signal determined as noise.
  • the fluorescence intensity of each sample solution was measured using a plate reader SH-8000lab (Corona).
  • the excitation light wavelength was 633 nm
  • the detection light wavelength was 657 nm
  • the bandwidth was set to 12 nm on both the excitation side and the detection side.
  • the measurement was performed 3 times with the excitation light flushed 50 times, and the average was used as the final fluorescence intensity value.
  • FIGS. 10A and 10B show the measurement results (number of pulses) and the measurement results (fluorescence luminance) by the control experiment of the above-described photoanalysis technique of the present invention detected for each concentration of the sample solution, respectively.
  • the values are average values of three measurements.
  • the number of pulses measured according to the present invention is the increase in the luminescent particle concentration when the luminescent particle concentration is 100 fM or more. Increased substantially in proportion to As a result, it is possible to detect each luminescent particle by the optical analysis technique of the present invention, and quantitatively determine the concentration by counting individual luminescent particles according to the optical analysis technique of the present invention. It became clear that we could do it.
  • each pulse-like signal in the time-series optical signal data corresponds to the luminescent particles, and a signal determined as noise or foreign matter is determined. Since this is ignored (see FIG. 9), it is considered that the S / N ratio can be maintained relatively well even in a low concentration region where the contribution of noise or foreign matter to the fluorescence intensity is relatively large.
  • FIG. 9 referring to the total number of photons in the time-series photon count data measured in the measurement for 2 seconds according to the optical analysis technique of the present invention for each sample solution, it is shown in FIG.
  • the luminescent particle concentration when the luminescent particle concentration was less than 100 pM, no significant difference was observed from the case where the luminescent particle concentration was 0 M. That is, according to the present invention, not simply counting the number of photons in the time-series photon count data, but by detecting the light signal of the luminescent particles from the time-series photon count data and counting the number, It was shown that the concentration detection sensitivity was greatly improved (in the case of this example, it was possible to measure to a concentration two orders of magnitude lower).
  • the optical analysis technique of the present invention it is possible to determine the number density or concentration of the luminescent particles up to a concentration range lower than the number density or concentration limit that can be measured by the method using the conventional fluorescence intensity. It was shown that.
  • the lower limit of the particle concentration that can be measured by optical analysis techniques such as FCS, FIDA, and PCH including statistical processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity was about 1 nM, whereas the measurement of this example.
  • the lower limit of the possible particle concentration is ⁇ 100 fM. Therefore, according to the present invention, it is shown that it is possible to measure particles in a concentration region that is significantly lower than in the case of optical analysis techniques such as FCS, FIDA, and PCH. It was done.
  • the detection of the luminescent particles by the photoanalysis technique of the present invention can also be achieved by a dry objective lens.
  • the table below shows the number of light signals of luminescent particles detected when using a dry objective and when using a water immersion objective. (Numerical values are average value and SD value of three measurements for 2 seconds.) As can be seen from the above table, it was confirmed that even when a dry objective lens was used, the number of light signals of the luminescent particles increased corresponding to the concentration of the luminescent particles. This indicates that a dry objective lens can also be used in the optical analysis technique of the present invention.

Abstract

　観測対象粒子の濃度又は数密度が低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な光分析技術が提供される。本発明の光分析技術は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、微小領域の試料溶液内に於ける位置を移動しながら（微小領域により試料溶液内を走査しながら）、観測対象粒子である発光粒子からの光を検出し、これにより、微小領域内を横切る発光粒子を個別に検出し、発光粒子のカウンティングや発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。

Description

光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
　本発明は、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）からの光を検出して、溶液中の粒子の状態を分析又は解析するための光分析装置、光分析方法並びにそのためのコンピュータプログラムに係り、より詳細には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、種々の粒子、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子の状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１－３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が達成される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生し、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるので、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。
　特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものであり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではないので、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。
　かくして、本発明の一つの課題は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されている如き、統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術を提供することである。
　また、本発明のもう一つの課題は、上記の如き新規な光分析技術を実現する光分析装置、方法又はそのためのコンピュータプログラムであって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術と同様に測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、観測対象粒子の濃度又は数密度等の特性を定量的に特定することが可能な光分析装置、光分析方法又は光分析用コンピュータプログラムを提供することである。
　概して述べれば、本発明に於いては、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）からの光を検出する光分析技術であって、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、微小領域により試料溶液内を走査しながら、微小領域からの光を検出し、これにより、微小領域内を横切る発光粒子を個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする新規な方式の光分析技術が提案される。
　本発明によれば、一つの態様として、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中に分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、前記の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する信号処理部とを含むことを特徴とする装置が提供される。かかる構成に於いて、「試料溶液中に分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の物であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「発光粒子からの光信号」という場合には、「発光粒子からの光を表す信号」を意味している。
　上記から理解される如く、本発明の装置の基本的な構成に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が光検出部にて検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることとなる。そして、装置の信号処理部は、逐次的に検出される光検出部の信号に於いて発光粒子からの光信号を検出して、これにより、発光粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、発光粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的には、例えば、上記の本発明の装置に於いて、信号処理部が、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（発光粒子のカウンティング）。かかる構成によれば、発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量とを組み合わせることにより、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、上記の本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１～数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
　本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの信号から１つの発光粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の光信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。
　また、上記の本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
　更に、本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまい、検出された光信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　実施の形態に於いて、本発明による共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中の発光粒子からの光を検出する光分析装置は、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域を前記発光粒子の前記試料溶液中での拡散移動速度よりも速い速度にて移動しながら前記光検出領域内に進入した個々の発光粒子からの光信号を個別に検出し、前記光信号を計数することにより前記光検出領域内に進入した発光粒子の数を検出するようになっていてよい。
　上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの光信号を個別に検出するという特徴的な光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、前記の光学系の光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するべく光学系の光路を変更する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順と、検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。
　かかるコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。また、光検出領域の位置を移動するべく光学系の光路を変更する手順に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。更に、信号処理に於いて、１つの発光粒子が光検出領域に入ったことは、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、例えば、所定の閾値より大きい強度を有する光信号を検出したときに判定されてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、上記の如く、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出を行って個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する新規な光分析方法が実現される。従って、本発明の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法は、前記の光学系の光路を変更することにより光学系の光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出する過程と、検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする。
　かかる方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。また、光検出領域の位置を移動する過程に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。更に、信号処理過程に於いては、１つの発光粒子が光検出領域に入ったことは、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、例えば、所定の閾値より大きい強度を有する光信号を検出したときに判定されてよい。
　上記の本発明による装置、方法又はコンピュータプログラムにより実現される光分析技術は、その光検出機構自体については、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、本発明に於いては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、本発明の光分析技術は、発光粒子の数密度又は濃度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
　また、本発明では、溶液中に分散又は溶解した発光粒子の各々を個別に検出するようになっているので、その情報を用いて、定量的に、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度若しくは数密度の算定又は濃度若しくは数密度に関する情報の取得が可能となる。例えば、特許文献５，６に記載の技術では、所定時間内に於ける所定の閾値以上の強度を有する蛍光信号の頻度の集計値と試料溶液中の蛍光分子等の粒子数との相関を得ることが可能であるが、計測領域を通過する粒子の動的な振る舞い（粒子が計測領域を真直ぐ通過したのか、粒子が計測領域内に滞留していたのか）を把握することはできず、従って、所定の閾値以上の強度を有する蛍光信号と計測領域を通過する粒子との対応が不明確であったため、発光粒子のカウンティングは原理的に不可能であり、試料溶液中の粒子の濃度を精度よく決定することが困難であった。しかしながら、本発明によれば、光検出領域を通過する発光粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて発光粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。
　更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになるので、例えば、試料に流れを発生させる場合（流れを与える場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子又は物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上し、また、試料溶液中の検出対象となる発光粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行えることとなる。
　本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明による光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明による光分析技術による光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。 図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図と、その場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図と、その場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 図５は、本発明による光分析技術により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から発光粒子のカウンティングをするための検出信号の二値化処理を含む信号処理過程の一つの例を説明する図である。 図６は、本発明による光分析技術により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から発光粒子のカウンティングをするための検出信号の微分処理を含む信号処理過程の一つの例を説明する図である。 図７は、本発明による光分析技術による発光粒子の検出及びカウンティングの計算実験のモデルを説明する図である。 図８（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ、本発明の光分析技術により計測された時系列フォトンカウントデータ、時系列フォトンカウントデータを平滑化したデータ（スムージング処理を適用して得られたデータ）、平滑化された時系列フォトンカウントデータに対してフィッティングされたガウス関数曲線の例を示している。図８（Ｄ）は、平滑化された時系列フォトンカウントデータに於いてパルス存在領域を決定する処理を示している。 図９は、本発明の光分析技術により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図１０（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明に従った発光粒子数検出実験の結果、プレートリーダーを用いた発光粒子の蛍光強度測定実験の結果を示している。図中、縦グラフは、それぞれ、３回の測定の平均値を示し、エラーバーは、３回の測定のＳＤ値を示している。図１０（Ｃ）は、各試料溶液について本発明に従った発光粒子数検出実験を実行して得られた時系列フォトンカウントデータに於いて検出された発光粒子に対応するパルス信号の数（パルス数）と、同一の時系列フォトンカウントデータに於いて検出された光子数の総計（光子数）とを試料溶液中の発光粒子濃度に対してプロットしたグラフ図である。 図１１は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
　本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。なお、対物レンズは、典型的には、水浸対物レンズが用いられるが、油浸対物レンズ、シリコーン浸対物レンズ又はドライ（空浸）対物レンズであってもよい。水浸対物レンズの場合には、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
　観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
本発明の光分析技術の原理
　ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、図１１（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図１１（Ｂ）に描かれているように、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
　そこで、本発明に於いては、観測対象粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく光分析技術が提案される。
　本発明の光分析技術に於いて、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ～ｔ２）に於いて一つの発光粒子（図中、蛍光色素）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２（Ｂ）に描かれている如く有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる本発明の光分析技術の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、発光粒子（観測対象粒子）の濃度が低い試料溶液でも、発光粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
本発明の光分析装置の作動と処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析に於いては、具体的には、（１）発光粒子（観測対象粒子）を含む試料溶液の光強度の測定処理過程と、（２）測定された光強度の分析処理過程とが実行される。
（１）試料溶液の光強度の測定
　本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
　本発明の光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度が図３（Ｂ）の如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ａ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｂ）に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（１）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　　…（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（２）光強度の分析
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラム（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）に従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの発光粒子の検出
　時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ａ）に示されている如く略直線状である場合、その発光粒子に対応する光強度の変化は、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、発光粒子の検出の一つの手法に於いて、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの発光粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する発光粒子から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められるところ、具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子の特性によって選択的に決定されてよい。
　また、発光粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの発光粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析に於いて無視されてよい。）
（ii）発光粒子のカウンティング
　発光粒子のカウンティングは、上記の発光粒子の検出の手法により検出された発光粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、発光粒子の数が大きい場合には、例えば、以下に示す如き態様にて為されてよい。
　図５（Ｂ）を参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）データから発光粒子のカウンティングを行う手法の一つの例に於いては、まず、検出された時系列のフォトンカウントデータ（上段）に対して、スムージング処理が為される（中段）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。次いで、スムージング処理が為された時系列フォトンカウントデータに於いて、所定の閾値以上の強度を有するデータ点（時間）に１を割り当て、閾値未満の強度を有する強度を有するデータ点に０を割り当てることにより、時系列フォトンカウントデータが二値化される（下段）。そして、全データに於いて、１から０に又は０から１に遷移する個所を計数することにより、計測中に光検出領域を横切った発光粒子の数がカウントされることとなる。
　時系列の光強度（フォトンカウント）データから発光粒子のカウンティングを行う手法のもう一つの例に於いては、図５（Ｂ）の場合と同様にスムージング処理を施した時系列のフォトンカウントデータ（図６（Ａ））に対して微分処理が実行される（図６（Ｂ））。かかる微分処理されたデータに於いて、強度のピーク点は、時間の増大方向に値が低減しており且つ値が０又は二次微分値が０の点であるので、かかる点を計数することにより、計測中に光検出領域を横切った発光粒子の数がカウントされることとなる。
（iii）発光粒子の数密度又は濃度の決定
　発光粒子のカウンティングが為されると、光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、発光粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは困難である。そこで、本実施形態に於いては、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された発光粒子の数と対照溶液の発光粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、発光粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。対照溶液の発光粒子としては、好ましくは、観測対象粒子と同様の波長特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（５）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の数密度ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
計算実験
　本発明の光分析技術の原理により、試料溶液内の発光粒子の数密度に対応した発光粒子のカウンティング結果が得られることを確認するために、下記の如き計算実験を行った。図７は、計算実験に於いて仮定したモデルを説明する図を示している。
　同図を参照して、計算実験に於いては、まず、Ｘ－Ｙ－Ｚ座標に於いて、一辺の長さＬの立方体を、その中心を原点として配置し、その立方体の中で、試料溶液内にて自由にランダムな運動をする発光粒子として、８個の拡散係数Ｄを有する粒子の位置が時間幅Δｔ＝１０μ秒毎にランダムな方向に変位するモデルを設定した。立方体の辺の長さＬは、粒子の濃度に応じて設定され、例えば、粒子濃度を１０ｐＭとしたときには、Ｌ＝１１．０μｍとした。なお、常に、８個の粒子が立方体内に存在し、最初に設定された濃度が維持されるように、粒子が変位して立方体の境界面（Ｘ，Ｙ，Ｚ＝±Ｌ／２の面）を超えたときに、対向する境界面から再度立方体内へ進入するよう設定した（例えば、或る粒子がＸ＝Ｌ／２の面を超えたときには、Ｘ＝－Ｌ／２の面から立方体内へ進入させる。）。また、試料溶液内に於いて、実際の発光粒子から得られる光強度は、典型的には、光検出領域の中心を頂点として放射方向にガウス分布に従って変化すると想定されるので、立方体内に於いて、原点を中心とした光強度分布：
　　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ［－２（Ｘ２＋Ｙ２＋Ｚ２）／Ｗｏ２］　　　…（７）
を設定し、立方体内の座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に位置する粒子が、式（７）によって与えられる光を発すると仮定した。式（７）に於いて、Ａは、中心の強度であり、Ａ＝１とし、Ｗｏは、ビームウェストであり、Ｗｏ＝６２０ｎｍとした。Ｗｏを半径とする球体は、実効的な光検出領域に相当し、その体積が略１ｆＬに設定されることとなる。更に、本発明の光分析技術では、光検出領域の位置が試料溶液に対して移動せしめられる。即ち、試料溶液の空間が光検出領域に対して相対的に移動するということもできる。そこで、モデルに於いて、光検出領域が－Ｘ方向に移動速度Ｖにて空間（試料溶液）に対して移動することをモデル化すべく、立方体内の各粒子のΔｔ＝１０μ秒毎の変位に於いて、Ｘ方向に、Ｖ・Δｔが加算されるものとした。図５（Ｂ）の上段は、光検出領域の移動速度を１５ｍｍ／ｓ、粒子濃度を１０ｐＭとして、上記のモデルに従って２ｍ秒間に亘って、立方体内の粒子を変位させた場合に得られた光強度データであり、図から理解される如く、直観的に２つの粒子が光検出領域を通過し、強度変化のプロファイルは、それぞれ、概ね、ガウス分布となることが確認された。
　更に、種々の濃度の立方体内の粒子が、上記のモデルの設定に従って任意の時間に亘って変位し且つ光を発するものとし、その間の空間から発せられる光強度の総量を逐次的に算出して時系列の光強度データを生成し、得られた時系列の光強度データに於いて、上記に説明された発光粒子のカウンティングの方法に従って、発光粒子の数を計数した。
　上記のモデルに於いて、粒子濃度を１０ｐＭ、０．１ｐＭとし、光検出領域の移動速度を１５ｍｍ／ｓとし、計測時間（粒子の変位の実行時間）を１０秒として発光粒子のカウンティングを行う実験を５回繰り返した場合の粒子のカウント数の平均値とＣＶ値（標準偏差／平均値）は、以下の通りとなった。
　　濃度　　　　　　１０ｐＭ　　　　０．１ｐＭ
　　カウント数　　３６６８個　　　　３５．６個
　　ＣＶ値　　　　　１．７％　　　　１３．３％
この結果から理解される如く、設定された粒子濃度に略比例した粒子のカウント数が得られた。即ち、この結果は、或る特性を有する色素等の発光粒子を、所与の強度の励起光にて励起し、所与の光検出領域の移動速度、計測時間の条件に於いて、発光粒子のカウンティングを実行すると、発光粒子の濃度に定量的に対応したカウント数が得られ、発光粒子の濃度を決定できることを示している。更に、上記と同様の手法にて光検出領域の移動速度を６０ｍｍ／ｓとして実験を行ったところ、粒子のカウント数の平均値とＣＶ値（標準偏差／平均値）は、以下の通りとなった。
　　濃度　　　　　　１０ｐＭ　　　　０．１ｐＭ
　　カウント数　１１４９９個　　　　　１２６個
　　ＣＶ値　　　　　１．１％　　　　　９．４％
この結果によれば、光検出領域の移動速度を増大すると、ＣＶ値が低減し、即ち、発光粒子のカウンティングのばらつきを低減することが可能であることを示している。また、同様に、粒子濃度を１ｆＭとし、光検出領域の移動速度を１００ｍｍ／ｓとして実験を行ったところ、粒子のカウント数の平均値とＣＶ値（標準偏差／平均値）は、それぞれ、１１．６個、７．７％となった。この結果によれば、観測対象粒子の濃度がＦＣＳ、ＦＩＤＡに於いて通常取り扱われる濃度よりも大幅に低い場合でも、本発明に於いては、発光粒子のカウンティングが実行できることを示唆している。
　かくして、上記の本発明の光分析技術によれば、試料溶液内に於いて光検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、試料溶液内を走査しながら、光検出領域内を横切る発光粒子を個別に検出し、或いは、かかる発光粒子のカウンティングを行うという手法によって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等に於いて実行される蛍光強度のゆらぎの演算等の統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能となる。
　なお、本発明の光分析技術は、基本的には、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様の光学系を使用するので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と組み合わせて実行されてもよい。例えば、複数種の物質を含む溶液中に於いて複数種の物質の間の相互作用等検出する場合などであって、物質の濃度差が大きいとき、例えば、一方の物質の濃度がｎＭオーダーであり、他方の物質がｐＭオーダーであるときなどに於いて、濃度の高い物質については、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにより測定及び分析を行い、濃度の低い物質については、本発明の光分析技術を用いて測定及び分析を行うといった分析態様が実行されるであろう。そのような場合、図１（Ａ）に例示されている如く、複数個の光検出器を準備しておくと有利である。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　発光粒子として、蛍光色素であるＡＴＴＯ６３３（シグマ－アルドリッチ社(Signma-Aldrich)　Cat.No.　１８６２０）を用い、本発明による試料溶液中の発光粒子の濃度の測定可能範囲を検証した。なお、対照実験として、プレートリーダーにより計測される蛍光強度による発光粒子濃度の測定可能範囲も測定した。
　試料溶液としては、ＡＴＴＯ６３３を、その濃度が０ｆＭ（色素なし）、１０ｆＭ、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭとなるようにリン酸緩衝液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む）をそれぞれ調製した。なお、対象実験のために、ＡＴＴＯ６３３を１０ｎＭ、１００ｎＭにて含む溶液も調製した。
　本発明の光分析技術による計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ－２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（１）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列の光強度データを取得した。対物レンズには、水浸対物レンズ（４０倍、ＮＡ＝１．１５、ＷＤ＝０．２６）を用いた。なお、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器を用い、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングとした。従って、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０－７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、２秒間の測定を３回行った。２秒間の測定により得られた時系列フォトンカウントデータの例が図８（Ａ）に示されている。
　上記の光強度の測定後、以下の処理手順に従って、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータ中にて検出された光信号を計数した。
（ａ）時系列フォトンカウントデータのスムージング処理－移動平均法により、時系列フォトンカウントデータのスムージングを行った。一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。図８（Ｂ）は、図８（Ａ）のデータをスムージングした結果を示している。
（ｂ）時系列フォトンカウントデータに於けるパルス状の信号の存在領域の検出－（ａ）の処理により得られたスムージング処理後の時系列フォトンカウントデータに於けるパルス状の信号の始点と終点とを決定し、パルス状の信号の存在する領域を画定した。具体的には、まず、スムージング処理後の時系列フォトンカウントデータの全域に亘って時間についての一次微分値を演算し、時系列のフォトンカウントデータの微分値データを調製した。そして、時系列のフォトンカウントデータの微分値データ上の値を参照して、図８（Ｄ）に模式的に例示されている如く、パルス状の信号の微分値の変化が大きくなる点をパルス状の信号の始点として選択し、パルス状の信号の微分値の変化が小さくなる点をパルス状の信号の終点として選択して、かかる始点と終点との間をパルス状の信号の存在領域として画定した。パルス状の信号の存在領域の画定は、時系列のフォトンカウントデータの全域に亘って実行した。
（ｃ）釣鐘状関数のフィッティング－（ｂ）の処理により画定されたパルス状の信号の存在領域の各々に対して、釣鐘状関数の関数として、式（４）のガウス関数をフィッティングした。フィッティングは、最小二乗法により行い、（ガウス関数に於ける）ピーク強度Ａ、ピーク幅（半値全幅）ａ、相関係数を決定した。図８（Ｃ）は、図８（Ｂ）のデータにフィッティングされた関数を示している。
（ｄ）発光粒子のカウンティング－フィッティングされた関数のピーク強度、ピーク幅及び相関係数を参照して、下記の条件:
　　　２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすパルス状信号のみを発光粒子に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス状信号はノイズとして無視し、発光粒子に対応する光信号であると判定された信号の数を「パルス数」として計数した。図９は、発光粒子の光信号として判定された信号の例とノイズとして判定された信号との例を示している。
　対照実験に於いては、プレートリーダーＳＨ－８０００ｌａｂ（コロナ社）を用いて、上記の各試料溶液について蛍光強度を測定した。励起光波長は、６３３ｎｍとし、検出光波長は、６５７ｎｍとし、バンド幅は、励起側、検出側共に１２ｎｍに設定した。蛍光強度の計測に際しては、励起光のフラッシュ回数を５０回とした計測を３回実行し、その平均を最終的な蛍光強度値とした。
　図１０（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、各濃度の試料溶液について検出された上記の本発明の光分析技術による測定結果（パルス数）及び対照実験による測定結果（蛍光輝度）を示している（値は、それぞれ、３回の測定の平均値である。）。まず、図１０（Ａ）を参照して、本発明により測定されたパルス数（発光粒子の光信号としてカウントされた信号数）は、発光粒子濃度が１００ｆＭ以上に於いて、発光粒子濃度の増大に概ね比例して増大した。この結果により、本発明の光分析技術によって、発光粒子一つ一つが検出可能であること、そして、本発明の光分析技術に従って個々の発光粒子を計数することにより、その濃度を定量的に決定できることが明らかになった。
　また、図１０（Ｂ）の対照実験に於いては、発光粒子濃度が０Ｍであるときの蛍光強度と、発光粒子濃度が１００ｐＭであるときの蛍光強度に有意な差が見られないのに対し、図１０（Ａ）の本発明の光分析技術に於いては、発光粒子濃度が０Ｍであるときのパルス数と、発光粒子濃度が１００ｆＭであるときのパルス数に於いて有意な差が見られた。これは、プレートリーダーにより計測された蛍光強度には、ノイズや異物による光信号が重畳されているため、蛍光強度に対するノイズ又は異物の寄与が相対的に大きくなる低濃度域では、Ｓ／Ｎ比が悪化するのに対し、本発明の場合には、時系列光信号データに於ける個々のパルス状の信号が発光粒子に対応するか否かを判定し、ノイズ又は異物と判定される信号を無視するので（図９参照）、蛍光強度に対するノイズ又は異物の寄与が相対的に大きくなる低濃度域でもＳ／Ｎ比を比較的良好に維持できるようになったためであると考えられる。実際、各試料溶液について、本発明の光分析技術に従った２秒間の測定に於いて計測された時系列フォトンカウントデータに光子数の総計を参照すると、図１０（Ｃ）に示されている如く、光子数の総計は、発光粒子濃度が１００ｐＭを下回ると、発光粒子濃度が０Ｍである場合と有意な差が観察されなかった。即ち、本発明によれば、単に時系列フォトンカウントデータに於ける光子数を計数するのではなく、発光粒子の光信号を時系列フォトンカウントデータから検出してその数を計数するという手法により、濃度の検出感度が大幅に向上されることが示された（本実施例の場合には、２桁低い濃度まで測定可能であった。）。
　かくして、本発明の光分析技術によれば、従前の蛍光強度を利用した方法に於いて計測可能であった数密度又は濃度限界よりも低い濃度範囲まで、発光粒子の数密度又は濃度を決定可能であることが示された。更に、蛍光強度のゆらぎの算出などの統計的処理を含むＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に於いて計測可能な粒子濃度の下限が１ｎＭ程度であったのに対し、本実施例の計測可能な粒子濃度の下限は、～１００ｆＭであり、従って、本発明によれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術の場合よりも大幅に低い濃度域の粒子について計測可能であることが示された。
　本発明の光分析技術による発光粒子の検出がドライ対物レンズによっても達成可能であることを確認した。実験は、対物レンズとして、ドライ対物レンズ（４０倍、ＮＡ＝０．９５、ＷＤ＝０．１８）を用いた点を除いて、実施例１と同様に行った（光検出領域の移動速度は、１７ｍｍ／秒とした。）。下記の表は、ドライ対物レンズを使用した場合と、水浸対物レンズを使用した場合とに於いて検出された発光粒子の光信号の個数を示している。（数値は、２秒間の３回の測定の平均値とＳＤ値である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　上記の表から理解される如く、ドライ対物レンズを使用した場合でも、発光粒子濃度に対応して発光粒子の光信号の数が増大することが確かめられた。このことは、本発明の光分析技術に於いて、ドライ対物レンズも利用可能であることが示された。

Claims (26)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    　前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された光から前記発光粒子の各々からの光信号を個別に検出する信号処理部と
    を含むことを特徴とする装置。
  2. 　請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
  3. 　請求項１又は２の装置であって、前記光検出領域移動部が所定の速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  4. 　請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  5. 　請求項１乃至４のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記光検出部にて検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする装置。
  6. 　請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする装置。
  7. 　請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記発光粒子の特性又は前記試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて前記光検出領域の位置の移動速度が変更可能であることを特徴とする装置。
  9. 　請求項１乃至９のいずれかの装置であって、前記光検出領域の位置の移動軌跡が円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であることを特徴とする装置。
  10. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
    　前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出する過程と、
    　前記検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程と
    を含むことを特徴とする方法。
  11. 　請求項１０の方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
  12. 　請求項１０又は１１の方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを特徴とする方法。
  13. 　請求項１０乃至１２のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
  14. 　請求項１０乃至１３のいずれかの方法であって、前記個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とする方法。
  15. 　請求項１０乃至１４のいずれかの方法であって、所定の閾値より大きい強度を有する光信号を検出したときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とする方法。
  16. 　請求項１０乃至１５のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  17. 　請求項１０乃至１６のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置の移動速度が前記発光粒子の特性又は前記試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されることを特徴とする方法。
  18. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
    　前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動するべく前記光学系の光路を変更する手順と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域からの光を検出する手順と、
    　前記検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  19. 　請求項１８のコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  20. 　請求項１８又は１９のコンピュータプログラムであって、前記光学系の光路を変更する手順に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  21. 　請求項１８乃至２０のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光学系の光路を変更する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  22. 　請求項１８乃至２１のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  23. 　請求項１８乃至２２のいずれかのコンピュータプログラムであって、所定の閾値より大きい強度を有する光信号を検出したときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  24. 　請求項１８乃至２３のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  25. 　請求項１８乃至２４のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置の移動速度が前記発光粒子の特性又は前記試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  26. 　請求項１８乃至２５のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置の移動軌跡が円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であることを特徴とするコンピュータプログラム。
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