JP2002507762A

JP2002507762A - 共焦点顕微鏡イメージングシステム

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Publication number: JP2002507762A
Application number: JP2000537103A
Authority: JP
Inventors: ジェイ・ケイ・トロートマン; ティモシー・ディ・ハリス; リチャード・エル・ハンセン; ウィリアム・カーシュ; ニール・エイ・ニクラウス
Original assignee: プリーラックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1998-03-16
Filing date: 1999-03-16
Publication date: 2002-03-12
Anticipated expiration: 2019-03-16
Also published as: JP4812937B2; EP1064579A1; CN1301357A; KR20050088500A; IL164319A0; WO1999047963A9; KR100560588B1; NO20004601L; AU3354799A; KR100618502B1; EP1064579A4; BR9908767A; WO1999047963A8; BR9908767B1; CA2324262A1; NO20004601D0; CA2324262C; IL138496A0; CN100380160C; KR20010041945A

Abstract

(57)【要約】伸長したビームを使用する共焦点イメージングシステム。特異的態様は、電荷結合素子(ＣＣＤ)を備えた装置に関し、装置は蛍光対象観察に使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】これは、１９９８年３月１６日付け米国特許出願番号０９／０４２，５２７の
一部の続きであり、それらすべてを引用によりこの文書に加える。

【０００２】本発明の分野本発明は、細胞抽出物、細胞または組織で種々のアッセイを行うことによる診
断および疾患の処置に有用な薬理剤の同定するための方法および装置に関連し、
当該生物学的活性の測定には、ライン−スキャン共焦点イメージングシステム(l
ine-scan confocal imaging system)および付随データ処理ルーチンの種々の実施態様の使用を含む。

【０００３】本発明の背景現在、薬剤の発見および開発および方法の一般的生物学的研究および細胞を基
とするアッセイを正確に行う装置が必要とされている。細胞を基とするアッセイ
は、化学化合物および新規生物学的標的の作用機構を評価するために有利に用い
られる。細胞を基とするアッセイでは、目的活性が、競合的および相補性プロセ
スの両方の存在下、測定される。化学化合物スクリーニングに適するため、情報
は、化合物の特定活性のため利用し得る。例えば、何れの化合物がアッセイの標
的に結合するかばかりでなく、通常活性の標的のアゴニストまたはアンタゴニス
トの何れであるかということもまた評価し得る。しばしば、標的は、細胞表面レ
セプターである。あるシグナル経路では、最も強力な治療価値である経路のメン
バーは、レセプターではないが、レセプターを付随する細胞内シグナルタンパク
質である。そのため、経路を通して、好ましくは細胞環境において活性を評価す
る方法の開発が望ましい。

【０００４】更に、多くの化学化合物を迅速に、安価にスクリーニングする必要がある。こ
の必要性は、種々の生物学的標的、例えばレセプター、酵素および核酸に対し活
性について化学化合物を試験する医薬産業で普通に生じている。これら化学化合
物は多くのライブラリーで回収され、時折、百万種の化合物を超える。化学化合
物という語の使用は、広く解釈され、それには、単なる有機性および無機性分子
、タンパク質、ペプチド、核酸およびオリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質また
は生物学的興味の惹かれる任意の化学構造が含まれるが、これらに限らない。

【０００５】化合物スクリーニングの分野では、細胞を基とするアッセイは、細胞の回収を
行う。測定した応答は、通常、細胞群全体の平均となる。例えば、イオンチャン
ネルアッセイに使用する通常の機器は、米国特許番号５，３５５，２１５に開示
されている。典型的なアッセイは、イオン感受性色素の蛍光の時間依存の測定か
らなり、当該蛍光は、化学化合物の添加の結果として変化する目的イオンの細胞
内濃度の尺度となる。当該色素を、測定前の時間におけるマルチウェルプレート
のウェルの底に配置する。通常、細胞の応答は、強度および時間の両方において
異質となる。この可変性により、化合物スクリーニングに重要な生物活性は不明
確となり、妨げられる。当該異質性は、実験的な源から生じるが、より重要なこ
とには、異質性は、任意の細胞群の基礎となる。他の間では、可変性の原因は、
当該群のライフサイクルの相違の結果であるかまたは多数の活性標的分子の進化
の分岐の結果である。可変性を和らげ、補い、または利用すらする方法により、
化学化合物の薬理学的活性を特徴とする細胞を基とするアッセイの値が促進され
る。

【０００６】個々細胞の応答の定量により、細胞群の応答の不均一性により生ずる問題が回
避される。群のマイナーフラクションが刺激に応答する場合を考えてみる。平均
応答を測定する装置は、個々の細胞応答を測定した場合よりも低い感度となる。
後者の方法から、活性細胞部分集合を選択し得る応答プロフィルの統計学的特徴
が生ずる。さらなる群の特徴により、応答プロフィルの解釈を拡大する。

【０００７】種々の測定装置が、この必要性の取り組みを試みる従前の分野において用いら
れてきた。フロー−サイトメーターを基とするアッセイは広く実施され、ペンシ
ルビーム(focused laser beam)に細胞を通過させると同時に細胞の性質を測定す
る。幾つかの不利がこの方法に付随する。医薬産業に最も重要なことは、アッセ
イが、マイクロタイタープレートに配置した化合物において容易に実施できない
ことである。更に、処理量が少なく、典型的にサンプルあたり１０−１００秒か
かり、各細胞の観察時間は、１ｍｓ未満となり、力学的アッセイは妨げられ、最
終的には細胞平均化シグナルのみが決定され得る。

【０００８】更に、多くのアッセイが、蛍光シグナルの相対的位置の決定に必要とされる。
米国特許番号５，１０７，４２２および米国特許番号５，５４７，８４９に開示
のスキャンニングサイトメーターと呼ばれる装置が、シグナル細胞のイメージ化
に広く用いられる。許容される速度を得るためには、これら装置を低い分解能( 〜５−１０μｍ)で操作する。そのため、これら装置により、蛍光シグナルの配置における空間的情報を必要とするアッセイ用のフローサイトメーターを超える
少々の利点が得られる。

【０００９】更なる他の技術は、高速カメラ(fast-camera)、全視野顕微鏡(full-field mic
roscope)である。これら装置は、本発明に匹敵する解像度および速度で画像が得
られる能力がある。しかし、それらは共焦的ではなく、結果的に蛍光のバックグ
ラウンドに影響されやすく、光学的なサンプル区分に使用し得ない。さらに、同
時に起こる、多数パラメーターのデータは容易に得られない。

【００１０】従前の技術とは対照的に、本発明を用い、化合物スクリーニングの使用に十分
な早さおよび可変性を有する方法において単一細胞および細胞群の多数パラメー
ター蛍光イメージ化を実施し得る。方法および装置が提供され、個々細胞の原発
性応答およびサンプル群の異質性の更なる測定の両方が得られ、そして分析され
る。更に、これら多数のフルオロホアの位置は、準細胞性分解能(sub-cellular
resolution)で測定され得る。最終的に、本発明を用い、ビデオの速度で急速な変化をイメージし得る。同時に、これらの性能により、新規領域の研究が薬剤候
補の作用機構に付与される。

【００１１】本発明は、発明である蛍光を基とする生化学アッセイにおいても用い得、幾分
、表面シンチレーションアッセイ(“ＳＳＡ”)に類似し、そのアッセイは、化学
化合物のスクリーニングにより広く使用されている方法である。

【００１２】図１(ａ)-１(ｆ)は、レセプター結合ＳＳＡのステップを示す。図１(ａ)では、選択されたレセプター１２で可溶化する膜１０を、液体３０を含むウェル２０
に加える。これら膜を、レセプターを発現する細胞から単離する。図１(ｂ)では
、放射標識リガンド１４をウェルに加える。当該リガンドは、膜レセプターに対
し高い結合親和性があることが知られている。最も通常の放射標識は、³Ｈ、³⁵ Ｓ、¹²⁵Ｉ、³³Ｐおよび³²Ｐである。図１(ｃ)では、ビーズ１６をウェルに添加する。当該ビーズは、膜が強力に粘着する小麦胚凝集素のような物質で被覆され
ている。当該ビーズは、直径３-８μｍであり、シンチラント(scintillant)でド
ープしたプラスチックで造られる。更に、図１(ｂ)および１(ｃ)で示した操作の
順序は、相互に置換され得る。

【００１３】放射標識は、停止する前に約１-１００μｍ進む高エネルギー電子、またはベータ粒子を放射することにより減衰し、それは、放射性同意元素に依存する。放
射標識がビーズに付着する膜に結合するならば、ベータ粒子は、ビーズに到達し
、ルミネセンスのバーストの原因となる。放射標識が液体を通して分散するなら
ば、放出したベータ粒子は、通常、ビーズ内のルミネセンスを励起しない。図１
(ｄ)では、放射標識の減衰の原因となるビーズのルミネセンスを検出する。図１
(ｅ)では、試験化合物１８をウェルに添加する。アッセイの目的は、この化合物
による放射標識化リガンドが置換される程度を測定することである。放射標識さ
れたリガンドが置換し、液体に分散するならば、ビーズのルミネセンスは減衰す
る。図１(ｆ)では、ビーズのルミネセンスを再び検出する。ルミネセンスの減少
を測定することにより、試験化合物の活性を測定し得る。

【００１４】図２(ａ)-２(ｆ)は、レセプター結合ＳＳＡの他の実施態様を示す。この実施態様は、図１(ａ)-１(ｆ)で示したのと本質的に同じである。但し、図２(ａ)-２
(ｆ)で示す実施態様では、ビーズを使用する代わりに、シンチラントでドープさ
れたプラスチックで造られ、膜が粘着する物質で被覆されたウェル底２２を用い
る。その結果、ビーズのルミネセンスを検出する代わりに、図２(ａ)-２(ｆ)で示される実施態様では、ウェル底のルミネセンスを検出する。

【００１５】図３(ａ)-３(ｄ)は、酵素ＳＳＡの実施態様のステップを示す。図３(ａ)では、シンチラントでドープしたビーズ４０に放射標識ペプチド４２を付着させ、そ
れを、液体６０を含むウェル５０に加える。図３(ｂ)では、試験化合物４４をウ
ェルに加える。図３(ｃ)では、酵素４６をウェルに加える。阻害しないならば、
酵素４６によって、ビーズ４０から放射標識ペプチド４２を切断する。結果とし
て放射標識が溶液中に分散し、放射標識の減衰によるビーズ４０のルミネセンス
は生じない。他方、試験化合物が酵素４６を阻害するならば、典型的には、酵素
の活性部位をブロックすることにより阻害するならば、酵素４６は放射標識を切
断せず、放射標識の減衰によるビーズのルミネセンスが生ずる。図３(ｄ)では、
ビーズのルミネセンスを測定し、試験化合物の活性を測定する。

【００１６】図４(ａ)-４(ｄ)は、酵素ＳＳＡの他の実施態様を示す。図４(ａ)では、放射標識されたペプチド４２を、シンチラントでドープされたウェル底５２に付着さ
せる。図４(ｂ)では、試験化合物４４をウェルに加える。図４(ｃ)では、酵素４
６をウェルに加える。図４(ｄ)では、ウェル底のルミネセンスを測定し、試験化
合物の活性を測定する。

【００１７】上記例により、通常のＳＳＡの原理、すなわちシンチラントの放射減衰時間内
の多くの放射標識の変化により目的の活性をアッセイすることが示される。ＳＳ
Ａの１つの魅力は、シンチラントに付着していない放射標識が洗浄ステップのウ
ェルから除去される必要がないことである。

【００１８】ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)は、特定の型のレセプター結合アッセイであり
、そのレセプターは抗体であり、そのリガンドは最もしばしば天然の、または合
成のペプチド、タンパク質、炭化水素または小さな有機性分子である。ＲＩＡは
、任意の調製サンプル中、最もしばしば血漿、骨髄、尿、または細胞抽出物のよ
うな生体サンプル中のリガンドの濃度を測定する間接的な方法である。標準的な
ＲＩＡでは、抗体は、リガンドに対し特異的な親和性を有し、当該アッセイには
、抗体、固定濃度の放射標識化リガンドおよび未知濃度の非標識リガンドが含ま
れる。当該非標識リガンドの濃度は、抗体への結合、およびそれによる標識化リ
ガンドの結合の阻害の程度により測定される。ＲＩＡは、最もしばしば、洗浄ス
テップを伴う、非結合リガンドから結合リガンドを分離する必要のある異質アッ
セイとして実施される。ＲＩＡはまた、ＳＳＡ配置を用い開発し、その抗体レセ
プターをシンチラント充填ビーズに付着させ、洗浄ステップを削除した。

【００１９】しかし、ＳＳＡおよびＲＩＡには、多くの不利な点がある。第一に、これらア
ッセイには、放射活性物質を扱う必要があり、それにより、高価および時間浪費
の両方となる。第二に、これらアッセイは、大きなウェルで効果があるのみであ
る。ビーズまたはウェル底からのルミネセンス放出の速さは、ベータ粒子放出速
度に比例する。典型的な³Ｈアッセイでは、³Ｈ減衰あたり１未満の検出光子が生
ずる。アッセイの速さを増加するため、放射標識リガンドの量を増加させなけれ
ばならず、それに応じて膜、ビーズおよび試験化合物の量を増加させなければな
らない。１０-６０秒間トリチウムＳＳＡを実施するため、１０⁷ビーズを用いな
ければならない。このビーズ量は、約１５０μＬのウェルを必要とする。ＳＳＡ
は、多数の化合物のスクリーニングに望ましいμＬ体積のウェルには効果的では
ない。

【００２０】以下に述べるように、実質的に本発明は、ＳＳＡおよびＲＩＡの放射標識リガ
ンドを蛍光標識リガンドと置換している。そうすることで、ＲＩＡの均一な形態
が得られ、有利なことにＳＳＡの均一形態は維持される。これは、特に、表面張
力により洗浄が実施できないμＬ体積ウェルに重要である。しかし、均一な形態
では、蛍光は、レセプター結合アッセイで示すように、問題となる。当該試験化
合物を添加するとき、ある蛍光標識リガンドは置換され、ウェル体積全体に自由
に分散し、その一方、他のものは膜に付着したままとなる。当該試験化合物の活
性の測定に使用するのは、膜に付着した蛍光標識リガンドの蛍光である。しかし
、蛍光が全ウェルから検出される場合、ウェルの体積中の蛍光標識リガンドから
の放出により、膜に付着した蛍光標識リガンドからの放出が不明確となる。

【００２１】この問題に取り組む１つの方法が、Schroederらの米国特許番号５，３５５，２１５に記載されており、図５(ａ)および５(ｂ)に示されている。Schroederらの方法によると、サンプルは、図５のＡに示すように、斜角のウェルの底に向け
られる光であるビーム１３４により照らされる。そのため、全ウェルは照らされ
ない。更に、ビームが領域１１４を照らす一方、蛍光は、最も少ない量の照明を
受けるウェル体積の下に位置する領域１１４ａからのみ検出される。

【００２２】しかし、Schroederらの方法は、多くの不利な点を有する。第一に、ウェル底の小部分のみを検出するため、Schroederらの方法は、適度に大きいウェルにおいて十分な程度の正確性を伴い実施され得るのみである。１５３６ウェルプレー
トの約直径１ｍｍのウェルに配置したサンプルのイメージ化には適当ではない。
第二に、当該角度をなす照明の幾何学的制約により、高度アパーチャーコレクシ
ョン光学(high numerical aperture collection optics)の使用、十分な感度に到達する必要性、およびウェルの底における、個々の細胞のようなミクロンサイ
ズの物体をイメージ化する解像度が排除される。

【００２３】この問題への他のアプローチには、ポイントスキャン顕微鏡(point scan micr
oscope)を用いる。例えば、Baerらの米国特許番号５，５４７，８４９では、ポイントスキャン共焦システム(point scan confocal system)の使用について記載
する。Baerらは、ポイントスキャン共焦技術に固有のゆっくりとした画像獲得速
度を、空間的分解能を犠牲にすることにより、増加する方法について記載する。
例えば、１０の因子によりサンプル上の照明ビームの直径を拡大するならば、次
いで、照明領域は、ある条件下で１００倍に増加し、スキャンは１００倍早くな
る。分解能を犠牲にして、速さの増加が到達される。更に、‘８４９特許で開示
されるような当該スキャンニング方法に適する検出装置は、本発明に有利に使用
される場合に、原理的に感度という点においてあまり質は良くない。最終的に、
バックグラウンドの排除の程度は、分解能に従って、減少する。そのため、‘８
４９特許に開示の装置は、本発明よりも、感度が低く、バックグラウンドが高く
、分解能が低く、それらはすべて本出願において重要となる。

【００２４】本発明は、ライン-スキャン共焦点顕微鏡の新規実施態様を含む。ライン-スキ
ャン共焦点顕微鏡は当分野に既知である。２つの典型的な実施態様は、米国特許
出願番号５，４５２，１２５のWhiteらにより開示され、J. Microscopy 171 17-
26 (1993)の図７に示されるBrakenhoffおよびVisscherにより刊行されたシステムである。両方とも、サンプルを通して照明を排除するスキャンニングミラーを
使用する。同じミラーが蛍光放射をデスキャンする。スリットを用いる空間的フ
ィルタリング後、肉眼で見るため蛍光をリスキャンする。振動ミラーの使用によ
り、これら顕微鏡は視野を急速にスキャンし得る。ライン照明は、急速イメージ
化を必要とする適用において原理的に有利となる。しかし、ポイント照明との比
較としてのライン照明の関係に対応する、この可能な速度増加からは、イメージ
化システムが、同時に、照明ラインに沿ったサンプルの各点から放出する光を検
出し得るかどうか、理解し得るのみである。開示装置の本質的特徴は、物体面に
結合する多種の独立検出エレメントを有する検出装置の使用である。

【００２５】本発明によると、サンプルは、“平面”中になければならず、イメージ化シス
テムの焦点深度により平面の精密度が決定する。好ましい実施態様では、イメー
ジ化領域は、１ｍｍ²であり、焦点深度は、１０μｍである。そのため、全フィールドが同時に焦点化されるならば、当該サンプルは１００分の１について平坦
でなければならない。これは、局所領域全体について(ウェル底の中心領域のような)多くのサンプルサブストレート(例えば、マイクロタイタープレート)にあてはまる。しかし、実際には、サンプルサブストレートは、全表面について平坦
である必要性はない。〜１００ｍｍの程度のマイクロタイタープレートの場合、
１０，０００分の１について平面が必要となる。

【００２６】本発明は、イメージ化されるサンプルサブストレートの“焦点”化部分に維持
される光学的自動焦点システムを提供する。光学的自動焦点機構には、速いとい
う利点、およびプラスチックマイクロタイタープレートおよび顕微鏡スライドの
ような非処理サブストレートを操作できるという利点がある。有利なことに、こ
の焦点機構は、無視できるほどの遅延により操作され、すなわち、集束機構の応
答時間が、獲得-時間、好ましくは秒のフラクションに比べて短い。本出願に適当な光学に基づく自動焦点機構は知られている。例えば、サーボ機構による制御
に適当な位置エラーシグナル(position error signal)を生ずるための乱視レンズを基とするシステムは、Applied Optics 23 565-570 (1984)に開示されており
、“斜めのビーム”を用いる焦点エラー検出システムは、SPIE 200 73-78 (1979
)に開示されている。好ましい本発明の実施態様では、当該サンプルサブストレートはマイクロタイタープレートである。この場合、集束の好ましい達成手段は
、更にプレートの性質に依存する。プレート底の厚さが、焦点深度のフラクショ
ン内で均一となるならば、物体面の不断性オフセットにおいて平面底を維持する
集束機構が適当となる。目下、通常使用されているマイクロタイタープレートの
均一性では不十分である。そのため、集束機構は、サンプルが存在する表面であ
って、典型的にマイクロタイタープレートのウェルの内側である表面を追跡しな
ければならない。本発明の態様は、マイクロタイタープレートのウェル底のよう
な不連続性表面において急速に集束する新規自動焦点機構である。

【００２７】そのため、均一な形態において、正確に、素早く、そして安価に、多数の化学
化合物をスクリーニングする方法および装置が必要である。加えて、個々細胞お
よび準細胞性イベントのイメージに十分な分解能で、複数パラメーター蛍光イメ
ージ化を実施し得る方法および装置が必要となる。ビデオの速度で、統計学的に
重要な細胞群を追加的にモニターし得るイメージ化システムの必要性もある。

【００２８】本発明の要旨本発明は、ライン−スキャン共焦点イメージングシステムおよび生物学的活性
をアッセイするライン−スキャン共焦点イメージング(ＬＣＩ)システムに関係す
る。

【００２９】好ましい実施態様では、ライン−スキャン共焦点イメージングシステムは、サ
ンプルを照らすため複数波長のレーザー光源を用い、フルオロホアを励起し、電
磁エネルギーを放射する。これら波長には、紫外線スペクトルおよび可視スペク
トルが含まれる。

【００３０】本発明は、マイクロウェルプレートにおける急速の一連のアッセイを行い得、
それは、素早くあるウェルから他のウェルに移動するが、共焦点顕微鏡固有の能
力、薄い光学的区分(thin optical section)を分離するという利点は失わない、
ＬＣＩシステムをつくり得る自動焦点能を用いることによる。

【００３１】本発明の種々の実施態様では、当該サンプルを移動させ、サンプル上の照明の
ラインのスキャンに効果を為す。他の実施態様では、振動ミラーを用い、固定化
位置に維持させたサンプルのスキャンに効果を為す照明のラインを素早く移動さ
せる。例の方法により、イメージは、秒あたり５０フレームまでの早さで得られ
得る。

【００３２】本発明は、統合的分配を提供し、神経または筋肉細胞において効力を有する作
用の伝達のような急速な生物学的イベントの変化を開始させる物質を添加し得る
。

【００３３】本発明により、電荷結合素子(ＣＣＤ)のようなマルチエレメント固体状態検出
装置が好ましくは使用され得る。この装置は、好ましくは連続的に読み取る。好
ましい実施態様では、本発明は直交座標表示ＣＣＤ(rectangular CCD)を使用すると、完全二次元検出器の必要性が避けられ、より速いスピードで読み取ること
ができる。加えて、大きな有効な視野は、ステージスキャンニングの実施態様で
達成し得る。

【００３４】本発明により、好ましい実施態様では、データ獲得と同時に限定化データ分析
を行う能力もまた提供され、高処理のスクリーニングモードで操作し得る。

【００３５】本発明は、蛍光を用いる多種の生物学的アッセイを実施する方法を提供する。
ある実施態様では、目的の標的は、固定化され、または生存細胞中にあり、また
は準細胞性細胞小器官中にあり、または細胞膜上にある。これらアッセイには、
入射光の種々の波長に通常感受性である１つまたはそれ以上の蛍光標識の励起を
必要とする１つまたはそれ以上のパラメーターの測定が含まれる。更に、これら
アッセイは、二次元または三次元で位置付ける１つまたはそれ以上の波長の放射
光の、同時および正確なイメージ化が必要とされ、蛍光的に標識された種および
その相関物の密度が測定される。

【００３６】更に、本発明は、蛍光放射による応答の単一イメージ化か、または同領域また
は細胞の素早く繰り返すイメージ化の何れかを必要とするアッセイを行う方法を
提供する。種々の実施態様では、イメージ化は、秒あたり５０フレームの早さで
行われる。多数の波長および高い空間的分解能を伴う、迅速にイメージ化するこ
の能力により、本発明は、従来実施し得なかったアッセイを行えるか、または優
れた方法で行い得る。

【００３７】本発明は、化学化合物をスクリーニングする幾つかの方法およびフルオロホア
または蛍光プローブの使用を含む多くの型のアッセイを行い得る。通常、これら
のアッセイおよびスクリーニング方法には、試験化合物および薬剤の使用が含ま
れ、それはの幾つかまたは全ては、蛍光標識でタグがつけられ本来的に蛍光性を
有するか、または蛍光生成物中に代謝される。試験化合物および薬剤は種々の方
法に合わされ得る。

【００３８】ある実施態様では、薬剤を、液体を含むウェルに添加する。これは、単一のウ
ェルであるか、またはマルチウェルプレート上の多くのウェルのうち１つである
。目的の生物学的活性は、ライン−スキャン共焦点顕微鏡で測定されるためウェ
ルの底上かまたはウェルの底に位置するビーズの表面上に位置するフルオロホア
の存在または非存在により、測定される。この実施態様は、ＳＳＡ形態と共通す
る、検出種の局在化の活性の測定である。ＳＳＡの場合、局在化により、シンチ
ラントに隣接する。本発明の方法では、局在化は、ウェルの領域となり、好まし
くは底である。ＳＳＡの場合、隣接種に対する感度は、ベータ粒子の遅延時間に
より決定される。本発明では、局在化フルオロホアの感度は、共焦点顕微鏡のオ
プティカルセクショニングの深さにより決定される。

【００３９】更に、本発明は、素早く、自動化した方法の複数サンプルのスキャンニングを
必要とする高処理アッセイを行い得る。これらサンプルは、個々のマイクロウェ
ル中にあり、液体および生存もしくは固定化細胞または細胞成分を含むウェルを
含む。本発明は、分析中に液体サンプルを保持するかまたは生存細胞を支持する
必要のある環境調節をも提供する。

【００４０】本発明の詳細な説明本明細書中に記載の全特許出願、刊行物、および他の参考文献は、すべて引用
によりこの文書に加える。

【００４１】本発明が、疾患の処置用の薬理剤の同定に有用であるかどうか。１つまたはそ
れ以上の蛍光薬剤を用い生物学的応答を測定する多種の生物学的アッセイを行う
ための高処理方法を提供する。そのアッセイは、化学化合物または生物学的目的
物の任意の分子において行われ得、それらには、コンビナトリアルライブラリー
で見つかるもののような薬剤候補が含まれるがこれに限らない。更に、本発明は
、細胞および組織サンプルの病状診断のための方法を提供する。本発明は、蛍光
薬剤を用いる全細胞における薬剤候補の複数生物学的応答を示す方法をも提供す
る。

【００４２】本発明の技術をアッセイに用いると、当該データは、個々の細胞で、細胞性ま
たは準細胞性レベルで、得られ、そのため、統計的に意味のある細胞群のサンプ
ルを構成する十分数の細胞において当該データが十分に速く得られる。本発明は
、多数パラメーターにおいて同時に測定し得、また、個々細胞の複数シグナルと
相関し得る。そのため、それを用い、異質性細胞応答をアッセイし、細胞の小さ
な部分集合に制限される応答をアッセイし得る。

【００４３】更に、本発明は、複数のシグナル経路の同時活性化をイメージとし得、同時に
および一定時間、複数のシグナルと相関し得る。この能力は、個々細胞の一時的
応答または個々の細胞の一時的応答の比較が特異的アッセイを必要とするとき、
きわめて重要である。

【００４４】更に、本発明は、非結合フルオロホアの存在下、または強力な薬剤候補を含む
本質的な蛍光化学化合物の存在下、細胞の焦点面からの蛍光シグナルをイメージ
し得る。

【００４５】これらアッセイは、以下に限らないが、フルオレセイン、ローダミン、Texas
Red、Amersham Corp. 染色Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７、Hoechst
's 核染色およびクマリン染色を含む、任意の既知フルオロホアまたは蛍光標識を使用し得る(Haugland R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research
Chemicals 6^th Ed., 1996, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon参照)。

【００４６】これらのアッセイには、レセプター結合アッセイ、細胞内電気的ポテンシャル
またはｐＨのアッセイ、イオン濃度のアッセイ、酵素活性アッセイ、トラフィキ
ングアッセイ(trafficking assay)、力学的イメージングアッセイ、およびあまり生じない細胞性イベントのアッセイが含まれるが、これらに限らない。

【００４７】レセプター結合および酵素活性アッセイは、ビーズを基とするアッセイか、ま
たは細胞を基とするアッセイである。ビーズを基とするアッセイの幾つかの例は
、WO98/55866に開示されている。しかし、本明細書記載の方法は、ポイントスキ
ャン共焦技術を使用し、当該ライン−スキャン共焦点イメージングシステムは、
データ獲得の早さという点において重要な利点を有する。

【００４８】光学的配置図６は、本発明の第一の実施態様を示す。当該顕微鏡は、電磁放射、例えば、
光学的範囲３５０-７５０ｎｍの源４００または４１０、円筒型レンズ４２０、第一スリットマスク４３０、第一リレーレンズ４４０、二色性ミラー４５０、対
物レンズ４７０、サンプルウェル４８２の二次元的アレイを含むマイクロタイタ
ープレート４８０、チューブレンズ４９０、フィルター５００、第二スリットマ
スク５１０および検出器５２０を含む。これらエレメントは、図６の面に垂直に
広がるマスク４３０、５１０中のスリット口４３２、５１２を有する光学軸ＯＡ
に沿って配置される。レンズ４４０、４７０および４９０の焦点の長さおよびこ
れらレンズ同士に間、ならびにマスク４３０とレンズ４４０とに間、対物レンズ
４７０とマイクロタイタープレート４８０とに間、レンズ４９０とマスク５１０
とに間がある共焦点顕微鏡が提供される。この実施態様では、ランプ４００また
はレーザー４１０の電磁放射が、円筒型レンズ４２０を用いラインに焦点化され
る。ラインの形は、第一スリットマスク４３０により最適化される。当該スリッ
トマスク４３０は、対物面に結合する面である、光学的システムのイメージ面で
示される。スリットマスク４３０中の口４３２により形成される照明ストライプ
は、サンプルウェル４８２の二次元アレイを含むマイクロタイタープレート４８
０上に、レンズ４４０、二色性ミラー４５０および対物レンズ４７０によりリレ
ーされる。通常の説明の場合、図６の光学的エレメントは、断面図で示され、ウ
ェルプレートは遠近法で示されている。ウェルプレート４８０上の照明のライン
の投影はライン４８４で示され、また、図６の面に垂直であると理解される。矢
印ＡおよびＢによって示されるように、ウェルプレート４８０は、示していない
方法によりアレイの次元に平行に２次元(Ｘ、Ｙ)で移動し得る。

【００４９】他の実施態様では、スリットマスク４３０は、物体バック共焦面(objective b
ack focal plane)(ＢＦＰ)４６０に結合する面である、光学的システムのフーリ
エ面内に位置する。

【００５０】更に別の態様において、スリットマスク４３０を完全に除く。この態様にした
がって、光源はレーザー４１０であり、そこからの光を対物レンズ４７０の後焦
点面４６０に集束させた。これは図６に示すように、円筒状レンズ４２０と球状
レンズ４４０の組合わせにより達成でき、または照明を円筒状レンズ４２０によ
り平面４６０に直接集束できる。

【００５１】サンプル領域、例えば、サンプルウェル４８２中のサンプルのイメージを、サ
ンプル内の平面への照明スのラインの投影により得、そこからの蛍光放射をディ
テクター５２０にイメージングし、プレート４８０を照明スのラインに垂直な方
向で移動させ、ディテクター５２０の読取と同調させる。図６に記載の態様にお
いて、蛍光放射を対物レンズ４７０で回収し、二色性ビームスプリッター４５０
を通して投影させ、フィルター５００および第２スリットマスク５１０を通して
レンズ４９０により、ディテクター５２０に、無限遠補正対物レンズ４７０を備
えた共焦点イメージングシステムに適当なようにイメージさせる。二色性ビーム
スピリッター４５０およびフィルター５００は、優先的にその照明ス波長で光を
遮断する。ディテクター５２０は、例示的にカメラであり、一次元または二次元
のいずれかであり得る。一次元ディテクターを使用した場合、スリットマスク５
１０は必要ない。照明ス、検出およびトランスレーション法は、指定された領域
がイメージされるまで続ける。機械運動は、サンプルを連続的速度でトランスレ
ートした場合、単純化される。連続運動は、カメラ読取時間が曝露時間と比較し
て小さい場合、最も有用である。好ましい態様において、カメラは連続的に読み
取る。合わせた曝露時間および読取時間中のサンプルの転置ｄは、照明スライン
の幅Ｗよりも大きいかまたは小さくてもよく、例示的に０.５Ｗ＜ｄ＜５Ｗである。多ウェルプレートの全てのウェルを同じ方法でイメージできる。

【００５２】あるいは、顕微鏡を、主に光学システムの視野により限定される多くの隣接ウ
ェルを通って照明スのラインを集束するように構成できる。最終的に、１個以上
の顕微鏡を同時に使用できる。

【００５３】照明ストライプ４８４の大きさおよび形は、対物レンズ後焦点面４６０におけ
るフーリエ変換ストライプの幅および長さにより決定する。例えば、ライン４８
４の長さは４６０におけるラインの幅により決定され、逆に４８４の幅は４６０
の長さにより決定される。回折限界性能に関して、４６０の照明ストライプの長
さを対物レンズ後開口を一杯にするように選択する。照明ストライプ４８４のサ
イズおよび形は、円筒状レンズ４２０の焦点距離および４２０でのビームサイズ
の組合わせにより、即ち、各次元における有効な開口数により、対物レンズにお
ける収差および対物レンズ視野により負荷された制限内でコントロールされるこ
とは当業者には明白である。

【００５４】照明ライン４８４の次元は、シグナル対ノイズ比を最適化するために選択する
。その結果、それらはサンプル依存的である。アッセイに依存して、解像度は回
折限界の間、即ち、０.５μm以下および約５μmで変化し得る。ビーム長は、好ましくは対物レンズ視野、例示的に.５から１.５mmの間で決定する。Nikon ELWD
, 0.6NA, 40X対物レンズは、例えば、約０.７５mmの視野を有する。６３３nm放射で、この対物レンズでの回折限界解像度は約０.６μmまたは約１１００解像度
エレメントである。

【００５５】有効な深さ分解能は、原則として、スリットマスク５１０における開口５１２
の幅、または一次元ディテクターの幅および対物レンズ４７０とレンズ４９０の
組合わせにより作られたイメージ倍率により決定される。共焦点顕微鏡の最良の
深さ分解能は１μmに近づく。本発明において、５−１０μmの深さ分解能が十分
であるか、有利でさえあり得る。

【００５６】例えば、目的のサンプル、例えば、生存細胞が十分に短いイメージ獲得時間で
適当なシグナル対ノイズイメージを可能にする解析限界容量において不十分なフ
ルオロフォアを含むとき、回折限界容量よりも大きい照射をし、放射を回収する
ことが有利である。類似の状況は、イオンチャンネル開口のような一過性事象の
ビデオレート動態実験の場合に優勢である。実際に、これは対物レンズの後開口
のアンダーフィリング(underfilling)により達成され、これは照明開口の直径の
増加と同等である。照明の有効な開口数(“ＮＡ”)は対物レンズのＮＡよりも小
さい。しかし、蛍光放射は、対物レンズの完全ＮＡで回収される。開口５１２の
幅はより大きな照明容量からの放射を検出するように増加すべきである。回折限
界よりも数倍大きい開口幅で、幾何学的光学は検出容量エレメントのサイズに関
して適当な近似を提供する：側面幅：ａ_d＝ｄ_d／Ｍ軸幅：ｚ_d√２ａ_d／tanα (式中、Ｍは倍率、ｄ_dは開口５１２の幅およびαは対物レンズ４７０により定め
られた半分角である)。本発明で、開口を有さず、検出開口５１２が独立して制御可能である態様における照明開口４３２またはその同等物は重要な部分である
。

【００５７】多波長構成多波長蛍光イメージングを可能にする態様は、あるタイプのアッセイに関して
好ましい。２個またはそれ以上の測定を同時に成すことは、生物学的反応の一つ
の重要なパラメーターが時間であるため、有利であり、しばしば必要である。

【００５８】独立した波長または色の数は行う具体的アッセイに依存する。一つの態様にお
いて、３つの照明ス波長を使用する。図８(ａ)および８(ｂ)は、３色ラインスキ
ャン共焦点イメージングシステムにおける光線通過を記載し、おのおの平面図お
よび側面図である。一般に、システムは数個の電磁放射の源Ｓ_n、視準レンズＬ_n 、および円筒状ラインＣＬにより第１空間フィルターで伸長したビームに集束さ
れる平行にしたビームを産生するためのミラーＭ_n、第１空間フィルターの間の共焦点顕微鏡、および第２空間フィルターＳＦ₂およびイメージングレンズＩＬ、サンプルからの蛍光放射の異なる波長組成を分離し、検出するためのビームス
ピリッターＤＭ₁およびＤＭ₂およびディテクターＤ_nを含む。空間フィルターＳＦ、およびＳＦ₁およびＳＦ₂は、好ましくはスリットマスクである。

【００５９】特に、図８(ａ)は、色λ₁、λ₂およびλ₃のための源Ｓ₁、Ｓ₂、およびＳ₃およ
び各々の源からの光を視準するレンズＬ₁、Ｌ₂およびＬ₃を記載する。レンズＬ₁ 、Ｌ₂およびＬ₃は、好ましくはシステム中の他のレンズの任意の色度を補うよう
に調節する。ミラーＭ₁、Ｍ₂およびＭ₃は、源Ｓ_nからの照明色を合わせるために
使用する。ミラーＭ₂およびＭ₁は部分的に伝達し、部分的に反射し、好ましくは
２色性である。Ｍ₂は、例えば、優先的にλ₃を伝達し、優先的にλ₂を反射する。したがって、λ₃がλ₂より大きいのが好ましい。

【００６０】共焦モードでの顕微鏡の操作は、源Ｓ_nからの合わせた励起およびビームを、対象平面ＯＰ中の“ライン”に、または非常に偏心的楕円に集束させることが必
要である。上記図６に関連して記載のように、種々の構成をこれの達成のために
使用し得る。図８に記載の態様において、合わせた照明ビームを、空間フィルタ
ーＳＦ₁におけるスリットと一致した伸長した楕円に、円筒状レンズＣＬにより集束させる。図８ａおよび８ｂに記載のように、スリットマスクＳＦ₁は、システムのイメージ平面に残り、照明光の伝搬に垂直の平面の軸に沿って、図８ａの
ページの平面における長軸と共に配置される。レンズＴＬおよびＯＬはＳＦ₁を含む平面からの照明ラインを対象平面ＯＰに中継する。回転ミラーＴＭは簡便の
ためである。他の態様において、ＤＭ₃はＴＬとＯＬの間であり、ＣＬは照明光を直接ＢＦＰに集束させる。他の対応は当業者には明白である。

【００６１】図８(ｂ)に関して、サンプルにより放射され、対物レンズＯＬにより集められ
た光を、空間フィルターＳＦ₂上に管状レンズＴＬによりイメージする。ＳＦ₂は
優先的に伸長したページの平面に垂直なように配置されたスリットである。ＳＦ ₂ は主要イメージ平面またはそれに隣接した平面に置かれ得る。ＤＭ₃は部分的に
反射し、部分的に伝播し、好ましくは“多色性”である。優先的にある波長バン
ドを反射し、優先的に他のものを伝搬する多波長“二色性”ミラー、または“多
色性”ミラーが得られ得る。

【００６２】Ｄλ₁はλ₁により励起される蛍光放射と定義される。これは、一般に、λ₁より幾分長い波長の分散である。δλ₂およびδλ₃は同様に定義される。ＤＭ₃は優先的にλ_nを反射し、優先的にδλ_nを伝搬し、ｎ＝１、２、３である。ＳＦ₂ により伝搬される光は、一次イメージ平面に隣接した平面にある検出デバイスに
イメージされる。図８(ａ)において、空間フィルターＳＦ₂のイメージは全３個のディテクターＤ_n上にレンズＩＬにより作られる。この態様は、各々のディテクターにより作られたイメージの間の完全に近い記載が要求される適用において
好ましい。他の態様において、個々のレンズＩＬ_nは検出デバイスと結合し、レンズ対ＩＬおよびＩＬ_nは空間フィルターＳＦ₂のイメージの各々のディテクター
Ｄ_n上への中継に働く。光はミラーＤＭ₁およびＤＭ₂によりディテクター間に分けられる。ミラーは、部分的に伝搬し、部分的に反射し、優先的に二色性である
。ＤＭ₁は優先的にδλ₁を反射し、優先的にδλ₂およびδλ₃を伝搬する。遮断
フィルターＢＦ₁は優先的にδλ₁を伝搬し、存在する他の全ての波長を有効に遮
断する。ＤＭ₂は優先的にδλ₂を反射し、優先的にδλ₃を伝搬する。遮断フィルターＢＦ₂およびＢＦ₃は、優先的にδλ₂およびδλ₃を各々伝搬し、存在する
他の全ての波長を有効に遮断する。

【００６３】走査ミラー構成本発明のある態様において、高感度データ獲得がビデオレートでのイメージの
構成に必要である。ビデオレートイメージングは、一般に１秒当たり３０または
６０フレームを意味する。現在の使用において、３０Ｈｚの桁のフレーム速度が
暗示を意図する。好ましい態様において、ビデオレートイメージングは、照明お
よびサンプルの相対的なトランスレーションを行うために、サンプル平面の一次
元に沿った照明およびそれに垂直な方向での照明ビームの走査により達成される
。走査段階は一般的に大規模である。結論として、十分に速く移動できない。

【００６４】図９は走査ミラーＳＭを使用した本発明の態様を記載する。ミラーは、有利に
は対象後焦点面(ＢＦＰ)に隣接しておかれる。ＢＦＰ(またはそれに隣接した平面)の回転は、対象平面(ＯＰ)およびその隣接平面を移動をさせる。ＳＭの完全走査範囲は、レンズＲＬ₁およびＲＬ₂の焦点レンズの典型的値に対して数度のみ
必要である。図９に示すように、このレンズペアはＢＦＰをＳＭに１の倍率でイ
メージするが、種々の倍率が有利には使用できる。イメージ獲得速度の制限因子
はカメラ読取速度およびシグナル強度である。上記のイメージングモードにおい
て、データはカメラ読取速度、例示的には１ＭＨｚで連続して獲得できる。スキ
ャンニングミラーにより、データを一方向で獲得するのが好ましい。連続的にデ
ータを獲得できる理想化したスキャンニングモーションは、のこの歯である。実
施に際し、転回およびリターン走査時間は、走査時間の〜１／３−２／３を成す
。５０％の待ち時間を考慮して、５０Ｈｚのミラー振動頻度および１ｍＨｚのピ
クセル獲得速度、〜１０,０００ピクセルが５０フレームで１秒当たり１フレーム当たりで獲得され、これは細胞のような個々の対象の定義およびフレームから
フレームへのトラックに十分である。イメージ当たり１０⁴ピクセルが、しかし、上記で一般的に考慮されるよりも１０²−時間短かった。適応に依存して、相対的に小さいイメージを高い解像度で、たとえば、５０−μm×５０−μmで０. ５μm×０.５−μmピクセレーション、または相対的に大きなイメージを低い解像度、例えば、２００−μm×２００−μmを２−μmピクセレーションで獲得するのが有利である。

【００６５】自動焦点本発明にしたがって、サンプルはイメージングシステムの対象平面になければ
ならない。したがって、本発明はサンプルの部分を、システムの対象平面内のイ
メージングシステムの視野において維持する自動焦点機構を提供する。平面の精
度はシステムの被写界深度により決定する。好ましい態様において、被写界深度
は約１０μm、および視野は約１mm²である。

【００６６】記載の自動焦点システムは、取るに足りない遅れで作動し、即ち、反応時間は
イメージ獲得時間に対して短く、例示的に０.０１−０.１ｓである。加えて、自
動焦点光源は照明光源およびサンプル特性と無関係である。他の利点の中で、こ
の構成はサンプル担体の、対象平面の位置と無関係に測定するイメージングシス
テムの光軸に沿った位置を可能にする。

【００６７】単一ビーム自動焦点の一つの態様は、図８および９に提供され、そこでは波長
λ₄の別の光源Ｓ₄およびディテクターＤ₄が示される。波長λ₄はサンプル蛍光か
ら必ず区別されなければならず、有意にはサンプル中の感知できる蛍光を励起し
ない波長である。このようにλ₄は有意には近赤外線波長、例示的に８００−１０００nmである。部分的に伝達し、部分的に反射するミラーＤ₄は有意には二色性であり、λ₄を反射し、λ_nおよびδλ_nを伝達する、ｎ＝１、２、３。本発明に適した光学ベースの自動焦点機構は既知である。例えば、サーボ制御に適した
位置エラーシグナルの発生のためのアスチグマチックレンズベースのシステムが
、Applied Optics 23 565-570 (1984)に記載されている。“斜めビーム”を使用
した焦点エラー検出システムがSPIE 200 73-78 (1979)に記載される。後者の実験は、図８および９に容易に実行でき、Ｄ₄は分割されたディテクターである。

【００６８】ウェル底にあるサンプルを伴うマイクロタイタープレートでの使用のために、
しかし、サーボループがウェル間を移動するために破壊されなければならない。
これは、各時間に照明を他のウェルに移動させる再焦点の必要があるため、実質
的な時間の遅れをもたらし得る。

【００６９】サンプル平面および対象平面の相対的位置の連続閉鎖ループが、本発明の好ま
しい態様で提供され、図１０に示す。このシステムは電磁放射の二つの独立した
ビームを使用する。Ｓ₅に由来するひとつは連続表面に集束され、例示的にマイクロタイタープレートの底である。Ｓ₄に由来する他方は不連続表面に集束され、例示的にマイクロタイタープレートのウェル底である。一つの態様において、
Ｓ₄およびＳ₅に由来するビームは各々波長λ₄およびλ₅を有する。λ₅はＬ₄によ
り視準され、絞りＩ₄により開口され、対物レンズＯＬにより不連続表面に集束される。反射光はレンズＩＬ₄およびＩＬ₅により各々ディテクターＤ₄およびＤ₅ に集束される。部分的に伝搬し、部分的に反射するミラーＤＭ₄は好ましくは二色性であり、λ₄およびλ₅を反射し、λ_nおよびδλ_nを伝搬する、ｎ＝１、２、
３。ミラー、Ｍ₄、Ｍ₅およびＭ₆は部部的に伝搬し、部分的に反射する。λ₄およ
びλ₅が区別される場合、Ｍ₆は優先的に二色性である。

【００７０】サンプルがマイクロタイタープレートに存在する態様により、λ₄はウェル底に集束される。対象平面はウェル底から種々の距離でオフセットされる。これは
Ｌ₄の調節により、あるいはサーボコントロールループのオフセット調節により達成される。記載の簡便化のために、λ₄が対象平面に集束されると仮定する。

【００７１】自動焦点システムの操作は下記の通りである。サンプルウェルの底が対物レン
ズＯＬの焦点平面中でない場合、ディテクターＤ₄はエラーシグナルを発し、これはスイッチＳＷを通ってＺコントロールに供給される。Ｚコントロールはマイ
クロタイタープレートを対物レンズに向かってまたは離れて移動するようにモー
ターをコントロールする(示していない)。あるいは、Ｚコントロールは対物レン
ズを動かせる。マイクロタイタープレートの底ＰＢがレンズＣＦＬと対物レンズ
ＯＬの組合わせの焦点平面にない場合、ディテクターＤ₅はスイッチＳＷを経由してＺコントロールに適応されるエラーシグナルを産生する。ＸＹコントロール
はレンズＯＬの対象平面ＯＰにおけるマイクロタイタープレートを移動するため
のモーターをコントロールする(示していない)。

【００７２】示されるように、全スキャンはコンピューターのコントロール下にある。例示
的スキャンは下記の通りである：特定のウェルのイメージの完了のために、コン
ピューターはＳＷを操作してＤ₄により産生されたエラーシグナルからＤ₅に産生
されたものにサーボ機構のコントロールを切換えるようにする；次いで、コンピ
ューターはＸＹコントロールを次のウェルに平面が移動するように向け、その後
サーボがＤ₄に切換えて戻す。

【００７３】プレートの底からのシグナルを利用する“粗野”集束機構は、サンプルの位置
を、ウェルからウェル変化内に維持するように使用し、試験するために“精細”
機構が必要な範囲を最小化する。もし、例えば、絞りＩ₅の直径が２mmであり、ＩＬ₅が１００mmである場合、ディテクター上のイメージサイズは〜１００μmで
ある。同様に、絞りＩ₄の直径が０.５mmおよびＩＬ₄が１００mmである場合、ディテクター上のイメージサイズは〜４００μmである。後者は、“粗野”焦点として機能するために、低い感受性を選択する。

【００７４】上記の１ビーム態様で、波長λ₄およびλ₅はサンプル蛍光から必ず区別され、
サンプル中で検出できる波長を優先的に励起できない波長である。このように、
λ₄およびλ₅は優先的に、８００−１０００nmのような近赤外である。加えて、
二つの波長は好ましくは区別され、例えば、λ₄＝８３０nm、λ₅＝９８０nmであ
る。

【００７５】２ビーム自動焦点の別の態様において、λ₄＝λ₅であり、二つのビームは同じ
源に由来し得る。優先的に、二つのビームは互いに垂直に偏光され、Ｍ₆は偏光ビームスピリッターである。擬似閉鎖ループコントロールが、下記のように操作する１ビーム自動焦点の好
ましい態様で提供される。走査の最後に、コンピューターはＳＷを操作し、サン
プルホールドデバイスをコントロールするようにスイッチし、これはＺコントロ
ールアウトプットを一定レベルに保つが、プレートは次のウェルに移り、その後
ＳＷはＤ₄に切換えて戻す。

【００７６】検出デバイス記載の装置の必須の特性は、種々の、独立した検出エレメントを対象平面に隣
接した平面に有する検出装置の使用である。上記のように、ライン照明は、急速
イメージングを必要とする適用に主として有利である。ライン照明の点照明と比
較した比較における可能性のある速度増加は、照明ラインに沿ったサンプルの各
点から放出される光の検出が同時に可能であるイメージングシステムでのみ実感
される。

【００７７】電荷結合素子(ＣＣＤ)、または他のカメラを、上記の先行技術のイメージング
システムの出力に置くことが可能である(White et al., US 5,452,125およびBra
kenhoff and Visscher, J. Microscopy 171 17-26 (1993))。得られる装置は本発明と比較して３つの欠点を有する。一つはイメージの二次元ディテクターへの
再走査の必要性であり、これは装置に不必要な複雑さを加える。他は、カメラを
典型的に構成する１０００ピクセル×１０００ピクセルアレイにわたる十分な質
を有する完全二次元ディテクターの必要性である。第３の欠点は、二次元デバイ
スからの完全イメージの読取に必要な付加的時間である。

【００７８】本発明は、これらの欠点を除き、高感受性および低ノイズ検出の束縛の中での
イメージング速度だけでなく、スループットも最適化するために設計する。一つ
の態様は、連続読取ラインカメラを使用し、好ましい態様において、方形ＣＣＤ
をラインカメラとして使用する。両方の態様はイメージ内のライン間またはイメ
ージの間に待ち時間がない。本発明の更なる利点は、大きい有効な視野が、下記
のステージ走査態様で達成可能であることである。

【００７９】検出デバイスに必要な特性は、以下の好ましい態様を考慮して更により明確と
なり得る。対物レンズの解像度限界は＜１μm、典型的に〜０.５μmであり、ディテクターは〜１０００の独立したエレメントのアレイを含む。解像度、視野( ＦＯＶ)およびイメージ獲得速度は別々には変わらず、これらの性能パラメーターの中で必要とする妥協である。一般に光学システムの倍率は解像度を犠牲にす
ることなく、できる限りＦＯＶ程大きくするために設定される。例えば、〜１mm
視野は１０００エレメントアレイを１−μmピクセレーションでイメージする。検出エレメントが２０−μm平方である場合、システム倍率は２０×である。これは１−μm解像度をもたらさないことは注意である。ピクセレーションは解像度と同じではない。例えば、対物レンズの固有の解像限界が０.５μmであり、対
象平面における各々０.５×０.５μm領域がピクセルに写像される場合、得られるデジタルイメージの真の解像度は０.５μmではない。真の０.５−μm解像度の
達成のために、ピクセレーションは、対象平面で領域〜０.２μm×０.２μmに対
応する必要がある。一つの好ましい態様において、イメージングシステムの倍率
は、光学の真の解像度を達成するために設定する。

【００８０】現在、本出願のための十分な読み出しスピードを有する最大の検出効果、最低
のノイズ検出デバイスは、ＣＣＤカメラである。図１１のように、方形ＣＣＤカ
メラは、検出エレメントのｍ×ｎアレイ(ｍが実質的にｎより小さい)を有するも
のとして描かれる。蛍光放射のイメージは、好ましくは読取記録に直ぐ近くであ
る一つの列をカバーする。これは移動時間を最小にし、放射列と読取記録の間の
列からのシグナルのスプリアスのカウントの蓄積を避ける。

【００８１】原則として、光学系の倍率を設定でき、ＣＣＤカメラ上のイメージのスリット
ＳＦ₂の高さは、図１１に記載のように１ピクセルである。実施において、照明ラインとカメラ列軸の間の完全な配置を維持することは難しく、図８および９の
ように、３つのカメラと多波長照明の態様の間の配置を維持することは更に難し
い。検出エレメント、例示的に２から５個のいくつかをカメラの各カラムに一緒
に収納することにより、配置条件は緩くなり得るが、読取ノイズまたは読取時間
の最小のペナルティに苦しむ。

【００８２】各々対象平面に接合した面に配列された、図８、９および図６の５１０におけ
る、可変幅検出空間フィルターＳＦ₂に関連した検出デバイスとして１個またはそれ以上の方形ＣＣＤカメラを有する好ましい態様の更なる利点は、以下のよう
に説明される。上記のように、本発明の一つの態様において、検出空間フィルタ
ーが除かれ、ラインカメラを組合わせ検出空間フィルターおよび検出デバイスと
して使用する。しかし、上記また上記のように、可変幅検出空間フィルターは検
出容量の最適化を可能にし、サンプル依存的シグナル対ノイズ比の検出を最適化
する。以下の好ましい態様は、ラインカメラの利点、即ち、速度および可変検出
容量の柔軟性を残す。倍率は回折限界線の高さｈをカメラの一つの列に造影する
ようにセットする。検出空間フィルターｄの幅は、好ましくはｈ＜ｄ＜１０ｈで
変化する。カメラの照射カラムにおけるディテクターは読取の前に収納され、そ
れは曝露および読取時間に比較して取るにたらない時間を必要とする操作である
。

【００８３】好ましい態様において、カメラはPrinceton Instruments NTE/CCD-1340/100-E
MDである。好ましい態様における読取速度は、読取ノイズの数電子で１ＭＨｚで
ある。ピクセル形式は１３４０×１００であり、カメラは、目的の領域から離れ
て列の大部分(８０％)を移動するように配線し得、カメラを効果的に１３４０×
２０とする。

【００８４】連続読取カメラの利点、即ち、連続蓄積の間の待ち時間を無くす上記の利点に
加えて、更なる利点は、サンプルの広さによってのみ限定された長さを有する方
形像の獲得を可能にすることである。長さは、カメラの幅によって少ない程度、
およびライン照明の範囲まで測定される。好ましい態様において、サンプルは９
６ウェルマイクロタイタープレートのウェルの底に配置され、その直径は７mmで
ある。１μm×１mmのストリップが照射し、照射領域から放出される発光を検出デバイス上にイメージする。光学縦列を、視野が〜１mm²であるように設計する。本発明により、ウェル底のイメージは１×７mm視野にわたり１−μmピクレセーションを産生できる。

【００８５】環境コントロール本発明の態様において、アッセイは生存細胞で行う。生存細胞は適当に作動す
るための生理学的条件の理論的近似をしばしば必要とする。とりわけ重要なパラ
メーターは温度である。特にサンプルの温度を３７℃に保つための、温度を上昇
または低下させる手段の包含が望ましい。他の態様において、相対的湿度および
／またはＣＯ₂および／またはＯ₂のコントロールが生存細胞の生存能の維持に必
要である。加えて、蒸発を最小にするための湿度のコントロールは、小サンプル
容量の場合重要である。

【００８６】ＬＣＩシステムと同等である、上昇した温度、好ましくは３７℃で、マイクロ
タイタープレートを提供する３つの態様は下記である。イメージングシステムは好ましくは耐光性囲いの中にある。第１の態様におい
て、サンプルプレートを、囲いの内部温度を所望の温度に維持することにより、
その温度に維持する。しかし３７℃で、上昇した湿度が意図的に維持されない限
り、蒸発冷却がサンプル容量をアッセイ期間中に限定して減少される。

【００８７】第２の態様は、固定カバー下をプレートが移動できるようにしたマイクロウェ
ルプレートの加熱カバーを提供する。カバーは顕微鏡の光軸に配置したウェルの
上に一つの開口部を有する。加熱カバープレートとマイクロウェルプレートの間
の約０.５mmの空間は、マイクロウェルプレートの移動を自由にし、蒸発を最小化する。応答指令信号を送るウェルの中身が最大数秒、ディスペンサー開口部を
通して環境条件に曝され、該中身は測定中、有意な温度変化を受けない。

【００８８】第３の態様において、薄い、加熱したサファイアウィンドーをプレート底囲い
として使用する。抵抗性ヒーターのウェルセパレーターに沿ったパターンはウィ
ンドー温度を所望のレベルに維持する。更なる態様において、３つの記載法を種々に組合わせることができる。

【００８９】統合ディスペンサーイメージングシステムのビデオレート構成の一つの態様は、更に時間試薬分配
の動力学アッセイ、特にイオンチャンネルアッセイを開始するために構成される
。チャンネル開口の開始は、溶液のマイクロウェルへの分配により達成される。
例えば、ボルト−ゲートチャンネルはＫＣｌの溶液を添加し、血漿膜を脱分極す
ることにより開くことができる。チャンネル開口および続く閉鎖の時間依存性お
よび対応する細胞内濃度の変化は、しばしば必要なビデオレートイメージングに
十分速い。イメージングシステムの固有な速度は、しかし、チャンネル反応が急
速に開始できないかぎり、無関係である。

【００９０】本発明の一つの態様は、統合ディスペンサーを提供する。９６または３８４ウ
ェルプレートで行うアッセイのために、２０−１００μLの範囲の付加的容量が望ましい。イオンチャンネル活性のアゴニストに加えて、例えば、適当である一
ヘッドディスペンサーはIVEK Dispense 2000である。同等なユニットがCAVROから入手可能である。より一般的に、独得な化合物を各ウェルに分配できることが
望ましい。一つの態様は、分析ステーション、独得な化合物を含む源プレートお
よびチップ洗浄ステーションの間をディスペンスヘッドを往復させる、ロボット
運動のデバイス上に１ヘッドディスペンサーを提供する。後者は固定チップディ
スペンサーのための洗浄ステーションおよび使い捨てチップディスペンサーのた
めのチップ交換ステーションである。このシステムは相対的に高価ではなく所望
の機能を提供するが、低いスループットであり、化合物吸引−分配−洗浄サイク
ルあたり約３０秒必要とする。別の態様は、Hamilton Microlab MPH-96のような
マルチヘッドディスペンサーの記載のLCIシステムへの統合により提供される。M
PH-96は、上記の吸引−分配−洗浄サイクルを実行することができるロボット運動のデバイス上に乗せられた９６個の独立した固定チップディスペンサーを含む
。

【００９１】自動スクリーニングアッセイに用いられる本発明の更に好ましい対応において
、イメージングシステムがZymark Twisterのようなプレートハンドリングロボッ
トと統合される。

【００９２】暗視野共焦点構成所望の側面回折が回折限界よりも小さい場合、上清液体によるバックグラウン
ド蛍光を暗視野イメージング法の発明的適応により減少できる。図１２(ａ)およ
び１２(ｂ)は慣用の暗視野における光線通過を記載する。図１２(ａ)において、
サンプル６００を、対物レンズ６２０からの光６１０の中空円錐により照射する
。この光の円錐は、例えば、図１０(ａ)のレンズ４４０に不透明バー６３０を置
くことにより作る。図１２(ｂ)において、サンプル６００からの蛍光放射を次い
で対物レンズ６２０の中心を通して集める。照明および回収の角度の差異により
、照射および検出の両方をされる平面のみがサンプル６００を含む平面である。

【００９３】図１３(ａ)および１３(ｂ)は、逆暗視野を通過する光線を記載する。図１３( ａ)において、サンプル７００を、対物レンズ７２０の中心を通る光のビーム７１０で照射する。図１３(ｂ)において、次いで、蛍光放射を対物レンズ７２０の
外側の周りのみから回収する。対物の外側の周りからの回収は、例えば、図１０
(ａ)におけるレンズ４９０への不透明バー７３０の配置により達成し得る。慣用
の暗視野と同様に、逆暗視野は一つの角度での照明および異なる角度での回収を
含み、サンプル平面のみが照射および検出の両方をされる。

【００９４】図１４は、サンプル平面の回折限界領域よりも大きく照射することが有利であ
る、上記に記載の場合の焦点領域を記載する。照明および回収光線は図１３の逆
暗視野幾何学と同様である。遮断物が、照明ビームに適合した幅を有する対物逆
焦点平面に接合しておかれる場合、暗視野構成が達成される。この配置が、ディ
テクターにおける平面外蛍光衝突の減少に寄与することは図１４から理解できる
。対物レンズの上および下の暗くされた領域からの蛍光は遮断物により通過しな
い。点走査共焦点において、これらの平面外領域からの蛍光は、検出開口により
効率的に拒絶される。ライン走査とも焦点において、ラインに沿った一つの側面
位置からの平面外蛍光は、他の点でラインに沿ったバックグラウンドシグナルに
寄与する；これは点走査共焦点に対したライン走査におけるシグナル対バックグ
ラウンドにおける分解の起源である。ラインスキャン共焦点の逆暗視野構成は、
点スキャン共焦点の特性であるバックグラウンド拒絶の有意なフラクションを回
復するが、ラインスキャン構成の速度の利点は残したままである。

【００９５】リアルタイムデータ分析本発明は、１秒当たりメガバイトのデータの産生が連続的にできる。一つの態
様において、システムは速い高密度、高容量貯蔵デバイスと統合され、それにデ
ータが続く分析のためにリアルタイムでスプールされる。好ましい態様において
、データ分析はデータ獲得と本質的に同じように流れる。このように、データは
貯蔵前に処理される。一般に、分析の結果だけでなく、有利には生データを同時
にアーカイブに貯蔵する。

【００９６】実時間分析ルーチンの数例を各アッセイ群と関連づけて以下に提供する。すべ
ての事例において、手法は対象のハードウエア・プラットフォーム上で操作ソフ
トウエアコードを最適化するために用いる。現時点で好適な実施態様において、
コンピューターはペンティアムなどの３２ビットプロセッサーである。この場合
、すべてのデータは３２ビットパーセルにてアクセスする。

【００９７】一般に、データの入手と分析は多くの個々のプロセスを含んでなる。第一に、
蛍光を１つ以上のディジタル画像に変換するが、そこでのディジタル値は検出装
置の各画素に投射する蛍光放射の強度に比例する。この工程内で、視野全般にわ
たる画像システムの不均一な応答に対して補正がなされるが、その際、バックグ
ランドを差引いたデータがいわゆるフラット−フィールド−ファイルによって分
割される。第二に、２進ビットマップをディジタル画像の１つから生成させるが
、そこで一定の基準に合致するすべての値を１に置換え、この基準に合致しない
すべての値は０に置換える。一実施態様において、この基準は画像それ自体から
決定される閾値を包含する。第三に、ビットマップは連続した値の群−１画素を
検索する。一実施態様において、該群はさらに最小−および／または最大−サイ
ズの基準に対して試験を受ける。第四に、適格な群につて、同じ画像または他の
画像において対応する画素の値を呼び出して記録し、そして全体の平均と他の統
計的特性を決定し、記録する。種々のアッセイに適切なこの基本的手法に追加す
る手法および変化を以下に検討する。

【００９８】アッセイ以下に記載するアッセイ法の多くの変法は本発明により実用化することができ
る。一般に、１種以上の蛍光標識体の特徴的な空間的および／または一過性の分
布がアッセイを定量化するために用いられる。都合のよいことに、蛍光は線走査
共焦点顕微鏡を用いて実質的に平坦な表面から観察される。このセクションを関
連するデータ分析ルーチンにおいて、複雑さの程度が増大するのに概ね従ってア
ッセイ−タイプにより系統立てる。しかし、系統立てるのは厳密なものではない
、と言うのは、分析のアルゴリズムが１つ以上のアッセイ−タイプにもしばしば
適用し得るからである。

【００９９】結合アッセイ本発明方法に従い有利に実施し得る第一のアッセイ−タイプは結合アッセイで
ある。一般に、蛍光標識したリガンドが対象の標的に結合する度合いは、少なく
ともその標的と標識化リガンドを含むサンプルの１つ以上の蛍光画像を分析する
ことにより定量し、開示した線走査共焦点画像システムにより得られる。利用さ
れるリガンドは、これらに限定されるものではないが、発蛍光団が会合した天然
および合成ペプチドとタンパク質、糖、脂質、核酸配列、ウイルス粒子、バクテ
リオファージ粒子、天然および合成毒素、既知薬剤、神経伝達物質の小型有機分
子または合成類似体または固有の蛍光性小分子、ペプチドまたはタンパク質、コ
ンビナトリアルライブラリーからの合成化合物、無作為のペプチド、ｃＤＮＡ発
現ライブラリーからのタンパク質、およびペプチド模倣体などである(Haugland
R. P. 蛍光プローブと研究用試薬ハンドブック、第６版、１８章、参照)。標的としては、これらに限定されるものではないが、レセプターの細胞抽出物または
精製品、リガンド関門およびイオン関門チャンネルタンパク質、酵素、転写因子
、細胞骨格タンパク質および抗体などであり、これらはウイルス、バクテリア、
バクテリオファージ、無脊椎動物および脊椎動物の細胞から誘導し得る。代表的
なレセプターは、これらに限定されるものではないが、アセチルコリン、アドレ
ナリン作動性物質(αおよびβ)、ムスカリン性物質、ドーパミン、グリシン、グ
ルタミン、セロトニン、アスパラギン酸、γ−アミノ酪酸(ＧＡＢＡ)、ピュリナ
ージック物質、ヒスタミン、ノルエピネフィリン、サブスタンスＰ、神経ペプチ
ドＹ、エンケファリン、ニューロテンシン、コレシストキニン(ＣＣＫ)、エンド
ルフィン(オピオイド)、メラノクロチン／ＡＣＴＨ、ソマトスタチン、副甲状腺
ホルモン、成長ホルモン、チロトロピン、チロキシン、サイトカイン、ケモカイ
ン、インシュリン、インシュリン様成長因子(ＩＧＦ)、幹細胞因子、黄体形成ホ
ルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン、アンギオテンシン、エンドセリン、ニュ
ーロテンシン、インターフェロン、ブラジキニン、バソプレッシン、オキシトシ
ン、血管作動性腸内ポリペプチド(ＶＩＰ)、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン
、ニューロトロフィン、エリスロポエチン、プロスタグランジン、ロイコトリエ
ン、トロンボキサンＡ２、カルシトニン、Ｔ細胞、ＬＤＬ／ＨＤＬ、表皮成長因
子(ＥＧＦ)、エストロゲン、およびガライナンなどを包含する。

【０１００】ビーズ−ベースの結合図１５(ａ)〜１５(ｆ)は本発明により実施し得るレセプター−結合アッセイの
実施態様工程を図示するものである。図１５(ａ)において、細胞または組織から
調製し、レセプター標的２１２を含む膜２１０を、液体２３０を含むウエル２２
０に加える。図１５(ｂ)においては、蛍光標識リガンド２１４をウエル２２０に
加える；これらのリガンドは膜レセプター２１２に結合する。図１５(ｃ)におい
ては、ビーズ２２４をウエル２２０に加える。あるいは、１５(ｂ)と１５(ｃ)の
順序は互いに入れ替えることも可能であり、好適な実施態様において、膜被覆ビ
ーズはウエルに加える前に別途に調製する。ビーズ２２４は約１〜２０μｍの範
囲の直径を有し、コムギ胚芽アグルチニンなどの物質で被覆されており、それに
対して膜２１０が接着するか、または膜の直接共有結合または非共有結合を可能
とする表面を有する。

【０１０１】前記の工程は、標識が放射活性ではなく蛍光であること以外、図１(ａ)〜１( ｆ)に描写した先行技術ＳＳＡの対応する工程と同じである。しかし、本発明において、ビーズ２２４は発光体ではなく、それらはウエルの底に沈むか、または
遠沈し得る密度を有するか、あるいは磁性であって外部から磁石を用いウエルの
底に移動させ得るようなものである。図１５(ｄ)においては、蛍光標識体を、例
えば、要素２４０として図解した線共焦点顕微鏡を用い、画像化する。図１５( ｅ)においては、試験化合物２１８をウエルに加える。先行技術アッセイでのように、本アッセイの目的は、試験化合物がどの程度、膜レセプター２１２からの
蛍光標識リガンド２１４に置き換わるかを定量することである。図１５(ｆ)にお
いては、膜２１０になお結合している蛍光標識物を画像化する。２つの蛍光画像
を比較することにより、試験化合物の活性を定量することができる。

【０１０２】図１５(ａ)〜１５(ｆ)に示したアッセイの替わり得る実施態様において、図１
５(ｄ)に示した画像化工程は除いてもよく、また、試験化合物の活性は、図１５
(ｆ)にて得られた画像を対照ウエルの画像またはウエルに添加された蛍光標識リ
ガンドの既知量から予測される画像およびレセプターに対する既知の親和性に比
較することにより定量することができる。

【０１０３】図１５(ａ)〜１５(ｆ)に示したアッセイの特定の実施態様において、該レセプターはリガンドを認識する抗体であり、蛍光標識リガンドは未知量の非標識リ
ガンドを含むサンプルと共に反応に加える。先行技術の放射免疫アッセイにおけ
るように、本アッセイの目的はサンプル中の非標識リガンドの濃度を、それがど
の程度、抗体レセプターからの蛍光標識リガンド２１４に置き換わるかを測定す
ることにより定量することである。

【０１０４】表面結合図１６(ａ)〜１６(ｆ)は本発明によるレセプター−結合アッセイの第二の実施
態様工程を図示するものである。図１６(ａ)において、細胞または組織から調製
し、レセプター標的２５２を含む膜２５０を、液体２７０を含むウエル２６０に
加える。ウエルの底部２６２はコムギ胚芽アグルチニンなどの物質で被覆し、そ
こに膜が接着する。図１６(ｂ)にて、膜２５０がこの物質に結合した様子を示す
。図１６(ｃ)では、蛍光標識リガンド２５４をウエル２６０に加え、膜レセプタ
ー２５２に結合させる。また、図１６(ｂ)と１６(ｃ)の順序は入れ替えてもよい
。

【０１０５】図１６(ｄ)では、蛍光標識体の蛍光を、例えば、要素２８０に図解した線走査
共焦点顕微鏡を用い、画像化する。図１６(ｅ)では、試験化合物２５８をウエル
２６０に加える。図１６(ｆ)では、膜２５０になお付着している蛍光標識体を画
像化し、第一の画像と比較して試験化合物２５８の活性を定量する。

【０１０６】図１６(ａ)〜１６(ｆ)に示したアッセイの替わり得る実施態様において、図１
６(ｄ)に示した画像化工程は除いてもよく、また、試験化合物の活性は、図１６
(ｆ)にて得られた画像を対照ウエルの画像またはウエルに添加された蛍光標識リ
ガンドの既知量から予測される画像およびレセプターに対する既知の親和性に比
較することにより定量することができる。

【０１０７】細胞ベースの結合替わり得る実施態様において、リガンド標的結合は標的を発現する細胞のコレ
クションに関して有利にアッセイされる。一般に、化学化合物をスクリーニング
する細胞ベースのアッセイには多くの利点がある。とりわけ、対象物の活性は、
該化合物の生物活性に影響する細胞の競合過程および相補過程双方の存在下に測
定する。細胞アッセイにおいて、細胞系または組織から調製した細胞は組織培養
ウエルに入れるか、または顕微鏡スライド上に置く。細胞は生存していてもよく
、また未処理であるか、またはジゴキシゲニンなどの試薬により透過性を上昇し
てあるか、あるいはまた、ホルムアルデヒドなどの試薬で固定してもよい。１種
以上の蛍光標識リガンドをアッセイに必要な非蛍光試薬と共に細胞に添加する；
蛍光標識リガンドは１種以上の細胞成分に結合する。次いで、試験化合物を細胞
に加える。あるいは、蛍光リガンドと化学化合物の添加順序を互いに取り替えて
もよい。蛍光標識物は、例えば、要素２４０に図解した線走査共焦点顕微鏡を用
い、画像化する。本アッセイの目的は、試験化合物がどの程度、レセプターから
の蛍光標識リガンドに置き換わるかを定量することである。細胞になお結合して
いる蛍光標識体は、試験化合物の存在下または不存在下に画像化する。２つの蛍
光画像を比較することにより、試験化合物の活性を定量することができる。

【０１０８】細胞ベースレセプター結合アッセイの替わり得る実施態様において、化合物不
存在下の画像化工程は除いてもよく、また、試験化合物の活性は、化合物の存在
下に得られた画像を対照ウエルの画像またはウエルに添加された蛍光標識リガン
ドの既知量から予測される画像およびレセプターに対する既知の親和性に比較す
ることにより定量することができる。

【０１０９】結合アッセイにおける線走査共焦点画像化の利点第一の実施態様において、リガンド−標的結合は１つの励起波長と１つの発光
波長により実施する。本発明のスピードと感度を例示する図２４にデータを提示
する。リガンドを放射能標識してその検出を可能とする先行技術に比較して、そ
の性能の詳細な分析は以下のとおりである。レセプター−リガンドアッセイの先
行技術はＳＳＡ方式のもの、並びに結合リガンドと非結合リガンドとを物理的に
分離し、レセプターに結合したリガンドの量を液状閃光発生体(シンチラント)添
加により測定する方式のものを包含する。

【０１１０】第一に、本発明は少容量ウエル、例えば、１μＬで使用し得る。放射能標識リ
ガンドを採用するレセプター−リガンド結合アッセイにおいて、各放射能標識体
、例えば、³Ｈは唯一度のみ崩壊し、１崩壊当たり高々９０光子を生成するが、その崩壊速度は１秒当たり１０^-8未満である。１個の蛍光分子は総計１０⁴〜１０⁷光子を生成し、毎秒１０³と１０⁶の間の光子を放出する。かくして、蛍光標識体のカウント率は³Ｈに関して約１０¹¹である。したがって、本発明は１ウエル当たり非常に少ない標識物、膜およびビーズがあればよい。例えば、トリチウ
ムＳＳＡは１ウエル当たり１０⁷ビーズを必要とするが、本発明では１ウエル当たり１０³ビーズでよい。結果として、本発明はμＬ容量のウエルで、はるかに短時間で実施可能である。さらに、ＳＳＡでは画像化時間を変更するのが難しい
が、その理由は放射能標識物が一定の率で分解するからである。対して、蛍光標
識物の励起率は光子放出率が増大するように増加させることができ、それによっ
て必要とされる画像化時間を短縮することができる。しかし、励起率は制限なし
に増加させることはできない。事実、それはいわゆる発蛍光団放出率の飽和限界
の存在であり、それが本出願において点走査共焦点に勝る線走査共焦点の実質的
な利点の基礎をなしている。第二に、本発明では放射能を扱う時間と経費を要し
ない。第三に、本発明では少容量ウエルで実施することができるので、化合物と
試薬の消費がＳＳＡよりもはるかに少なく、その結果さらにコストの低減が可能
となる。最後に、本発明ではシンチラントドープのビーズまたはウエル底を必要
とせず、それがさらにコストを低減する。

【０１１１】本発明ではウエル中サンプルの蛍光を画像化するのに線走査共焦点顕微鏡を使
用する。顕微鏡の共焦点面は光学的区割を可能とする、すなわち、サンプルを置
いた平面からの蛍光の検出を可能とする一方、溶液体積からの蛍光検出を最小と
する。これは未結合の蛍光標識リガンドを除去するための洗浄工程の必要性を取
除く；この工程は、ＳＳＡでは必要ないが、シンチラント含有ビーズを使用しな
いＲＩＡなどの他のレセプター−リガンド結合アッセイではいまなお必要である
。顕微鏡の共焦点面はまた本来蛍光性の試験化合物から由来する干渉も排除する
。線走査面は、測定可能なバックグランド阻止能を失わずに、伝統的な点走査よ
りもより迅速にサンプルを画像化することができる。スピードの増大は、発蛍光
団密度、側面分解能、視野、およびハードウエアのパラメーター、例えば、対物
レンズＮＡ、検出感度およびカメラ読取り速度などに依存する。理論的には、ス
ピードの増大は線当たりの画素数に近づき、本発明の好適な態様においてはそれ
が１０００である。実際には、その増大は約１００Ｘである。

【０１１２】これらの利点を定量化するために、代表的なサンプルについて記載する。アッ
セイは細胞ベースであるが、その場合、蛍光の位置は１μｍの精度で分解される
ことになる。かくして、直径１ｍｍのサンプル面積の画像は〜１０³画素の〜１０³線からなる。対象の蛍光シグナルは細胞表面上のリガンド由来であるか、または細胞内の局在化した起源、例えば、核内のレセプターなどの由来である。両
方の場合において、発蛍光団の局所濃度が重要なパラメーターである。細胞当た
り〜１０⁵レセプターを発現する工学的に設計された細胞系では、細胞平均濃度が１μＭである。核内に局在する２０００〜３０００個のレセプターが相当する
局所濃度となる。〜１μｍという所望の側面分解能と矛盾なく、画素当たりの発
蛍光団は〜２×１０³個存在する。本来の細胞性バックグランド蛍光は、同じ種類ではあるが、標識蛍光よりも小さいこと、また、所望のシグナル−ノイズ比は
最小でも１０であると思われる。したがって、検出される光子数は、シグナルと
バックグランドの散弾雑音(ノイズ)および高品質半導体素子検出器の読取りノイ
ズを考慮して、１０³近辺とすることが必要である。本装置は約０．７ＮＡの対物レンズ、ブロッキングフィルター、および半導体素子カメラを使用しており、
その捕集と検出効率は〜１％であって、１画素当たり〜１０⁵光子を放出し、または１分子当たり〜１０²光子を放出する必要がある。望ましいのは、画像が１秒以下、好ましくは、コンマ以下の秒単位で得られることである。もし画素が連
続様式で得られるならば、その場合、画素の一時停止時間は１μ秒未満でなけれ
ばならず、１分子当たり１０⁸／秒より大きい光子放出率を必要とする。この値は一般に１０⁶である殆どの発蛍光団の飽和値を超えている。重要なのは、飽和を達成するのに必要な流束、１０⁵〜１０⁶Ｗ／ｃｍ²が発蛍光団の非直線性光誘導退色を同様に推進するのに十分なことである。最後に、最高効率の検出装置は
連続走査に要求されるデータの速度では使用できない。それに対して、発蛍光団
当たりの放出率は、もし１０³画素が同時に照射されるならば、〜１０⁵であれば
よい。点走査共焦点のバックグランド蛍光の阻止が増大すると、劇的に減速する
走査スピードのマイナス面を保証することにならない。

【０１１３】図２４の代表的なデータは、開示されたシステムがビーズ１個当たり数十の発
蛍光団を定量するのに十分な感度を有し、しかも１秒以内で数百の個々のビーズ
を明瞭に解像することを示している。比較データは下に示すように、細胞ベース
の結合実験にて入手することができる。

【０１１４】データ分析データ分析ルーチンは結合が細胞ベースであるか、ビーズベースであるかに密
接に関係しており、下記に一緒にして示す。データは以下のルーチンにより分析
し得るが、その最も簡単なのが閾値画像分析アルゴリズムである。ルーチンの目
的は連続もしくは断続的様式で局在化する蛍光標識体の量を、最小の蛍光強度を
超えるように、また任意ではあるが最大の蛍光強度を超えないように定量するこ
とである。一実施態様において、当該分析は化学化合物の活性をアッセイするた
めに使用する。

【０１１５】アルゴリズムの工程は以下のとおりである：１．標識体のディジタル画像を取得する。２．ファイルを一段ごとに開き、そして i. 画像からカメラのオフセット値を引き、 ii. 画像の各段に平面野画像ファイルの対応する段の逆数を掛ける。３．選択肢として、バックグランドレベルを決めるために、画像のヒストグラム
を作成する。

【０１１６】４．最小値と任意ではあるが最大値を含む選択基準を確立する。この値は、例え
ば、バックグランドのヒストグラムピーク巾に関する統計的分析により、または
所定の値を用いることにより、平均バックグランドレベルの定まった倍数として
、または平均バックグランドレベル以上の定まったカウント数として決定する。５．画像の各画素を選択基準に比較する。この基準に合う画像の各画素について
、ランニングの総計にこの値を加える。適格画素の総数と平均強度が報告される
。

【０１１７】このルーチンは図２４と同様にデータの処理に有利に使用されるが、ここでは
個々のビーズはバックグランドと明瞭に識別され、凝集したビーズまたは細胞に
よるアーチファクトは少ない。かかるルーチンは同じ様に、ウエル底に結合した
膜をもつアッセイタイプにも適切である。

【０１１８】結合データを分析するために適用し得る第二のルーチンは局在化分析アルゴリ
ズムであり、これはさらに形状分析プロトコールを必要とする。閾値ルーチンで
のように、この目的は連続もしくは断続的様式で局在化する蛍光標識体の量を定
量することである。一実施態様において、当該分析は化学化合物の活性をアッセ
イするために使用する。

【０１１９】アルゴリズムの工程は以下のとおりである：１．標識体のディジタル画像を取得する。２．ファイルを一段ごとに開き、そして i. 画像からカメラのオフセット値を引き、 ii. 画像の各段に平面野画像ファイルの対応する段の逆数を掛ける。３．選択肢として、ヒストグラムを作成し、画像の画素値を総計する。

【０１２０】４．最小値と任意ではあるが最大値を含む選択基準を確立する。この値は、例え
ば、バックグランドのヒストグラムピーク巾に関する統計的分析により、または
所定の値を用いることにより、平均バックグランドレベルの定まった倍数として
、または平均バックグランドレベル以上の定まったカウント数として決定する。５．画像の各画素を選択基準に比較する。適格とした画素はすべて１の値とし、
他はすべて０の値として、それによって１６ビットから１ビットへの圧縮を実施
する。６．画像の端部は、端部に接するメンバーをもつ２進マスクにおいて、１の値と
した連続画素を０にセッティングすることにより「クリーン」とする。

【０１２１】７．連続的値−１のグループと定めた対象のビットマップを検索する：１．値１の画素を見出すために線ごとのパターンの画像を検索する。２．１)で同定した画素に連なる値−１の画素すべてを定量する。３．選択肢として、最小および最大サイズのフィルターを対象にあてがう。
フィルターのサイズは予め決めておく。４．もし対象が適格ならば、工程８に進み、そうでなければ、対象の１値と
した画像を０に変え、次の対象を求め、検索を続ける。５．ビットマップの終端に達したならば、工程９に進む。

【０１２２】８．フィルター基準を通った各対象については：１．選択肢として、境界を広げた新たな長方形のビットマップを作成するが
、このマップは対象の端部から各方向に向けて対象プラスｎエキストラ０画素を
含む。ｎは下記のように実施される伸長工程の数であり、予め決めて置く。２．もし８．の１．を遂行するならば、その場合は、伸長工程をｎ回適用す
ることにより対象を伸長するが、その場合には、値−１とした画素に触れる０値
の画素を値−１とする。３．伸長ビットマップにおいて、または当初のビットマップにおいて工程８
．１．を実施しなかった場合の、値−１とした画素の各捕集については、画像か
らの対応する画素値を総計し、平均して、マスク下の平均画素強度を計算する。４．当初のビットマップ画像の対象の画素すべてを０に変えて、工程７に戻
り、さらに対象を検索する。

【０１２３】９．すべての対象をカウントした後、対象当たりの蛍光標識体の平均強度および
、選択肢として、局在化した標識体の総強度端数を画像の対象すべてについて計
算し、標準偏差などの統計情報と共に報告する。

【０１２４】このルーチンにおける識別操作は、以下のアルゴリズムすべてが共有するが、
工程４〜６における２進マスクの生成である。マスクについての対象の選択基準
は、任意ではあるが、最小値および最大値、サイズおよび形状を包含する。例え
ば、一実施態様において、ビーズベースアッセイのための分析ルーチンは工程７
．iii．の円形フィルターを含む。

【０１２５】第二の実施態様において、２種以上の蛍光標識体の発光は、１以上の照度波長
で励起して同時に検出する。結合アッセイで適用したように、第一の蛍光標識体
を用いて対象物を同定し、それに第二の蛍光標識体を結合させる。二色細胞ベー
ス結合アッセイの２例を図２１と２３に示す。かかる画像の分析に使用し得る代
表的な手法は同時局在化分析ルーチンであるが、それは局在化した第一蛍光標識
体の量を、第二蛍光標識体を基準にして定量するように設計されたものである。
一実施態様においては、この分析法を用いて、化学化合物の活性を、例えば、活
性が対象細胞下の局在化に依存している場合に、アッセイする。

【０１２６】アルゴリズムの工程は以下のとおりである：１．第一および第二標識体それぞれのディジタル化画像を取得する。２．ファイルを一段ごとに開き、そして i. 各画像からそれぞれのカメラのオフセット値を引き、 ii. 各画像の各段にそれぞれの平面野画像ファイルの対応する段の逆数を掛
ける。３．選択肢として、バックグランドレベルを決定するために第一標識体のヒスト
グラムを作成し、第一標識体画像の強度を総計する。４．最小値と、選択肢としての最大値を含む選択基準を確立する。これらの値は
、例えば、バックグランドのヒストグラムピーク巾に関する統計的分析により、
または所定の値を用いることにより、平均バックグランドレベルの定まった倍数
として、または平均バックグランドレベル以上の定まったカウント数として決定
する。

【０１２７】５．第一標識体画像の各画素を選択基準に比較する。適格とした画素はすべて１
の値とし、他はすべて０の値として、それによって１６ビットから１ビットへの
圧縮を実施する。６. 画像の端部は、端部に接するメンバーをもつ２進マスクにおいて、１の値と
した連続画素を０にセッティングすることにより「クリーン」とする。

【０１２８】７．連続的値−１画素のグループと定めた対象のビットマップを検索する：１．値１の画素を見出すために線ごとのパターンの画像を検索する。２．１)で同定した画素に連なる値−１の画素すべてを定量する。３．選択肢として、最小および最大サイズのフィルターを対象にあてがう。
フィルターのサイズは予め決めておく。４．もし対象が適格ならば、工程８に進み、そうでなければ、対象の１値と
した画素を０に変え、次の対象を求め、検索を続ける。５．ビットマップの終端に達したならば、工程９に進む。

【０１２９】８．フィルター基準を通った各対象については：１．選択肢として、境界を広げた新たな長方形のビットマップを作成するが
、このマップは対象の端部から各方向に向けて対象プラスｎエキストラ０画素を
含む。ｎは下記のように実施される伸長工程の数であり、予め決めて置く。２．もし８．の１．を遂行するならば、その場合は、伸長工程をｎ回適用す
ることにより対象を伸長するが、その場合には、値−１とした画素に触れる０値
の画素を値−１とする。３．伸長ビットマップにおいて、または当初のビットマップにおいて工程８
．１．を実施しなかった場合の、値−１とした画素の各捕集については、第二標
識体の画像からの対応する画素値を総計し、平均して、マスク下の平均画素強度
を計算する。４．当初のビットマップ画像の対象の画素すべてを０に変えて、工程７に戻
り、さらに対象を検索する。

【０１３０】９．すべての対象をカウントした後、対象当たりの第二蛍光標識体の平均強度お
よび、選択肢として、第一標識体と同時局在化した第二標識体の総強度端数を画
像の対象すべてについて計算し、標準偏差などの統計情報と共に報告する。

【０１３１】このより精緻なルーチンの利点は、対象が、それが細胞であろうと、ビーズで
あろうと、独立に同定し得るということである。図２１に例示するように、すべ
ての細胞が応答する訳ではない。細胞の個別の同定は、例えば、応答細胞と非応
答細胞の比を、応答する細胞の応答の度合いと共に表とすることを可能にする。
このアルゴリズムは、さらに複雑であるにもかかわらず、ペンティアムIIプラッ
トフォーム上１秒以下以内で１メガ画素の画像を分析するように構築することが
できる。

【０１３２】移動アッセイ第２の態様に従って有利に行い得る追加のアッセイの種類は、１またはそれ以
上の光波長によって励起させ、２またはそれ以上の蛍光標識された物体の放射( 発光)を同時に検出する移動アッセイである。これらのアッセイにおいて、対象の移動は、１またはそれ以上の物体についてであって、タンパク質、脂質または
別の分子複合体または細胞レベル以下の構造(例えば小胞)の充分特定された領域
から他の領域へのものである。これらは、シナプチン(小胞膜タンパク質)、転写
ファクター(ＮＦ−κＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ−１)、ホルモン受容体、ＬＤＬ／ＨＤ
Ｌ受容体、Ｔ細胞受容体、ＰＴＨ受容体を包含するがそれに制限するものではな
い。

【０１３３】基本型の移動アッセイは、共局在測定の特別なケースである。具体的には、第
１および第２物体の共局在は、第１に関して共存する第２物体の画分、または第
１物体と共在する第２物体と細胞中の他の場所に在する物体の割合によって定量
される。局在画像データを処理するために好んで使用される拡張した分析手順を
以下に示した。

【０１３４】標識される位置は細胞の核であって、この標識は、ＤＮＡに対して特異的な蛍
光孔体、例えばHoechst 33342である。別の核酸特異性染色がこの分野ではよく知られている(例えば、Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and
Research Chemicals、６版、８章を参照)。第２物体は、細胞質から核への移動がアッセイの主体である転写ファクターである。このタンパク質は、ＧＦＰとの
融合体としての発現を含み、転写ファクタータンパク質に特異的な蛍光標識抗体
と試料とを接触させることを含む、多様な方法によって標識することができる。

【０１３５】以下の移動化データ分析手順を用いて、第２の蛍光標識された物体に関して関
連のあるまたは関連のない手法で分布した第１の蛍光標識された物体の量を測定
することができる。１つの態様では、該分析を用いて、化学化合物の活性を評価
する。アルゴリズムの段階を以下に示す：１．第１および第２標識物体各々の画像を獲得し、２．行ごとに(row by row)にファイルを開き、 i)各画像から各々のカメラのオフセット値を控除し、 ii)その各フラット・フィールド(flat-field)画像ファイルにおいて、対応する行の逆数を各画像における各々の行にかける。３．所望により、第１物体の画像を背景のレベルを測定するためにヒストグラ
ムにし、第２物体の画像強度を合計する。４．最小値および所望により最高値を含む選択標準を設定する。これらの値を
、例えば、予め決めた値を使用することによって、ヒストグラムピーク幅につい
ての統計学的分析により、または平均背景レベル以上の計算の定数(fixed numbe
r of count)として決定する。５．第１物体の画像における各ピクセルを選択標準に対して比較する。全適格
ピクセルを、１値にし、それ以外の全てを０値とし、それによって１６−１ビッ
ト圧縮をもたらす。６．エッジ近傍メンバー(edge-touching member)を持つ二重マスクにおける全
ての１値の近傍ピクセルを０に設定することによって画像のエッジを"クリーン"
化する。７．１値近傍のピクセル群として定義される、対象に対するビットマップを以
下のように検索する：１)線画パターンにおける画像を検索し、１値ピクセルを見出し、２)１)で同定されたピクセルに近傍する全ての１値ピクセルを決定し、３)所望により、サイズを予め決定した最小および最高サイズのフィルターを対象に適用し、４)対象が許容される場合、段階８に進み、そうでなければ該対象における全ての１値ピクセルを０に変化させ、次の対象に対する探索を続け、５)ビットマップの最後に到達すると、段階９に進む。

【０１３６】８．フィルター標準を通過する各々の対象に対して：１)対象のエッジから各々の方向においてｎ個の０値ピクセルを有する対象を含む拡張された境界で新規の四角形のビットマップを作成する。ｎは、以下で行
われ、予め決定された膨張段階(dilation steps)の数である。２)１値ピクセルに隣接するピクセル値０は１値に設定する拡張段階をｎ回適用することによって対象を膨張する。３)元のフルサイズのビットマップと膨張したビットマップを比較する。元のマップの対応する領域において１値である、膨張したビットマップにおける全て
のピクセルを０にあわせる。これにより、環状マスク(annular mask)をつくり、
拡張中にビットマップボーダーが増大したときに、ただ１つだけの対象が捕捉さ
れることを確実にする。４)元の対象から別のビットマップを作り、０値ピクセルに近接する１値ピクセルを０に設定することによって、ｍ回それを減退(erode)させる。通常、ｍは、ｎに等しく、予め決定する。５)環状かつ減退したビットマップにおける１値ピクセルの各々の収集にあたって、対応するピクセルを第２物体の画像から平均し、環状かつ減退したビット
マップの下でのその平均ピクセル強度を計算する。６)各々の対象に対し環状強度対減退強度の割合を計算し、表に移す。７)元のビットマップにおける対象の全てのピクセルを０にかえ、より多くの対象を探索するために段階７に戻る。ａ)全ての対象が計算された後、画像における全対象の平均強度比を、統計的情報、例えば標準偏差を用いて計算する。

【０１３７】上記開示されたものに基づくこの手順の新しい特徴は、１つの１次マスクの環
状拡張であり、１つは一次マスクの減退したバージョンである２つの娘マスクの
段階８における創成である。本例においては、物体２と物体１の共局在化、転写
ファクターおよび細胞核(実際には、ＤＮＡ)を、それぞれ後者を用いて定量した
。前者のマスクを使用して、共局在化していない物体２を定量した、本例におい
て、これら２つの量比は、細胞(セル)基準で作成し、その結果を作表した。

【０１３８】本発明の方法に従って、データ取得および分析は、約１秒間で行い得る。比較
のために、２つの先行技術の例を引用する。

【０１３９】 Ding ら [J. Biol. Chem, 273, 28897-28905 (1998)]において、比較し得る２色
局在アッセイを実施した。本発明の利点は、以下を包含する：１)データチャンネルあたり約５０倍速い画像捕捉、２)同時の２色画像捕捉、３)低い着色レベルを許容する約１０倍の卓越した感受性、４)すすぎ段階を省きうる共焦検出、５)約３０秒と比較して、約０.１秒の焦点時間、６)３〜６秒/フレームと比べて約０．２秒/フレームのデータ分析時間、７)連続的画像捕捉。

【０１４０】先行技術の第２番目の例は、Deptala ら[Cytometry,,33,, 376−382, (1998)]で
ある。本発明は、１)より高い、約４倍の空間的解像力、２)約１６倍の高いピクセル捕捉速度、３)より速いデータ解析力、４)マイクロタイタープレートで操作できるオートフォーカス、および５)３〜６秒／フレームと比べて約０.２秒/フレームの分析時間、である。

【０１４１】エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスおよび受容体隔離一般的には、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、受容体隔離およ
びリサイクル、第１または第２の態様および上記で開示された関連画像分析プロ
トコールによって評価し得るその他の過程である。蛍光標識化は、様々な既知の
方法に従って達成される。例えば、受容体およびリガンド両方の標識化を含む実
験は、Tarasova ら [J. Biol. Chem.,, 272,, 14817-14824 (1997)]によって開示されている。本画像システムは、データチャンネルあたり約５０倍速く、同時
に２つの画像を得ることができる。さらに、例えば、本発明の分析プロトコール
である、共局在化アルゴリズムを使用して、リアルタイムの隔離画像を処理する
ことができる。先行技術においてはそのような例は、全く知られていない。

【０１４２】類似の画像化および分析可能出力を必要とする多くの他のアッセイは、先行技
術において既知である。例えば、ファゴサイトおよび関連細胞の事象を包含する
アッセイ[J. Immunology, (1983) 130, 1910; J. Leukocyte Biol. (1988) 43,
304)]；別のアッセイは、受容体介在および受容体非仲介の両方のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスを包含し[Neuron 14, 983 (1995); J. Physiol
. 460, 287 (1993) and Science 255, 200 (1992)]、低密度リポタンパク質複合
体の受容体介在エンドサイトーシス [J. Cell Biol. 121, 1257 (1993)を参照]
およびトランスフェリンの脊椎細胞への伝播[Cell 49, 423(1994)を参照]；エン
ドサイトーシスおよび蛍光標識された表皮性成長ファクターの横軸の横方向の移
動を画像化すること[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 2135 (1975); J. Cell B
iol. 109, 2105 (1989)]；蛍光デキストリンによるエンドサイトーシスによる細
胞外物質の取込みおよび内部プロセッシングを追跡すること[J. Biol. Chem. 26
9, 12918 (1994)を参照]、および疎水性染料を使用して、活発にfireしているニ
ューロンにおけるシナプシス小胞のエンドサイトーシス介在性再循環の画像化[N
ature 314, 357 (1985)を参照]を包含する。

【０１４３】さらに、細胞外および分泌性顆粒(例えば、クロモグラニンＢ，分泌顆粒タンパク質)[J. Cell Sci. 110,,1453 (1997)を参照]に局在するタンパク質か、また
は分化した神経細胞における成長錐体に局在するｔＰＡ[Mol. Biol. Cell 9: 24
63 (1998)を参照]に融合する緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を発現する遺伝子工学
による細胞系は、エキソサイトーシスの追跡を可能にした。非常に多種の蛍光標
識物は、そのようなアッセイに利用できる[Haugland R.P. Handbook of Fluores
cent Probes and Research chemicals, ６版. 17章を参照]。

【０１４４】イオンチャンネル本発明の第３の態様は、図９に記載した１つのバージョンを用いて、１秒あた
り、約３０フレームの速度で、１つまたは１つ以上の蛍光標識物体の時間依存性
応答を画像化することができる。これは、一過性の事象、例えばイオンチャンネ
ンの開閉を走査することを可能にした。具体的に、イオンチャンネルは、以下：
Ｋ⁺電位依存性、Ｎａ⁺電位依存性、Ｋ⁺電位依存性、Ｃａ⁺⁺電位依存性，Ｃｌ− 、Ｎａ⁺／Ｋ⁺ＡＴＰase およびＰ−糖タンパク質を包含するが、これに限定しな
い。

【０１４５】以下の動力学的画像データ分析アルゴリズムは、フレームからフレームへ個々
の細胞(セル)を定義し、充分な細胞数に対する同時性動力学的分析によって、画
像統計学的に意義のあるデータを得ることを可能にする。該アルゴリズムの段階
を以下に示す：１．時間関数として、１個(インジケーターのみ)または２個(マーカーとインジケーター、または２つのインジケーター)またはそれ以上のデジタル化画像を獲得する。２．行ごとにファイルを開き、１)各画像から各々のカメラのオフセット値を控除し、２)その各フラット・フィールド画像ファイルにおける、対応する行の逆数を各々の画像における各行にかける。３．所望により、第１物体の画像をヒストグラムにし、背景レベルを測定する
。４．所望により、最小値および最高値を含む選択標準を設定する。これらの値
は、例えば、または背景ヒストグラムのピーク幅に対する統計学的分析によって
、または予め決めた値を使用することによって、平均背景レベル以上の計算定数
として、平均背景レベル以上の一定の倍数として設定する。５．第１物体の画像における各ピクセルと選択標準とを比較する。全制限ピク
セルは、１値とし、その他の全てを０値とし、それによって、１６−から１ビッ
トの圧縮をもたらす。６．エッジ近傍メンバーを持つ二重マスクにおける全ての１値近似ピクセルを
０に設定することによって画像のエッジを"クリーン"化する。７．下記によって、隣接する値の１ピクセルのグループとして定義された対象
に対するビットマップを検索することによって： i)線ごとのパターン(line by line pattern)おいて画像を検索し、１値のピク
セルをみいだし、 ii)iにおいて同定されたピクセルに隣接する全ての１値ピクセルを決定し、 iii)所望により、サイズを予め決定した最小および最大サイズのフィルターを
対象に適用し、 iv)この対象が許容される場合、段階８に進み、そうでなければ対象における１値ピクセルを０に変化させ、次の対象に対する探索を継続し、 v)ビットマップのエッジに到達した場合、段階９に進む。８．フィルターを通過した対象の標準値に対して：時系における各々の画像か
ら対応するピクセルを平均する。１つのインジケーターを使用する場合、強度を
記録する。比率計測インジケーターを用いる場合、１つの画像の値を、時系にお
ける各々の画像に対する別の値で割り、結果を記録する。９．全ての対象を分析した後、段階８の分析結果を各々の対象に対して描写し
た。各々の対象に対して描写された、立ち上がり時間、立下り時間および振幅を
含む動力学パラメーターは、１組の動力学的分析から、および一定時間に１組の
全対象から得た統計学的情報である。

【０１４６】本発明で使用する、イオンチャンネルに関連する一過性事例の画像処理および
分析の２つの実施例を、図１９および２０で提供する。これらのアッセイでＣａ ⁺⁺ -感受性色素、Fluo-3を使用し、細胞内Ｃａ⁺⁺濃度の変化がみられた。最初の実験で、変化はアセチルコリンレセプターの活性化で開始されるＣａ⁺⁺第２シグ
ナルによって引き起こされ、そして第２の実験で、この変化は電位作動型のＣａ ⁺⁺ チャンネルの活性化によるものであった。

【０１４７】イオンチャンネルは、近年、熱のこもった研究がなされている分野である。本
発明の先行技術を超える有利点は、下記の比較によって明らかになるであろう。

【０１４８】化合物スクリーニング適用において、技術背景部分で引用された標準の先行技
術は、米国特許第5,355,215で開示されている。細胞内Ｃａ²⁺の誘導された変化の検出に主として使用されるこの装置は、ディスペンサーを含んでおり、一過性
事例を起こす。本発明の先行技術を超える主な有利点は、下記のとおりである：
1)ウェルを全体で平均化された応答と比較した、個々の細胞応答の測定を認める
イメージングおよび分析、2)増加した感受性、必要とする試薬のより少ない添加
およびより低い照明強度、および可能なより少ないサンプル容量、および3)秒毎
の１ポイントの最大率で比較した、映像比率における画像の取得。

【０１４９】研究適用において、Tsienの組織および協力者らは、Handbook of Biological
Confocal Microscopy, J. B. Pawley,, ed.,, Plenum Press,, New York,, 1995
,, pp. 459-478で開示し、それは技術水準として役立つ。本発明を超える比率で
の画像処理の可能性の証明を有する。しかし、これは最近の関心をもたれている
サンプルでは成し遂げることはできない。先行技術は、ピクセル毎に１０²-１０ ³ を超える発蛍光団を必要とし、比較的信号対雑音比率で本発明に相当する比率に達する。さらに、本発明は、１２-または１６-ビット分解能で画像を取得でき
、４−１６×を超えるダイナミックレンジが得られる。

【０１５０】研究組織の第２の実施例は、Sun et al., J. Physiology, 509, 67-80, 1998.
で開示されている。Sunによると、データは、ピクセル積分時間毎に５マイクロセカンドを有する、６００-ピクセルライン毎の６５０Ｈｚに至るまでの比率で生じており、共焦顕微鏡をスキャンする慣習的なスポットを用いている。ほんの
１次元の“画像処理”が行なわれている。一過性を、スキャンラインに沿って横
たわる対象として観察することができる。さらに、この比率は１μsピクセル積分時間でのみ達成することができ、本発明に相当する画質が得られるまで１０²-
１０³を超える発蛍光団濃度を必要とする。

【０１５１】外部刺激の応答における細胞内イオン濃度の変化を画像処理および分析する本
発明の可能性は、化合物スクリーニングおよび一般的な生物学研究適用における
多様な適用を有している(例えば、J. Cell Biol. 137(3),633 648 (1997); J. B
iol. Chem. 271(9),, 4999-5006 (1996); Science 280,, 69-76 (1998); Bioche
m, J., 324, 645-651 (1997)参照)。多くの蛍光指示薬は、特定のイオンに対して有効に感受する(Haugland R.P. Handbook of fluorescent Probes and Resear
ch Chemicals, 6th Ed. Chaps 18, 22 and 24参照)。これらの指示薬で、Ｍｇ²⁺ 、Ｚｎ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｎａ⁺、Ｆｅ²⁺、Ｈｇ²⁺、Ｐｂ²⁺、Ｃｄ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｏ²⁺ 、Ａｌ³⁺、Ｇａ²⁺、Ｅｕ³⁺、Ｔｂ³⁺、Ｔｂ³⁺、Ｓｍ³⁺、およびＤｙ³⁺の濃度測定
ができる。さらに、Ｎａ⁺およびＫ⁺のアッセイを、他の一価のカチオンの生理学的濃度の存在下であっても行なうことができ(J. Biol. Chem. 264, 19449 (19
89)参照)、血液、脳および筋肉細胞などの様々な細胞中のＮａ⁺レベルまたはＮａ⁺流出のアッセイを含み(J. biol. Chem. 268, 18640 (1993); J. Neurosci. 1
4, 2464 (1994); Am J. Physiol. 267, H568 (1994)参照)、および精子細胞中の
K+、神経終末シナプトソームおよびリンパ球を変化させる。さらに、本発明を使
用して、リポソームおよび生存細胞での小胞中のＣｌ^-濃度をアッセイすることができる(Am. J. Physiol. 259, c375 (1990)参照)。

【０１５２】さらに、本発明を使用して、細胞および細胞下の細胞小器官中の膜電位の変化
をアッセイすることができる。膜電位中の高速画像変化の能力は、細胞および細
胞小器官の生存、神経インパルス産生、筋収縮、細胞シグナルおよびイオンチャ
ンネルゲートのアッセイに極めて重要である(Biophys J. 67,, 208 (1994); Neu
ron 13,, 1187 (1994); J. Membrane Biol. 130,1(1992)参照)。蛍光指示薬は有
用であり、神経細胞、心臓細胞および無傷の脳細胞などの刺激性細胞中の、高速
(ミリセカンド)潜在的変化に応答する(Haugland R.P. Handbook of Fluorescent
probes and Research Chemicals, 6th Ed. Chap. 25)。高速膜貫通電位変化に応答する蛍光プローブは、一般に、１００mV毎でほんの２−１０％の蛍光変化し
か示さない。細胞の形質膜は、約−７０mVの膜貫通電位を有しており、ミトコン
ドリアなどの幾つかの細胞小器官は、-１５０mVの膜貫通電位を維持する。従って、高速変化などを含むアッセイは、本発明の様々な実施態様に共通する高度な
感受性、高速データ取得能力が必要とされる。

【０１５３】ＦＲＥＴに基づく測定本発明を有利に使用して、蛍光共鳴エネルギー移送(ＦＲＥＴ)を含むアッセイ
を行なうことができる。ＦＲＥＴは１つの発蛍光団、ドナーがフォトンを吸収し
たときに起こり、そして他の発蛍光団、アクセプターに対して無放射性である吸
収エネルギーを移送する。アクセプターは、それから、特有な波長でエネルギー
を発する。ドナーおよびアクセプター分子は、有効なエネルギーの移送を実現す
るため、約10nmを下まわるほどにきわめて近接していなければならない(Metods
Enzymol. 211, 353 - 388 (1992); Methods Enzymol. 246, 300-334 (1995)参照
)。近接の必要を使用して、ドナー-アクセプター対の間の僅かな分離に対してア
ッセイ感受性を構成することができる。ＦＲＥＴは、一般に単独の励起波長およ
び２つの放出波長、そしてドナーおよびアクセプター放出強度の割合からなる分
析を必要とする。ＦＲＥＴドナーアクセプター対を、ビーズに基づくアッセイお
よび細胞に基づくアッセイの両方で構成することができる。いくつかの緑色蛍光
タンパク質(ＧＦＰ)変異体ディスプレイは蛍光を強め、そして変化した放出波長
を、１つのタンパク質に対するＧＦＰＦＲＥＴドナーと、同じタンパク質または同じ細胞内で発現する他のタンパク質の何れかに対するＧＦＰＦＲＥＴアクセプターとの融合により、ＦＲＥＴ細胞に基づくアッセイ用に対にすることがで
きる。このようなＦＲＥＴ対は、Ｃａ²⁺のＣａ²⁺-カルモジュリン結合などの分子内変化、またはレセプター二量体などの分子間相互作用の測定に使用できる。
上記の動力学イメージングアルゴリズムを、優先的に使用することができる。

【０１５４】一過性トランスフェクション画像に基づく測定の顕著な有利点には、平均値内に喪失するような、まれな事
例の検出、および対象毎の１次応答の２次応答への標準化(normalize)の、両方の機会がある。両方の特徴は、一過性トランスフェクト標的を有する株細胞を使
用するアッセイで重要であろう。遺伝子発現およびそれに続く下記のトランスフ
ェクションのタンパク質産生は、しばしば効果がなく一過性である(BioTechniqu
es 24:478-482 (1998)参照)。本発明で有利に使用することができる、トランスフェクション効率をモニタリングする方法は、当業者に知られている。例えば、
興味深い遺伝子を緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)用遺伝子と一緒にトランスフェク
トすることができ、そして２つのタンパク質が融合してまたは異なる存在として
の何れかで発現するであろう。本発明を使用して、１つの波長において存在する
指示薬の量を測定し、他の波長において標的に関連する応答を測定することがで
きる。前者のシグナルを使用して、存在する標的の量用に後者の応答を標準化す
ることができる。これは、現在利用できるスクリーニングでは不安定過ぎて使用
することができないような標的をアッセイし、僅か数パーセントのトランスフェ
クション効率をモニターすることを、本発明に可能にする。上記の動力学イメー
ジングアルゴリズムを使用して、このようなデータを分析することができ、ここ
でただ１つの画像フレームのみが必要である。ほんの数パーセントの細胞のみが
感染するとしても、ウイルス性タンパク質の発現を通して直接的に、または新た
な表現型の取得により間接的にの何れかで、細胞のウイルス性感染をモニターす
ることができる。結局、本発明は、まれな事例の検出用の方法を提供する：多様
なcＤＮＡのライブラリーを用いる細胞集団全体のトランスフェクションの結果としての特定のcＤＮＡのトランスフェクションによる、個々の細胞または細胞グループによる、新たな表現型の取得などである。

【０１５５】酵素アッセイ本発明を使用して、酵素活性の遺伝子アッセイを処置することができる。細胞
内酵素の例として、限定する意図ではないが以下が含まれる：脱炭酸酵素、グア
ニンヌクレオチド-結合タンパク質(Ｇタンパク質)、アデニルシクラーゼ、カルモジュリン、ＰＩ、ＰＩＰおよびＰＩＰ2キナーゼ、cＡＭＰキナーゼおよびcＡＭＰヒドラーゼ、チトクロムP-450、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ、チ
ロシンタンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、β-ラクタマーゼ、β-
ガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホジエステラーゼ、カスパ
ーゼ(caspases)、プロテオサム(proteosome)プロテアーゼ、一酸化窒素シンター
ゼ、チミジンキナーゼ、ヌクレオシドデアミナーゼ、グルタチオン-Ｓ-トランス
フェラーゼ、リポオキシゲナーゼ、およびホスホリパーゼ。

【０１５６】図１７(a)−１７(d)は、本発明による酵素アッセイの第一の実施態様のステッ
プを示す。図１７(a)で、ビーズに付着した既知量の蛍光-標識ペプチド３１２を
有するビーズ３１０を、液体３３０を含むウェル３２０に加える。ビーズ３１０
はウェルの底に沈むほどの密度を有する。図１７(b)で、試験化合物３１４をウェルに加える。図１７(c)で、酵素３１６をウェルに加える。図１７(a)、１７(b
)および１７(c)で示すステップの順番は、ウェルが試験化合物がないときにペプ
チドおよび酵素を同時に含んではならないということを除けば、どう変えてもよ
い。抑制されていないときは、酵素３１６はペプチド３１２を切断し、蛍光標識
は液体中へ拡散するであろう。また、他方では、試験化合物３１４は、一般に、
酵素活性部位のブロッキングにより酵素３１６を抑制し、酵素３１６は蛍光標識
を切断しないであろう。図１７(d)で、なおビーズに付着している蛍光標識は、例えば、要素３４０として概略して示されたラインスキャン共焦顕微鏡を使用し
て画像処理される。この画像から、試験化合物３１４の活性を測定することがで
きる。

【０１５７】図１７(a)−１７(d)で示されるアッセイの他の実施態様で、試験化合物の活性
を、図１７(d)で得られた画像と、図１７(a)または１７(b)の蛍光標識の蛍光のイメージングで得られた画像または対照ウェルの画像との比較によって、測定す
ることができる。

【０１５８】図１８(a)−１８(d)は、本発明による酵素アッセイの、第２の実施態様のステ
ップを示す。図１８(a)で、既知量の蛍光標識ペプチド３５２をウェル３６０の底３６２に付着させる。図１８(b)で、試験化合物３５４をウェルに加える。図
１８(c)で、酵素３５６をウェルに加える。図１８(d)で、なおウェルの底に付着
している蛍光標識を、例えば、要素３８０として概略して示されたラインスキャ
ン共焦顕微鏡を使用して画像処理し、化合物３５４の活性を測定する。

【０１５９】図１８(a)−１８(d)で示されるアッセイの他の実施態様で、試験化合物の活性
を、図１８(d)で得られる画像と、図１８(a)または１８(b)の蛍光標識の蛍光のイメージングにより得られた画像または対照ウェルの画像との比較によって測定
することができる。

【０１６０】本発明によって行なうことができるアッセイの他の実施例は、チロシンキナー
ゼアッセイである。チロシンキナーゼは、基質ペプチドのチロシン残基をリン酸
化する。基質ペプチドは、チロシン残基および蛍光タグの両方を有している。こ
のアッセイで、抗体は、一方の末端でリン酸化チロシン選択的であり、他の末端
でビーズなどの表面またはウェルの底に結合している。チロシンキナーゼおよび
チロシン残基を有する蛍光タグペプチドをウェルに加える。チロシンキナーゼが
ペプチドをリン酸化すると、リン酸化チロシンは抗体に結合し、その結果、抗体
が付着した表面上に蛍光タグが局在化することになる。チロシンキナーゼがペプ
チドをリン酸化しないときは、ペプチド上の蛍光タグはウェル中に拡散するであ
ろう。ペプチドのリン酸化の範囲を、表面に近接した蛍光の測定によって測定す
ることができる。このようなアッセイを、蛍光基質上の酵素の活動によって産出
される蛍光産物に特異的である抗体を使用しても処理することができる。

【０１６１】さらに、生存細胞酵素アッセイを本発明によって行なうことができる。生存細
胞で酵素活性を調査するためのたくさんの技術が、酵素によって影響される蛍光
産物を生ずる基質として(Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and
Research Chemical 6th Ed. Chap. 10参照)、当分野で知られている(Biochem. H
istochem 70, 243 (1995), J. Fluorescence 3, 119 (1993)参照)。一般的に、これらのアッセイは無抵抗に細胞に入るプローブを使用し、そして、続いて細胞
内酵素によって進行し、細胞内に残留する産物を生成する。他の基質は、酵素活
性部位で沈殿する不溶性蛍光産物が生ずる。本発明は酵素活性の度合いをアッセ
イすることができ、そしてプローブ等を使用する酵素活性の正確な空間的な局部
制限を測定することができる。プローブは、限定する意図ではないがホスファタ
ーゼ、ＡＴＰases、５'-ヌクレオチダーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、
ペプチダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼおよびペルオキシダーゼなど、本発
明で使用する広く様々な酵素のアッセイで有用である。酵素活性アッセイを1番目のまたは２番目のいずれかの実験態様によって行なうことができ、そして上記の画像分析プロトコルに関連する。

【０１６２】形態学本発明の方法を使用して、細胞または細胞下の形態学(限定する意図ではないが軸策および細胞小器官が含まれる)の測定を必要とするアッセイを行なうこともできる。このようなアッセイを行うために、蛍光プローブを、細胞または細胞
小器官などに、マイクロインジェクションで直接的に、または細胞透過性であっ
て、代謝または他の態様で変化して関心ある構造中で保持される試薬と細胞を接
触させることによって、関心ある構造中に導入する。これらを生存細胞と共に使
用するとき、蛍光標識は非毒性および生物学的に不活性でなければならない。多
くの適切な色素はアッセイ用として市販されており(Haugland R.P. Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals 6th Ed. Chap. 15参照)、例えば
、キャピラリーフロー(flow in capillaries)、神経細胞結合性、ギャップ結合を通った色素の転位置、細胞分裂および細胞溶解、およびリポソーム融合が含ま
れる。さらに、これらのトレーサーを使用して、培地中の標識細胞、組織または
無処置の生物の運動を追うことができる。蛍光トレーサーを用いて細胞または細
胞下の形態学または運動をアッセイするたくさんの技術は、当分野で知られてお
り、そして膜トレーサー、ビオチン標識デキストランコンジュゲーター、蛍光微
粒子、またはタンパク質およびタンパク質コンジュゲートの使用を含む(Meth. C
ell Biol. 29, 153 (1989); Cytometry 21. 230 (1995); Cell 84, 381 (1996);
Biochem. Biophys. Acta 988, 319 (1989); Cytometry 14, 747 (1993)参照)。
本発明の様々な実施例は、アッセイのタイプで使用されるとき、顕著な有利点を
有する。本発明は、非常にすばらしい空間的分解能で、多様なパラメータの迅速
イメージングをすることができる。

【０１６３】核酸本発明を使用して、核酸アッセイを処理することができる。本発明の空間的分
解能および多波長イメージング能力から得ることができる特定のＤＮＡアッセイ
は、蛍光自然位ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)である。ＦＩＳＨは、細胞、
組織、間期核および分裂中期染色体中の特定の核酸配列の相関的存在量の局在化
および測定用として、重要な技術であり、臨床診断および遺伝子マッピングで使
用されている (Histo-chem J. 27, 4 (1995); Science 247, 64 (1990); Trends
Genet. 9, 71 (1993)およびScience 250,, 559 (1990)参照)。様々な蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、多色蛍光ＤＮＡおよびＲＮＡハイブリダイゼー
ション技術に有用である(Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and
Research Chemicals, 6th Ed. Chap. 8.4 参照)。付加的な技術は、核酸カウン
ター染色を用いたＡＴまたはＧＣ選択的ＤＮＡ-色素を使用して、染色体結合を測定する。この技術は核型分析および染色体構造研究で広く使用されている(Hum
an Genet. 57,1 (1981)参照)。

【０１６４】反応性酸素種本発明を使用して、一重項酸素、超酸化物および一酸化窒素などの様々な反応
性酸素種のレベルをアッセイすることもできる。これらの反応性酸素種の重要性
は、ごく最近明らかになってきている(Biochem Phamiacol 47,373 (1994), J. C
ell Biol. 126, 901 (1994)参照)。一重項酸素は、反応性酸素種によって引き起
こされる多くの生理学的損傷の原因であることが、現在分かっている(J. Photoc
hem. Photobiol. 11,,241(1991)参照)。特に一酸化窒素(ＮＯ)は、神経伝達およ
び血圧調節を含む様々な生理学的プロセスで、分子メディエーターとして重大な
役割を果たすことが、現在分かっている(Current Biology 2,437 (1995), J. Me
d. Chem. 38,4343 (1995), Cell 78, 919 (1994)参照)。ＮＯを間接的に測定するアッセイを行なう技術は、当分野で知られている。例えばＮＯは生理学的状態
下でニトリルに酸化され、そしてこれは、５４８nmでの吸収のモニタリングまた
はニトリルと反応するプローブの使用によって検出でき、同定可能な蛍光産物を
形成する(Haugland R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Che
micals 6th Ed. Chap. 21参照)。

【０１６５】ｐＨ本発明を使用して、細胞または細胞を含まない培地中のｐＨ変化測定を含むア
ッセイを行なうことができる。細胞内ｐＨの役割の重要性は、細胞増殖、アポト
ーシス、受精、悪性腫瘍、多剤耐性、イオン輸送、リソソーム貯蔵障害およびア
ルツハイマー病を含む、多くの多様な生理学的および病理学的プロセスで認めら
れている(Cell Physiol. Biochem. 2, 159 (1992); J. Biol. Chem. 270, 6235
(1995); Biophys. J. 68, 739 (1995); J. Biol. Chem. 270,, 19599 (1995); C
ancer Res 54,, 5670 (1994)参照)。生理学的範囲のｐＨアッセイで有用な蛍光プローブは、市販されている(Haugland R.P., Handbook of Fluorescent Probes
and Research Chemicals 6th Ed. Chap. 23参照)。

【０１６６】実施例本明細書で記述および権利主張している本発明は、下記実施例を参照すること
により、当業者にさらに認識され得るであろう。これらの実施例は、単に発明の
それぞれの特徴を説明するために提供されるにすぎず、決して発明を限定するよ
うに解釈してはならない。

【０１６７】転写因子転位置細胞を９６-ウェルプレートで培養し、固定し、テキサスレッド標識抗体(Texa
s-Red-labeled antibody)とともに転写因子タンパク質にインキュベートし、すすぎ、それから緩衝液中の５μＭヘキスト(Hoechst)33342で染色した。

【０１６８】画像を、１.０８×１.０８μm²ピクセレーションの０.５×０.５mm² 平方で検
分した。テキサスレッド放出を５６８nmで励起し、６００nm長通過フィルター(l
ong pass filter)で検出した。ヘキスト放出を３６４nmで励起し、４２０-４８０nm帯域フィルターを用いて検出した。画像取得時間は０.９秒であった。画像毎に〜１５０細胞がある。

【０１６９】固定化前に活性化されていない細胞の範囲の画像を取得した。核中のテキサス
レッド強度は、細胞質と比較して低い。テキサスレッド標識抗体およびヘキスト
33342で染色された細胞の画像の複合物が生成した。

【０１７０】固定化前に染色した細胞の範囲の画像を取得した。カラースケーリングのため
、細胞質を核の染色なしでみることは困難である。テキサスレッド標識抗体およ
びヘキスト33342で染色された細胞の画像の複合物が生成した。

【０１７１】データ分析を下記方法に従って行なった。ヘキスト画像の二成分の表示を、適
切な感度限界の適用によって生成し、感度限界より大きい値を１とし、感度限界
以下を０とした。これを１次マスクとした。それから、１次マスクを侵食(erode
)して、ひとつを１次マスクを拡張してもうひとつを得ることによって２つの娘マスクをつくり、最初のマスクを引いて、環状(annular)マスクを形成した。テキサスレッド放出画像を侵食二成分マスクで掛けて、核中の標識転写因子の量の
測定としてピクセルを総計した。同様に、テキサスレッド放出画像を環状二成分
マスクで掛けて、そして細胞質中の標識転写因子の量の測定としてピクセルを総
計した。活性化の度合いを核の細胞質強度に対する比率で評価した。

【０１７２】ムスカリン様受容体および電位依存性チャンネル刺激の遷移Ｃａ画像図１９および２０における細胞は、神経芽細胞腫系からのものである。該細胞
を増殖させ、標準媒体中で画像化した。これらの細胞は、第２シグナルとして大
量の細胞内Ｃａ放出を生じるカルバコールによって刺激され得るムスカリン様ア
セチルコリン受容体を発現した。さらに、該細胞は、外部Ｋ⁺濃度の大きな変化による細胞膜の脱分極によって刺激され、かつベラパミルによって抑制され得る
電位依存性“Ｌ”Ｃａチャンネルを発現した。

【０１７３】一般には、画像シーケンスを、９６ウェルプレートにおける増殖培地(１００ μＬ)における細胞へ増殖培地中の試薬(１００μＬ)を急速に添加することによって開始した。添加体積により生じる乱れは、細胞形態における若干の歪みを生
み出す。この歪みは、添加後の最初の画像フレームにおいて、各々の細胞に与え
られたＣａ蛍光の一過性の変化として見ることができる。

【０１７４】図１９は、フレーム間の１.２秒の動きを示す。この画像シーケンスは、カルバコール(１００μＭ)の急速な添加によって開始する。最終画像は、同定するた
めに使用した２元マスクであって、画像中の蛍光対象物を列挙し、注入前のフレ
ームから発生させる。注入前の画像がはっきりしていなくても明白である。マス
クをこの物質における各画像に適用し、図２５ａに示したように、各々の対象に
対して、注入画像を標準化した集積強度を時間に対してプロットした。該マスク
は、重層する(オーバーラップ)細胞に対しては行わなかった。例えば、対象１は
、１つ以上の細胞になりやすいが、応答しない。対象７は、遅延を示すものに関
して、２つの重層細胞であってもよい。

【０１７５】図２０a-hは、電位依存性“Ｌ”チャンネルを開かせる５０ｍＭＫＣｌの添加
によって突然開始される脱分極への神経芽細胞腫細胞の応答を示す映像のフレー
ムを選択した。分析方法は、上記のような図２５ａに関連したものであった。こ
の結果を図２５ｂに示した。“画像平均”よりもむしろ“細胞平均”を用いて得
られる感受性の増加を示した。

【０１７６】生存細胞のＧプロテイン共役受容体結合図２１a-cから図２２a-cに示した画像は、９６ウェルプレート中の生存細胞に
対して得られたものである。該細胞を、天然ペプチドリガンドと知られているＧ
プロテイン共役受容体とトランスフェクションした。画像処理の前に、該細胞を
、１０％の血清を含む通常の増殖培地中にある本来の標識していないリガンドと
、３７℃、２０分間インキュベートし、続いて２０ｎＭ蛍光標識リガンドおよび
１００ｎＭＬＤＳ７５１を用いて３０分、３７℃でインキュベートした。

【０１７７】 (０.５×０.５)ｍｍ²であるこれらの画像は、(1.０８×1.０８)μｍ²ピクセレ
ーションを有する。蛍光性の発光(放射)を、４８８ｎｍで励起させ、５３５ｎｍ
を中心とした４５ｎｍの帯域フィルターを用いて検出した。また、ＬＤＳ７５１
の発光を４８８ｎｍで励起させ、６９０ｎｍを中心とした４０ｎｍの帯域フィル
ターを用いて検出した。画像捕捉時間は０.９秒であった。これらの細胞は、〜1
00,000受容体／細胞、または約２５受容体／膜表面μｍ²であった。

【０１７８】図２１ａは、標識リガンドとのインキュベーションした後の細胞の画像である
。洗浄工程を画像化前には全く行わない。受信(受像)活性のかなりの変化は明白
である。幾つかの細胞は、リガンドが少ないので、それらは背景の低下(くぼみ)
として出現する。結合活性の細胞ごとの分析を、図２１ｂに示されているように
、非特異的核酸染色であるＬＤＳ７５１の発光の画像からマスクを行うことによ
って容易にした。染色は完全に均一にされないが、細胞体積の大部分を開示する
。受容体結合画像と図２１ｂにおける閾値データから生じた２元マスクの図２５
ｃにおける重層は、受容体活性の擬似カラーマップを与えた。高い活性を黄色と
して示し、一方低い活性をオレンジ−赤として示した。

【０１７９】図２２における３つの画像は、２０ｎｍの標識リガンドと非標識リガンドとの
滴定曲線上の点に対応する画像を示す。該曲線を、図２２ａに示した。非標識リ
ガンドに対してＡＫ_i＝３±１×１０¹⁰Ｍが計算された。

【０１８０】異なる哺乳動物細胞系に対する受容体結合を示す画像を図２３a-dに示した。図２３aは、２５６ｎＭＣｙ３標識リガンドとインキュベーションした細胞の画
像である。結合活性の範囲をみることができる。図２３ｂは、１μＭヘキスト33
342染色核酸の同時に得られた画像とＣｙ３データの重層を示す。後者は、各々の細胞を確実に同定するものとして機能した。図２３ｃにおいて、この画像は、
１０μＭの非標識リガンド存在下に、２５６ｎＭＣｙ３標識リガンドとインキュ
ベーションした細胞の画像であり、図２３ｄにおいて、該データは、重層した１
μＭヘキスト33342画像染色核酸を示したものである。非標識細胞による置換液体の影響は、図２３ｃにおいて明らかである。図２３ｃおよびｄとの高い相関関
係において、その除外体積によって細胞を同定する有効性を例証した。

【０１８１】模造ビーズを基部にした受容体結合図２４a−ｄにおいて、Ｃｙ５標識シリカビーズの画像を示す。この実験は、蛍光標識リガンドが微少球体上に支持された膜結合受容体と結合する受容体結合
アッセイのシュミレーションである。

【０１８２】直径４μｍシリカの微少球体は、ポリエチレンイミンで被覆し、ビオチンＮＨ
Ｓ−エステルによってビオチン化した。このビーズの活性を、既知のビーズ量の
吸収によって、溶液から除去したＣｙ５標識ストレプトアビジンの量を計量して
蛍光計を用いて評価した。各々のビーズは、１．３×１０⁶のストレプトアビジン分子を保持することがわかった。ビーズは、Ｃｙ５標識ストレプトアビジンお
よび非標識ストレプトアビジンの適当な割合で予め混合し、ビーズとインキュベ
ーションすることによってＣｙ５分子の既知量を有した。付加物は、０．１６、
１．６および１６ｆｍｏｌ/２００μｇのポリスチレンビーズと等しい。各ビーズは、各々平均して１７、１７０または１７００の標識物を有した。試料を画像
化のためにCostar ９６-ウェルプレートにおいた。Ｃｙ５を、６４７ｎｍレー支
照射によって励起させ、発光した蛍光を、６９０ｎｍで集めた４０ｎｍの帯域フ
ィルターによって検出した。スキャンした画像は、約０．７秒で、１μｍピクセ
レーションで得られた。

【０１８３】１７０および１７００分子を有するビーズは容易に検出することができ、１７
−蛍光ビーズは、図２４を構成する画像において識別することができた。非標識
ストレプトアビジンのみを有するビーズは、評価し得る強度を生じなかった。

【図面の簡単な説明】

本発明の、これらおよび他の物体、特徴および利点は、以下の詳細な説明から
容易に明らかとなる。

【図１(ａ)-１(ｆ)】図１(ａ)-１(ｆ)は、第一のレセプター結合ＳＳＡを
示す。

【図２(ａ)-２(ｆ)】図２(ａ)-２(ｆ)は、第二のレセプター結合ＳＳＡを
示す。

【図３(ａ)-３(ｄ)】図３(ａ)-３(ｄ)は、第一の酵素ＳＳＡを示す。

【図４(ａ)-４(ｄ)】図４(ａ)-４(ｄ)は、第二の酵素ＳＳＡを示す。

【図５(ａ)および５(ｂ)】図５(ａ)および５(ｂ)は、ウェルの底上に位置
するサンプルをイメージ化するための従来技術の装置の概要図である。

【図６】図６は、本発明のサンプルのイメージに使用するライン−スキャ
ン共焦点顕微鏡の第一の実施態様の概要図である。

【図７】図７は、従来技術の顕微鏡の概要図である。

【図８(ａ)および８(ｂ)】図８(ａ)および８(ｂ)は、それぞれ、スキャン
ニングモニターを伴わない、本発明の多色刷り実施態様の光線路の平面図および
側面図である。

【図８(ｃ)】図８(ｃ)は、単一ビーム自動焦点の光線路の平面図である。

【図９(ａ)および９(ｂ)】図９(ａ)および９(ｂ)は、それぞれ、スキャン
ニングモニターを伴う、本発明の多色刷り実施態様の光線路の平面図および側面
図である。

【図９(ｃ)】図９(ｃ)は、単一ビーム自動焦点の光線路の平面図である。

【図１０】図１０は、２つのビーム自動焦点システムの側面図である。

【図１１(ａ)-１１(ｃ)】図１１(ａ)-１１(ｃ)は、直交座標表示ＣＣＤカ
メラおよびリードアウトレジスターを示す。

【図１２(ａ)および１２(ｂ)】図１２(ａ)および１２(ｂ)は、通常の暗視
野イメージ化を用いる本発明のライン−スキャン共焦点顕微鏡により形成される
光線路の断面図である。

【図１３(ａ)および１３(ｂ)】図１３(ａ)および１３(ｂ)は、逆暗視野イ
メージ化を用いる本発明のライン−スキャン共焦点顕微鏡により形成される光線
路の断面図である。

【図１４】図１４は、逆の暗-フィールドイメージ化を用いる本発明のライン−スキャン共焦点顕微鏡により形成される光線路の断面図であって、サンプ
ル面の回折制限領域よりも大きな領域を示している。

【図１５(ａ)-１５(ｆ)】図１５(ａ)-１５(ｆ)は、本発明によるレセプタ
ー結合アッセイの第一の実施態様を示す。

【図１６(ａ)-１６(ｆ)】図１６(ａ)-１６(ｆ)は、本発明によるレセプタ
ー結合アッセイの第二の実施態様を示す。

【図１７(ａ)-１７(ｄ)】図１７(ａ)-１７(ｄ)は、本発明による酵素アッ
セイの第一の実施態様を示す。

【図１８(ａ)-１８(ｄ)】図１８(ａ)-１８(ｄ)は、本発明による酵素アッ
セイの第二の実施態様を示す。

【図１９(ａ)-１９(ｐ)】図１９(ａ)-１９(ｐ)は、カルバコールに対する
神経芽細胞のカルシウム応答を示す。注入前の時間、０、１．２、２．４、３．
６、４．８、６．０、７．２、８．４、９．６、１０．８、１２．０、１３．２
、１４．４、１５．６秒における応答は見られない(すなわち、それぞれ、図１９(ａ)-(ｏ))

【図２０(ａ)-２０(ｈ)】図２０(ａ)-２０(ｈ)は、５０ｍＭＫＣｌに対する神経芽細胞のカルシウム応答を示す。０、０．６、３．０、５．４、７．８
、１０．２、１２．６および１５．０秒における応答が見られる(すなわち、それぞれ、図２０(ａ)-(ｈ))。

【図２１(ａ)-２１(ｃ)】図２１(ａ)-２１(ｃ)は、均質性生存細胞レセプ
ター結合アッセイを示す。図２１(ａ)は、蛍光標識したペプチドリガンドで染色
した細胞を示す。図２１(ｂ)は、ＬＤＳ７５１で染色した細胞質から生ずるマス
クを示す。図２１(ｃ)は、図２１(ａ)および(ｂ)のオバーレイであり、それらは
、種々のレセプター活性を示す。

【図２２(ａ)-２２(ｄ)】図２２(ａ)-２２(ｄ)は、均質性生存細胞レセプ
ター結合アッセイを示す。図２２(ａ)は、細胞表面レセプターに対する標識およ
び非標識リガンドの競合的結合を描写する。図２２(ｂ)-(ｄ)は、グラフにおいて指した点での免疫蛍光のイメージを示す。

【図２３(ａ)-２３(ｄ)】図２３(ａ)-２３(ｄ)は、Ｃｙ３標識化リガンド
による均質性生存細胞レセプター結合アッセイを示す。

【図２４(ａ)-２４(ｄ)】図２４(ａ)-２４(ｄ)は、種々のＣｙ５標識によ
る４μｍ直径シリカビーズを示す。図２４(ａ)は、標識されていないビーズのイ
メージを示す。図２４(ｂ)-(ｄ)は、それぞれ、ビーズあたりの平均が１７、１７０または１７００のＣｙ５標識化分子であるビーズのイメージを示す。図２４
(ｄ)に示すイメージは、図２４(ａ)-(ｃ)のイメージと比べて１０倍小さいスケールである。

【図２５(ａ)-２５(ｃ)】図２５(ａ)-２５(ｃ)は、イオンチャンネルアッ
セイのデータをグラフとして示す。図２５(ａ)は、カルバコールの添加に対する
神経芽細胞による応答に関連する。図２５(ｂ)-(ｃ)は、５０ｍＭＫＣｌの添加
に対する神経芽細胞によるカルシウム応答に関連する。この場合、開口４３２は
図の平面上にあり、レンズ４４０は対物レンズ４７０の後焦点面４６０上に開口
４３２により形成された照明ストライプを中継し、これは図６の平面に垂直の対
象平面におけるライン４８４に変換する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リチャード・エル・ハンセンアメリカ合衆国08534ニュージャージー州ペニントン、サーチ・アベニュー114番 (72)発明者ウィリアム・カーシュアメリカ合衆国08536ニュージャージー州プレインズボロー、フォックス・ラン・ドライブ22−06番 (72)発明者ニール・エイ・ニクラウスアメリカ合衆国08520ニュージャージー州イースト・ウィンザー、ウィンザー−ペリンビル・ロード865番Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 DA02 DA06 EA01 FA02 FA03 GA02 GA07 GB18 GB19 HA01 HA02 HA09 HA15 KA09 LA03 MA01 NA05 2G045 AA25 AA28 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DB03 FA16 FA34 FA36 FB01 FB02 FB03 HA14 2H052 AA08 AA09 AB24 AC04 AC05 AC06 AC15 AC27 AD09 AF14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ)それに沿って放射が伝搬される、光軸に横向きに伸びる電磁放射の伸長したビームを形成する手段；ｂ)対象が位置する第１平面における第１伸長した領域に伸長したビームを向け、集束させる手段、および対象から放射される電磁放射を１個またはそれ以上の
伸長した第２領域に向ける手段であり、各第２伸長した領域は第１平面に接合し
た異なる第２平面上である；ｃ)第２接合面の最後の一つにおいて、または少なくとも一つの第２接合平面に接合した第３平面において、対象から放射される電磁放射が一致する検出エレメ
ントの方形アレイを含む検出デバイス；そしてｄ)放射された電磁放射が検出エレメントの方形アレイに送達され、検出デバイスにより放射された電磁放射を走査と同調して示す多くの電子シグナルに変換さ
れるように、対象に対して伸長したビームを動かすことにより、または対象を伸
長したビームに対して動かすことにより対象を走査する手段：を含む、共焦点イメージングシステム。
【請求項２】更にａ)第２伸長した領域と整列した長軸を有する伸長した空間フィルター；およびｂ)検出デバイス上に、第２接合平面のイメージを形成する手段：を含む、請求項１記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項３】対象に向かう電磁放射の伸長されたビームが２個またはそれ
以上の波長を含む、請求項１記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項４】空間フィルターが可変幅を有する、請求項２記載の共焦点イ
メージングシステム。
【請求項５】検出デバイスがｍ×ｎアレイを含み、ｍがアレイの第１次元
の検出エレメントの数であり、ｎが第２次元の検出エレメントの数であり、ｎが
ｍより大きいものである、請求項１記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項６】放射された電磁放射が向けられる伸長された領域が、検出デ
バイスのアレイと整列した長軸を有し、長軸が第２次元と同じ方向に伸びる、請
求項５記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項７】アレイの第１次元に伸びるカラムを形成する少なくとも２つ
のディテクターが一緒に収納されている、請求項５記載の共焦点イメージングシ
ステム。
【請求項８】アレイの多くのディテクターエレメントが一緒に収納されて
いる、請求項５記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項９】検出デバイスがＣＣＤアレイである、請求項５記載の共焦点
イメージングシステム。
【請求項１０】検出デバイスが方形形態ＣＣＤアレイである、請求項１記
載の共焦点イメージングシステム。
【請求項１１】対象から放射される放射が蛍光放射である、請求項１記載
の共焦点イメージングシステム。
【請求項１２】不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を有する支持体の
不連続表面に対象が位置し、ａ)第１波長を有する電磁放射の第１集束ビーム、ここで第１ビームは対物レンズを通して不連続表面に向かい、対物レンズを通して該不連続表面により反射さ
れて戻る；ｂ)第２波長を有する電磁放射の第２集束ビーム、ここで第２ビームは対物レンズを通して連続表面に向かい、対物レンズを通して該連続表面により反射されて
戻る；ｃ)対物レンズに反射して戻ってきた第１波長の放射を第２波長から分ける手段；ｄ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた第１集束ビームの検出のための第１ディテクター；ｅ)対物レンズを通して連続表面から戻ってきた第２集束ビームの検出のための第２ディテクター；ｆ)対物レンズを表面に対して、または表面を対物レンズに対して移動させる移動手段；そしてｇ)第１および第２ディテクターおよび移動手段に接続したコントローラーであり、コントローラーは支持体上の第１集束ビームまたは第２集束ビームの位置に
したがって、移動手段を操作する：を含む焦点システムを更に含む、請求項１記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項１３】走査手段が対象を通して伸長したビームを移動させるため
の回転光学手段を含む、請求項１記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項１４】走査手段が対象が位置する移動可能ステージを含む、請求
項１記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項１５】更に試薬を対象が位置する第１平面に分配する手段を含む
、請求項１記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項１６】更に対象の温度を制御する手段を含む、請求項１記載の共
焦点イメージングシステム。
【請求項１７】対象上に向かう電磁放射の伸長したビームが１個またはそ
れ以上の波長を含み、第２平面が一つである、請求項２記載の共焦点イメージン
グシステム。
【請求項１８】電磁放射の２個またはそれ以上の波長が第１平面の第１伸
長領域の対象から放射され、更に放射波長を分離し１個またはそれ以上の検出デ
バイスにより少なくとも１個の分離した波長が検出される、請求項１、３または
１７のいずれかに記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項１９】不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を有する支持体の
不連続表面に対象が位置し、ａ)第１波長を有する電磁放射の第１集束ビーム、ここで第１ビームは対物レンズを通して不連続表面に向かい、対物レンズを通して該不連続表面により反射さ
れて戻る；ｂ)第２波長を有する電磁放射の第２集束ビーム、ここで第２ビームは対物レンズを通して連続表面に向かい、対物レンズを通して該連続表面により反射されて
戻る；ｃ)対物レンズを表面に対して、または表面を対物レンズに対して移動させる移動手段；そしてｄ)焦点ディテクターおよび移動手段に接続したコントローラー、ここでコントローラーは支持体上の集束ビームの位置にしたがって焦点ディテクターからのシ
グナルに反応して移動手段を調節する：を含む焦点システムを更に含む、請求項１記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項２０】第１および第２波長が同じである、請求項１２記載の共焦
点イメージングシステム。
【請求項２１】コントローラーがコンピューターを含む、請求項１２また
は１９のいずれかに記載の共焦点イメージングシステム。
【請求項２２】支持体がマイクロタイタープレートであり、不連続表面が
マイクロタイタープレートの底である、請求項１２または１９のいずれかに記載
の共焦点イメージングシステム。
【請求項２３】不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を有する支持体の
不連続表面に対象が位置し、２個またはそれ以上の電磁放射の波長が対象から放
出され、ａ)第１波長を有する電磁放射の第１集束ビーム、ここで第１ビームは対物レンズを通して不連続表面に向かい、対物レンズを通して該不連続表面により反射さ
れて戻る；ｂ)第２波長を有する電磁放射の第２集束ビーム、ここで第２ビームは対物レンズを通して連続表面に向かい、対物レンズを通して該連続表面により反射されて
戻る；ｃ)対物レンズに反射して戻ってきた第１波長の放射を第２波長から分ける手段；ｄ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた第１集束ビームの検出のための第１ディテクター；ｅ)対物レンズを通して連続表面から戻ってきた第２集束ビームの検出のための第２ディテクター；ｆ)対物レンズを表面に対して、または表面を対物レンズに対して移動させる移動手段；そしてｇ)第１および第２ディテクターおよび移動手段に接続したコントローラーであり、コントローラーは支持体上の第１集束ビームまたは第２集束ビームの位置に
したがって、第１ディテクターまたは第２ディテクターからのシグナルに反応し
て移動手段を操作する：を含む焦点システムを更に含む、請求項１８記載の共焦点イメージングシステム
。
【請求項２４】不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を有する支持体
の不連続表面に対象が位置し、２個またはそれ以上の電磁放射の波長が対象から
放出され、ａ)第１波長を有する電磁放射の第１集束ビーム、ここで第１ビームは対物レンズを通して不連続表面に向かい、対物レンズを通して該不連続表面により反射さ
れて戻る；ｂ)第２波長を有する電磁放射の第２集束ビーム、ここで第２ビームは対物レンズを通して連続表面に向かい、対物レンズを通して該連続表面により反射されて
戻る；ｃ)対物レンズを表面に対して、または表面を対物レンズに対して移動させる移動手段；そしてｄ)焦点ディテクターおよび移動手段に接続したコントローラー、ここでコントローラーは支持体上の集束ビームの位置にしたがって焦点ディテクターからのシ
グナルに反応して移動手段を調節する：を含む焦点システムを更に含む、請求項１８記載の共焦点イメージングシステム
。
【請求項２５】ａ)不連続表面または不連続表面上に位置する対象に集束すべき電磁放射の第１ビームを方向付けする対物レンズ；ｂ)第１波長を有する電磁放射の第２ビーム、ここで第２ビームは該対物レンズを通って不連続表面に集束し、該不連続表面により反射して対物レンズを通して
戻る；ｃ)第２波長を有する電磁放射の第３ビーム、ここで第３ビームは該対物レンズを通って連続表面に集束し、該連続表面により反射して対物レンズを通して戻る
；ｄ)対物レンズを通して反射して戻ってきた第１波長の放射を第２波長の放射と分ける手段；ｅ)対物レンズを通して不連続表面により反射された第２ビームの検出のための第１ディテクター；ｆ)対物レンズを通して連続表面により反射された第３ビームの検出のための第２ディテクター；ｇ)対物レンズを支持体に対して、または指示体を対物レンズに対して移動し、対物レンズを通して反射して戻るビームの焦点をコントロールする移動手段；そ
してｈ)第１および第２ディテクターおよび移動手段に接続したコントローラーであり、コントローラーは支持体上の第１集束ビームまたは第２集束ビームの位置に
したがって、第１ディテクターまたは第２ディテクターからのシグナルに反応し
て移動手段を操作する：を含む、不連続表面および不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を含む支持体
と共に使用する、集束システム。
【請求項２６】ａ)不連続表面または不連続表面上に位置する対象に集束すべき電磁放射の第１ビームを方向付けする対物レンズ；ｂ)対物レンズを通って不連続表面に方向付けされ、該不連続表面により反射して対物レンズを通して戻る電磁放射の集束ビーム；ｃ)対物レンズを通して反射して戻ってきた集束ビームの検出のための焦点ディテクター；ｄ)対物レンズを支持体に対して、または指示体を対物レンズに対して移動し、対物レンズを通して反射して戻るビームの焦点をコントロールする移動手段；そ
してｅ)焦点ディテクターおよび移動手段に接続したコントローラーであり、コントローラーは支持体上の集束ビームの位置にしたがって、焦点ディテクターからの
シグナルに反応して移動手段を操作する：を含む、不連続表面および不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を含む支持体
と共に使用する、集束システム。
【請求項２７】第１および第２波長が同じである、請求項２５記載の集束
システム。
【請求項２８】コントローラーがコンピューターを含む、請求項２５また
は２６のいずれかに記載の集束システム。
【請求項２９】支持体がマイクロタイタープレートであり、不連続表面が
マイクロタイタープレートの底である、請求項２５または２６のいずれかに記載
の集束システム。
【請求項３０】生物学的アッセイにおける対象から放射される電磁放射を
請求項１記載の共焦点イメージングシステムを使用して測定する段階を含む、生
物学的アッセイのモニター法。
【請求項３１】生物学的アッセイにおける対象から放射される電磁放射を
請求項２５または２６のいずれかに記載の焦点システムを備えた顕微鏡を使用し
て測定する段階を含む、生物学的アッセイのモニター法。
【請求項３２】生物学的アッセイにおける対象から放射される電磁放射を
請求項１２または１９のいずれかに記載の共焦点イメージングシステムを使用し
て測定する段階を含む、生物学的アッセイのモニター法。
【請求項３３】生物学的アッセイがトランスフェクション効率アッセイ、
感染アッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、タンパク質移動アッセイ、タンパク質局在ア
ッセイ、イオン局在アッセイ、ｐＨ示差アッセイ、細胞移動アッセイ、細胞小器
官移動アッセイ、形態学アッセイ、化学化合物スクリーニングアッセイ、リガン
ド−タンパク質結合アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、核酸アッ
セイ、反応性酸素種のアッセイ、酵素活性アッセイまたは動力学アッセイである
、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】生物学的アッセイがトランスフェクション効率アッセイ、
感染アッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、タンパク質移動アッセイ、タンパク質局在ア
ッセイ、イオン局在アッセイ、ｐＨ示差アッセイ、細胞移動アッセイ、細胞小器
官移動アッセイ、形態学アッセイ、化学化合物スクリーニングアッセイ、リガン
ド−タンパク質結合アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、核酸アッ
セイ、反応性酸素種のアッセイ、酵素活性アッセイまたは動力学アッセイである
、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】生物学的アッセイがトランスフェクション効率アッセイ、
感染アッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、タンパク質移動アッセイ、タンパク質局在ア
ッセイ、イオン局在アッセイ、ｐＨ示差アッセイ、細胞移動アッセイ、細胞小器
官移動アッセイ、形態学アッセイ、化学化合物スクリーニングアッセイ、リガン
ド−タンパク質結合アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、核酸アッ
セイ、反応性酸素種のアッセイ、酵素活性アッセイまたは動力学アッセイである
、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】ａ)請求項１の共焦点イメージングシステムを使用した対象から放射される電磁放射の測定、そしてｂ)複数のシグナルの受信；複数のシグナルのシグナルの閾値との比較；複数のシグナルの閾値との比較に基づいた複数のシグナルに対応する一組の縮約
データ値の製造；そして一組の縮約データ値に対応する対象の複数の領域の部分の空間的に関係に基づい
た少なくとも二つのグループへの縮約データのグループ化を含む過程を使用した、検出デバイスにより産生された複数の電子シグナルのグ
ループ化：の段階を含む、対象の試験法。
【請求項３７】ａ)請求項２５または２６の集束システムを備えた顕微鏡を使用した対象から放射される電磁放射の測定、対象から放射される電磁放射は検出装置に集められ、
複数の電子シグナルに変換される；そしてｂ)複数のシグナルの受信；複数のシグナルのシグナルの閾値との比較；複数のシグナルの閾値との比較に基づいた複数のシグナルに対応する一組の縮約
データ値の製造；そして一組の縮約データ値に対応する対象の複数の領域の部分の空間的に関係に基づい
た少なくとも二つのグループへの縮約データのグループ化を含む過程を使用した、検出デバイスにより産生された複数の電子シグナルのグ
ループ化：の段階を含む、対象の試験法。
【請求項３８】ａ)それに沿って放射が伝搬される、光軸に横向きに伸びる電磁放射の伸長したビームの形成；ｂ)対象が位置する第１平面における第１伸長した領域への伸長したビームの方向付けおよび集束、および対象から放射される電磁放射の１個またはそれ以上の
伸長した第２領域への方向付け、ここで各第２伸長した領域は第１平面に接合し
た異なる第２平面上である；ｃ)第２接合面の最後の一つにおいて、または少なくとも一つの第２接合平面に接合した第３平面において、対象から放射される電磁放射が一致する検出エレメ
ントの方形アレイを含む検出デバイスの設置；そしてｄ)放射された電磁放射が検出エレメントの方形アレイに送達され、検出デバイスにより放射された電磁放射を走査と同調して示す多くの電子シグナルに変換さ
れるように、対象に対して伸長したビームを動かすことによる、または対象を伸
長したビームに対して動かすことによる対象の走査：の段階を含む、対象の試験法。
【請求項３９】更にａ)第２伸長した領域と整列した長軸を有する伸長した空間フィルターによる放射された電磁放射の空間的フィルタリング；およびｂ)検出デバイス上への、第２接合平面のイメージの形成：を含む、請求項３８記載の対象の試験法。
【請求項４０】対象に向かう電磁放射の伸長されたビームが２個またはそ
れ以上の波長を含む、請求項３８記載の対象の試験法。
【請求項４１】空間フィルターが可変幅を有する、請求項３９記載の対象
の試験法。
【請求項４２】検出デバイスがｍ×ｎアレイを含み、ｍがアレイの第１次
元の検出エレメントの数であり、ｎが第２次元の検出エレメントの数であり、ｎ
がｍより大きいものである、請求項３８記載の対象の試験法。
【請求項４３】放射された電磁放射が向けられる伸長された領域が、検出
デバイスのアレイと整列した長軸を有し、長軸が第２次元と同じ方向に伸びる、
請求項４２記載の対象の試験法。
【請求項４４】アレイの第１次元に伸びるカラムを形成する少なくとも２
つのディテクターが一緒に収納されている、請求項４２記載の対象の試験法。
【請求項４５】アレイの多くのディテクターエレメントが一緒に収納され
ている、請求項４２記載の対象の試験法。
【請求項４６】検出デバイスがＣＣＤアレイである、請求項４２記載の対
象の試験法。
【請求項４７】検出デバイスが方形形態ＣＣＤアレイである、請求項３８
記載の対象の試験法。
【請求項４８】対象から放射される放射が蛍光放射である、請求項３８記
載の対象の試験法。
【請求項４９】不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を有する支持体の
不連続表面に対象が位置し、ａ)第１集束ビームが対物レンズを通して不連続表面により反射されて対物レンズを通して戻るような、不連続表面への対物レンズを通した第１波長を有する電
磁放射の第１集束ビームの方向付け；ｂ)第２集束ビームが対物レンズを通して連続表面により反射されて対物レンズを通して戻るような、連続表面への対物レンズを通した第２波長を有する電磁放
射の第１集束ビームの方向付け；ｃ)対物レンズに反射して戻ってきた第１波長の放射の第２波長からの分離；ｄ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた第１集束ビームの第１ディテクターによる検出；ｅ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた第２集束ビームの第２ディテクターによる検出；そしてｆ)支持体上の第１集束ビームまたは第２集束ビームの位置にしたがった第１ディテクターまたは第２ディテクターからのシグナルに反応した対物レンズの支持
体に対するまたは支持体の対物レンズに対する移動：を含む焦点システムを更に含む、請求項３８記載の対象の試験法。
【請求項５０】更に試薬を対象が位置する第１平面に分配する手段を含む
、請求項３８記載の対象の試験法。
【請求項５１】更に対象の温度を制御する手段を含む、請求項３８記載の
対象の試験法。
【請求項５２】対象上に向かう電磁放射の伸長したビームが１個またはそ
れ以上の波長を含み、第２平面が一つである、請求項３９記載の対象の試験法。
【請求項５３】更にａ)放射波長の分離；そしてｂ)１個またはそれ以上の検出デバイスによる少なくとも一つの分離波長の検出：の段階を更に含む、電磁放射の２個またはそれ以上の波長が対象から第１平面の
第１伸長領域に放射されている、請求項３８、４０または５２のいずれかに記載
の記載の対象の試験法。
【請求項５４】不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を有する支持体の
不連続表面に対象が位置し、ａ)対物レンズを通して不連続表面により反射されて対物レンズを通して戻るような、不連続表面への対物レンズを通した電磁放射の集束ビームの方向付け；ｂ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた集束ビームの焦点ディテクターによる検出；ｃ)支持体上の集束ビームの位置にしたがった焦点ディテクターからのシグナルに反応した対物レンズの支持体に対するまたは支持体の対物レンズに対する移動
：を含む焦点システムを更に含む、請求項３８記載の対象の試験法。
【請求項５５】第１および第２波長が同じである、請求項３８記載の対象
の試験法。
【請求項５６】不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を有する支持体の
不連続表面に対象が位置し、２個またはそれ以上の電磁放射の波長が対象から放
出され、ａ)第１集束ビームが対物レンズを通して不連続表面により反射されて対物レンズを通して戻るような、不連続表面への対物レンズを通した第１波長を有する電
磁放射の第１集束ビームの方向付け；ｂ)第２集束ビームが対物レンズを通して連続表面により反射されて対物レンズを通して戻るような、連続表面への対物レンズを通した第２波長を有する電磁放
射の第１集束ビームの方向付け；ｃ)対物レンズに反射して戻ってきた第１波長の放射の第２波長からの分離；ｄ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた第１集束ビームの第１ディテクターによる検出；ｅ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた第２集束ビームの第２ディテクターによる検出；そしてｆ)支持体上の第１集束ビームまたは第２集束ビームの位置にしたがった第１ディテクターまたは第２ディテクターからのシグナルに反応した対物レンズの支持
体に対するまたは支持体の対物レンズに対する移動：を含む焦点システムを更に含む、請求項５３記載の対象の試験法。
【請求項５７】不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を有する支持体の
不連続表面に対象が位置し、２個またはそれ以上の電磁放射の波長が対象から放
出され、ａ)対物レンズを通して不連続表面により反射されて対物レンズを通して戻るような、不連続表面への対物レンズを通した電磁放射の集束ビームの方向付け；ｂ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた集束ビームの焦点ディテクターによる検出；ｃ)支持体上の集束ビームの位置にしたがった焦点ディテクターからのシグナルに反応した対物レンズの支持体に対するまたは支持体の対物レンズに対する移動
：を含む焦点システムを更に含む、請求項５３記載の対象の試験法。
【請求項５８】ａ)不連続表面または不連続表面上に位置する対象への対物レンズを通した第１ビームの方向付け；ｂ)不連続表面に集束し、該不連続表面により対物レンズに反射して戻る、第１波長を有する電磁放射の第２ビームの対物レンズを通した方向付け；ｃ)連続表面に集束し、該連続表面により対物レンズに反射して戻る、第２波長を有する電磁放射の第３ビームの対物レンズを通した方向付け；ｄ)対物レンズを通して反射して戻ってきた第１波長の放射の第２波長の放射との分離；ｅ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた第２ビームの第１ディテクターによる検出；ｆ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた第３ビームの第２ディテクターによる検出；そしてｇ)対物レンズを通して反射して戻ったビームの焦点のコントロールのための、支持体上の第１集束ビームまたは第２集束ビームの位置にしたがった第１ディテ
クターまたは第２ディテクターからのシグナルに反応した対物レンズの支持体に
対するまたは支持体の対物レンズに対する移動：を含む、不連続表面および不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を含む支持体
と共に使用する、集束法。
【請求項５９】ａ)不連続表面または不連続表面上に位置する対象への対物レンズを通した第１ビームの方向付け；ｂ)不連続表面に集束し、該不連続表面により対物レンズに反射して戻る、電磁放射の集束ビームの対物レンズを通した方向付け；ｃ)対物レンズを通して不連続表面から戻ってきた集束ビームの焦点ディテクターによる検出；ｄ)対物レンズを通して反射して戻ったビームの焦点のコントロールのための、支持体上の集束ビームの位置にしたがった焦点ディテクターからのシグナルに反
応した対物レンズの支持体に対するまたは支持体の対物レンズに対する移動：を含む、不連続表面および不連続表面と同じ方向に伸びる連続表面を含む支持体
と共に使用する、集束法。
【請求項６０】第１および第２波長が同じである、請求項５８記載の集束
法。
【請求項６１】ａ)複数のシグナルの受信；ｂ)複数のシグナルのシグナルの閾値との比較；ｃ)複数のシグナルの閾値との比較に基づいた複数のシグナルに対応する一組の縮約データ値の製造；そしてｄ)一組の縮約データ値に対応する対象の複数の領域の部分の空間的に関係に基づいた少なくとも二つのグループへの縮約データのグループ化を含む過程を使用した、検出デバイスにより産生された複数の電子シグナルのグ
ループ化の段階を更に含む、請求項３８記載の方法。
【請求項６２】ａ)請求項５８または５９の集束法の使用；ｂ)対象から放射される電磁放射の測定、放射される放射を検出装置に集めることによる対象から放射される電磁放射の測定、ここで複数の電子シグナルに変換
される；ｃ)複数のシグナルのシグナルの閾値との比較；複数のシグナルの閾値との比較に基づいた複数のシグナルに対応する一組の縮約
データ値の製造；そして一組の縮約データ値に対応する対象の複数の領域の部分の空間的に関係に基づい
た少なくとも二つのグループへの縮約データのグループ化を含む過程を使用した、検出デバイスにより産生された複数の電子シグナルのグ
ループ化：の段階を含む、対象の試験法。
【請求項６３】対象が生物学的アッセイである、請求項３８、４９または
５４のいずれかに記載の対象の試験法。
【請求項６４】請求項５８または５９のいずれかに記載の焦点法を使用す
る段階を含む、生物学的アッセイのモニター法。
【請求項６５】生物学的アッセイがトランスフェクション効率アッセイ、
感染アッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、タンパク質移動アッセイ、タンパク質局在ア
ッセイ、イオン局在アッセイ、ｐＨ示差アッセイ、細胞移動アッセイ、細胞小器
官移動アッセイ、形態学アッセイ、化学化合物スクリーニングアッセイ、リガン
ド−タンパク質結合アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、核酸アッ
セイ、反応性酸素種のアッセイ、酵素活性アッセイまたは動力学アッセイである
、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】生物学的アッセイがトランスフェクション効率アッセイ、
感染アッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、タンパク質移動アッセイ、タンパク質局在ア
ッセイ、イオン局在アッセイ、ｐＨ示差アッセイ、細胞移動アッセイ、細胞小器
官移動アッセイ、形態学アッセイ、化学化合物スクリーニングアッセイ、リガン
ド−タンパク質結合アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、核酸アッ
セイ、反応性酸素種のアッセイ、酵素活性アッセイまたは動力学アッセイである
、請求項６４記載の方法。