JP2006031004A - 光走査型顕微鏡およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
試料領域(23)の照明のための照明光を供給する照明装置(2)、照明光を試料上に誘導して走査する走査装置(3、4)および照明された試料領域(23)を走査装置(3、4)の使用下共焦点絞り(26)により少なくとも1つの検出ユニット(28)上に結像させる検出装置(5)を持つ共焦点レーザ走査型顕微鏡であって、照明装置(2)が走査装置(3、4)に線形照明光を供給し、走査装置(3、4)が線形照明光を試料上に誘導して走査し、および共焦点絞りがスリット絞り(26)として、または共焦点絞りの作用をする検出ユニット(28)のスリット状領域(28、48)として形成されるようになっている。
【選択図】図1
Description
その共焦点光学顕微鏡法によれば、回折の制限された共焦点体積内で生成される、その大きさがマイクロメータ領域の光学信号を選択的に検出することができる。
適用上の観点からは、化学面での高い説得性に基づき特に共焦点ラマン顕微鏡法が非常に魅力的である。DE 0 542 962 B1には、コンフォカール条件の生成のためスポット分解性を持つ面検出器の然るべき読み出しが利用される共焦点ラマン顕微鏡法の構成について記述されている。
例えば第2高調波発生により魅力的なコントラスト法を提供するものの、同じく低い信号強度、それに伴う長い測定時間により実際での使用が大きく制限されている非線形光学顕微鏡法の領域においても同様の問題に直面する。
この課題は本発明に基づき、走査装置の照明装置が線形照明光を供給し、走査装置が線形照明光を走査して試料上に誘導する、および共焦点絞りが、スリット絞りとして形成されているか、または共焦点絞りとして作用する、検出ユニットのスリット状領域が形成されている、前記様式の共焦点レーザ走査型顕微鏡により解決される。
特にコンパクトな構造形態を持つ絞り作用素子は、走査ユニットによって実現される。例えば、大きさの限定された走査ミラーの面を絞りとして作用させることができる。
特に簡単に作製できる製品形態としては、丸みのある稜を持つ、楔形に作られたミラーがある。そのようなミラーは直方体から簡単に作製でき、均一なエネルギー分布を実現する焦線が得られる。
f(x,y)=√{(a(y)−rx)2−x2−rx} 、ただし、rxは稜線に沿った、すなわち上記の第2切断方向における曲率半径である。
別なフィールド形態を得るためにミラー形態を変える場合、例えばこの第2ミラーにも上記の非球面を使用することができる。それは、第1方向での(非球面の1つによる)ひとみ充満ともう1つの方向での(もう1つの非球面による)中間像との間で均一化の組み合せを達成するためである。追加の非球面によって画像誤差の補償効果も得られる。集光ミラーに加えて、当然のことながら、さらに第2の非球面を設置することもできる。
レーザ走査型顕微鏡では、好ましくも、オプショナルな独立作用性の第2走査装置によりズーム分散機能、すなわちクロップ(Crop)機能が実現される。
適用別の選択が可能なように、メインカラースプリッタには、例えば、個々に取換可能なスプリッタを含む然るべき分離ダイヤルなど、簡便な取換を可能にする機械装置が備わっているのが好ましい。
この場合、図示されているような、複数レーザからの照明ビームの合一化が非常に有利であると実証されている。蛍光顕微鏡法で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば、原則として使用可能である。ラマン顕微鏡法でも、レイリー散乱成分の抑制のために検出器の前にホログラフィックノッチスプリッタまたはフィルタを使用するのが有利である。
線形または非線形のラマン信号の検出では、偏光に依存する照明または検出により、検査対象である分子振動の対称を分析することができ、また障害となる非ラマン共振性基礎成分を抑制することができる。それゆえ、そのような適用例では、照明装置に少なくとも1つの偏光子を、および検出装置には少なくとも1つの偏光分析器を使用することが勧められる。
補正装置は、既述の通り、結像光学装置内で移動可能な光学素子への要求を緩和している。この長所は、共焦点顕微鏡が、様々なアプリケーションへの適合化、すなわち入射波長または読み出し波長の取換を行う、交換可能なビームスプリッタを有している場合に特に有効になる。補正装置は、変更可能な光学素子に起因する誤差を光学的結像に操作を加えることなく補正する。補正装置はその上、共焦点絞りと検出器間でも使用でき、絞りと検出器間の光路(結像)を適切に平行移動させることができる。
第1の場合では、試料からの光がスリット絞りに正確に命中し、スリット絞りの上や下に分散しないことが確保される。第2の場合では、試料からの光がライン検出器に正確に命中し、例えばそれぞれが固有のライン検出器を持つシステム内2つの検出チャネルの画像間でピクセル移動のないことが確保される。このようにして、共焦点顕微鏡はマルチチャネル構成においてサブピクセル単位の正確な画像カバリングを達成することができる。
このように、本発明では有利なことに、広域視野照明と走査検出とが組み合わされている。驚くほど簡易なこの対策によってセパレート型検出器は省略することができる。同時にその他にも付随的利益が得られる。
したがって、共焦点検出装置の深度弁別能が深度分解透過測定を実現する。
広域視野照明はスポット状の走査照明とは切り離して操作することができる。もちろん、制御ユニットは同時にも作動させることができ、その場合試料は透過操作に加え従来型の蛍光操作により同時に分析される。
スリット絞りで生成された部分コンフォーカル性により、広域視野光学照明に比べて改良されたスライス分割が達成される。したがって、本発明に基づくラインスキャナはz方向の迅速フォーカシングとの組み合せで広幅試料の3次元再構成を可能にする。z方向の迅速フォーカシングは、z方向での試料の動き(例えば、迅速な機械的駆動または試料の圧電式移動による)、対物レンズのz方向での移動(例えば、迅速な機械的駆動または対物レンズの圧電式移動による)、対物レンズのフォーカシングまたは迅速適合型光学系により実現することができる。
最後に挙げた非線光学分光法のうちの幾つかは、ビームがコリニアに重なり合う2つまたはそれ以上のレーザを必要とする。その場合、図示されている複数レーザのビーム結合が特に有利であることが実証されている。
図1は、主要部が5つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール2、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール3、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール4および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール5から成るレーザ走査型顕微鏡1の模式図である。その場合検出モジュール5は、図1に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
コリメータ12、13は、光源モジュール2から走査モジュール3へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、(図には描かれていない)中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ12、13とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。
ビーム形成ユニット16については後にさらに詳しく説明するが、これは、ビーム結合ミラー14、15の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。
スキャナ18は線形ビームを1軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ19および鏡筒レンズ20、対物レンズ21を通って、プレパラートまたは試料23内にある焦点22に集束する。その場合光学結像は、試料23が励起光により焦線で照明されるように行なわれる。スキャナ18による2軸偏向はオプショナルである。これは、さらに詳しく説明するが、光軸に非対称なROI走査領域の選択に用いることができる。
さらにまたスキャナ18も二重作用を有している。それは、点状入射励起光の場合だけでなく、広域視野照明の場合でも試料の点状走査によってスポット分解を達成するからである。
このコンセプトにより、技術水準的にこれまでは必要であった顕微鏡モジュール4のノンデスキャン検出器が省略できる。その上、共焦点検出により、ノンデスキャン検出の場合では、通例高コストのマトリックスセンサでしか得られないような高分解能が達成できる。しかも、例えばハロゲンランプ29または水銀蒸気ランプ34など入射広域視野照明の経時的変動についても、スポット分解検出器28、28aにおける然るべき統合により解消することができる。
そのほか、撮像時間および信号対雑音比を同条件にして単点式共焦点スキャナと比較した場合の試料負荷に関しては、すなわち試料に当てることで試料を退色させるかもしれないビームの照射は、これ迄単点式共焦点スキャナで適用されてきたビーム出力を複数の点に、例えばラインに分布させることで1/nの量に減らすことができる。
図2から見て取れるように、可動式の、すなわち移動可能なコリメータ12および13を経由したガウス光線束はビーム結合ミラー14、15としてのミラー階段を通じて合一化され、続いて長方形のビーム横断面を持つ光線束に変換される。図1のビーム形成ユニット16としては、最も簡単な例では円筒型光学系が使用される。しかし図2の実施態様では、円筒型テレスコープ37が使用されていて、その後方に非球面ユニット37、続いて円筒型光学系39が配置されている。
図3および図4は、光源ビームのビームプロファイルの変形を可能にする照明装置を示している。
図3は(x、y)平面の断面で、図4はそれに垂直な(z、y)平面の断面である。元々は、伝播方向に垂直なそれぞれの断面方向ではガウスプロファイルを示すビームである。変形後プロファイル平面Pでは実質上長方形のフィールドに照明するビームになっている。その場合フィールド縦軸に沿う強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
ズーム倍率1.0未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ37は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ41が縮小された場合に開口絞り42への照明が不完全になるのを防止する。したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ37により、ズーム倍率1未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ41の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。
各グループは少なくとも1つのレンズから成っている。想定されたスペクトル領域および照準された開口/視野角の要求が満たされるように、グループは結像欠陥に関してはできる限り自動補正されるようになっている。
“Three-dimensional
and multidimensional microscopy ; Image acquisition processing VII” Proceedings of SPIE第3919巻(2000年)、141〜150ページのGustafsson、 M.著“Doubling the lateral resolution of wide-field fluorescence
microscopy using structured illumination”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に補正することができる。
図8はレーザ走査型顕微鏡1の検出モジュール5の実施態様を表わした模式図である。当モジュールには検出器28としてCCD配列43が装備されていて、これはカラースプリッタ25を通じてレーザ走査型顕微鏡1の光路に結合している。カラースプリッタ25は、様々な波長領域のビームが捕捉できるように、取換可能になっている。取換可能なカラースプリッタ25は、レーザ走査型顕微鏡で使用される励起ビームに対してだけでなく、検出対象の(蛍光)ビームに対しても適合性がある。
CCD配列43は、カラースプリッタ25から共焦点絞りとして作用するスリット絞り26を通って到達したビームを保有する。
蛍光励起のために照明される試料23のライン状または列状の領域、すなわち共焦点結像のなされる領域が図8に摸式的に描かれている。システム内で反射した励起光のCCD配列43における意図せざる検出を回避するために、さらにブロックフィルタ27が前置接続されるが、これは、希望する蛍光ビームだけがCCD配列43に到達するように、然るべきスペクトル特性を有している。
補正ユニット40、40aによる調整に加え、スリット絞り26、26a自体の調整も可能である。これは特に、スリット絞り26、26aの幅を、したがってまたエアリー直径を検出器に適合させるために行われる。スリット絞り26、26aのスリット幅を調整することによって焦点深度およびまた試料内のz方向、すなわち光軸に沿う方向での深度弁別性が調整される。追加補助的な横移動は補正ユニット40、40aの調整領域外における粗調整に利用される。
特にホログラフィック・ラマンノッチフィルタ使用の場合のラマン顕微鏡検査においては、二重型および三重型の分光計の代わりに単式モノクロメータを使用することも考えられる。
例えば下記の文献が参考になる :
1 B.
Alberts他著(2002年): Molecular Biology of
the Cell ; Garland Science刊
1、2 G. Karp著(2002年): Cell and Molecular Biology ; Concepts and Experiments ; Wiley Text
Books刊
1、2 R. Yuste他著(2000年): Imaging neurons – a laboratory Manual ; Cold Spring Harbor
Laboratory Press刊、 ニューヨーク
2 R.P.
Haugland著(2003年): Handbook of fluorescent
Probes and research Products第10版
; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV刊
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも1/10秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する :
・ Abdul-Karin、M. A.他は2003年“Microvasc. Res.”第66巻、113〜125ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、3次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・ Soll、D. R.他は2003年“Scientic World Journ.”第3巻827〜841ページに3次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・ Grossmann、 R他は2002年“Glia”第37巻229〜240ページにラットの微小神経膠細胞における運動の3次元分析について記述している。そのデータは10時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。
これに関しては特に次のことが重要なポイントである :
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので3次元ROI照明から保護されねばならない3次元領域での生細胞の分析
・ 例えばFRET実験などにおいて、3次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の3次元領域での分析
・ 例えば3次元FRAP、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にROI外の観察も必要なマーカーによる生細胞の3次元領域での分析
・ 例えば3次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の3次元領域での照準分析
・ 例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析
・例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析
・ 例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、HcRedなど可変性多重マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えばCa+マーカーなどでマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、例えばGFPによる形質転換動物
・ 例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えばタンパク質を高速度で(殆どが1/100秒の領域)描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ROIブリーチングを伴うFRAPもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・ Umenishi、 F.他が2000年“Biophys J.”第78巻1024〜1035ページに、GFP変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・ Gimpl、 G.他が2002年“Prog. Brain Res.”第139巻43〜55ページに、ROIブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびGFPマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・ Zhang他が2001年“Neuron”第31巻261〜275ページに、GFP変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。
分子間の相互作用
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度(1/100秒レベル)で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばROIブリーチングを伴うFRETなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・
Petersen、 M. A.およびDalley、 M. E.が2004年“Glia”第46巻195〜206ページに、ラット海馬角の培養における2チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて3次元空間において長時間に亘り2チャネルで記録される。
・
Yamamoto、 N.他が2003年“Clin. Exp. Metastasis”第20巻633〜638ページに、ヒトの線維肉腫細胞の2色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質(GFPおよびRFP)が同時にリアルタイムで観察された。
・
Bertera、 S.他が2003年“Biotechniques”第35巻718〜722ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内3次元空間で迅速シリーズとして行われる。
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が1/100秒から1/1000秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく :
・ Brum
G他が2000年“J Physiol”第528巻419〜433ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なCa+活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・ Schmidt
H他が2003年“J Physiol”第551巻13〜32ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるCa+イオンの分析について記述している。変化するCa+に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なCa+変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるCa+活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。
2 光源モジュール
3 走査モジュール
4 顕微鏡モジュール
5 検出モジュール
6,7 レーザユニット
8 光バルブ
11 光ファイバ
12,13 コリメータ
14,15 ビーム結合ミラー
17 カラースプリッタ
18 スキャナ
19 走査対物レンズ
20 鏡筒レンズ
21 対物レンズ
22 焦点
23 試料
24 転向ミラー
26 スリット絞り
27 ブロックフィルタ
28 検出器
29 ハロゲンランプ
34 水銀蒸気ランプ
36 ビームスプリッタ
37 円筒形テレスコープ
38 非球面ユニット
41 ズーム対物レンズ
42 開口絞り
Claims (39)
- ‐ 試料領域(23)の照明のための照明光を供給する照明装置(2)、
‐ 照明光を試料上に誘導して走査する走査装置(3、4)および
‐ 照明された試料領域(23)を走査装置(3、4)の使用下共焦点絞り(26)により少なくとも1つの検出ユニット(28)上に結像させる検出装置(5)
を持つ、特に共焦点レーザ走査型顕微鏡など、
照明光が試料を複数の点または領域で平行に照明し、複数の点または領域が同時に検出される、照明された複数の試料点が一直線上に並び、複数の点が位置分解能のある検出器により同時に検出される、照明光と試料間の相対的移動により少なくとも1つの試料領域を捕捉するための光走査型顕微鏡であって、
‐ 照明装置(2)が走査装置(3、4)に線形照明光を供給する、
‐ 走査装置(3、4)が線形照明光を試料上に誘導して走査する、および
‐ 共焦点絞りがスリット絞り(26)として、または共焦点絞りの作用をする検出ユニット(28)のスリット状領域(28、48)として形成されている
ことを特徴とする光走査型顕微鏡。 - 顕微鏡(1)の照明光路(BS)内で、対象物(23)を捕捉する対物レンズ(21)の前に配置されていて、対象物の中間結像(ZB1)を実現させ、照明光路の入射ひとみ(EP)を可変的倍率(v)および/または可変的結像長(L)で射出ひとみ(AP)に結像させるズーム光学系によって特徴付けられる、請求項1に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 射出ひとみ(AP)内に、ズーム光学系の調整に依存することなく射出ひとみ(AP)の大きさを決定する、絞り(42)としての作用をする素子が配置されていることを特徴とする、ただしその場合に、射出ひとみ(AP)の大きさが、好ましくは対物レンズの入射ひとみ(OP)の大きさよりも小さいものとする、請求項2に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 第1操作モードでは一定の結像長(L)で可変的倍率(v)を、第2操作モードでは一定の倍率(v)で可変的結像長を実現する制御ユニットによる制御下で位置調整の可能なズーム光学系によって特徴付けられる、請求項2または3に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 走査装置(3、4)が、照明光の直線長を拡大し、ズーム光学系(42)のズーム係数が1未満である場合に、光路に接続される円筒型テレスコープ(37)を有していることを特徴とする、請求項2、3または4に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- オリジナル光線(16.3)の衝突点領域では衝突点から離れた領域よりも強く湾曲している非球面凸面鏡(16.1)を有している、横断面の不均質な、特にガウス型のオリジナル光線(16.3)から線形照明光を生成するための変換ユニット(16)によって特徴付けられる、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- ミラー(16.1)が丸みのある稜線(16.9)を持つ楔型に形成されていることを特徴とする、請求項6に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- cを稜線(16.9)の曲率半径およびQを円錐定数であるとして、鏡面(16.6)がデカルト(x、y、z)座標において函数y2/[c+(c2-(1-Q)y2)1/2]を満たしていることを特徴とする、請求項6または7に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 加えて、鏡面が稜線(16.9)の縦軸に沿って湾曲していることを特徴とする、請求項7に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- rxが稜線(16.9)の縦軸に沿った曲率半径、a(y)が請求項8の関数であるとして、非球面鏡(16.1)が、関数f(x、y)=[(a(y)−rx)²−x²]1/2−rxを満たしていることを特徴とする、請求項8または9に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- ミラー(16.1)の対称軸が、オリジナル光線(16.3)の入射軸(QA)に対して4°〜20°の角度内にあることを特徴とする、請求項6〜10の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 非球面鏡(16.1)の後方に集光ミラー(16.2)が配置されていることを特徴とする、請求項6〜11の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 集光ミラー(16.2)が、円筒型またはゲート型であることを特徴とする、請求項10に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- dが非球面鏡(16.1)と集光ミラー(16.2)間の距離であるとして、集光ミラー(16.2)が、x方向に(rx+2・d)に等しい曲率半径を有していることを特徴とする、請求項10〜13に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 走査装置が、独立した制御性および作用性のある2つの走査素子を有していて、そのうちの1つがズームの分散機能を実現するということを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 検出ユニットが、共焦点平面に配置された位置分解性センサ(28)を有していて、位置分解性センサ(28)の部分領域の選択が共焦点スリット絞りとして作用することを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 検出ユニットが、線形ビームを線に対して横方向に分割し、それを面光線検出器(50)上に誘導することを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 分光計(49)が、共焦点絞りとして用いる入射スリット(48)を有していることを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 検出ユニットが、線形ビームを線に対して横方向に時間分割し、それを面光線検出器上に誘導するストリークカメラを有していることを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 照明装置(2)内の少なくとも1つの偏光子(45、46)および検出装置(5)内の少なくとも1つの偏光分析器(47)によって特徴付けられる、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 検出装置(5)が、検出ユニット(28、28a)をそれぞれ1つずつ持つ複数のスペクトルチャネルを有していることを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 共通のスリット絞り(26)が、すべてのスペクトルチャネル用に前方設置されていることを特徴とする、請求項21に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- スリット幅の調整可能なスリット絞り(26)またはスリット幅の異なる交換可能な複数のスリット絞りを有するスリット絞りユニットによって特徴付けられる、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- ホルダ(40、11)に保持されて光路内に設置され、ホルダを通じての傾倒および/または旋回運動により少なくとも1つの軸の周りを移動させることができ、それにより、その傾倒位置の変更から光路内でのビームの一定の平行移動(dx、dy)を設定することができる、少なくとも1つの透明なオプチカルフラットプレート(40、9)を持つ、照明装置(2)および/または検出装置(5)内に配備された補正装置によって特徴付けられる、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 2軸に対して傾倒および/または旋回の可能な少なくとも1つのプレート(40、9)または1軸に対して傾倒および/または旋回の可能な少なくとも2つの異なったプレートによって特徴付けられる、請求項24に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 少なくとも1つの操作パラメータを捕捉し、操作パラメータの値に依存して傾倒位置を調整する調整装置によって特徴付けられる、請求項24または25のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- プレート(40、9)の傾倒位置を調整量として使用する制御系によって特徴付けられる、請求項24〜26のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 色との関連なしに、または色との関連に基づき、照準下で行う平行移動調整に用いられる異なった分散性を持つ素材から成る独立作動性の2つのプレート(40、9)によって特徴付けられる、請求項24〜27のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 光路内の横色収差を補償するため、少なくとも1つのプレート(40、9)が、異なった分散性を持つ素材からの2つの部分プレート(40、9a、40、9b)で構成されていることを特徴とする、請求項24〜28のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 試料領域(23)の検出ユニット(28)への結像またはスリット絞り(26)の検出ユニット(28)への結像をセンタリングするために、プレート(40、9)が光路内において検出ユニット(28)の前に配置されていることを特徴とする、請求項24〜29のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 顕微鏡が、光路内に取換または調整の可能な素子を有していて、調整装置が、取換または調整の可能な素子の形成を操作パラメータとして捕捉することを特徴とする、請求項26に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 検出装置(28、28a)が、様々な波長のビームを分析し、調整装置が光路内の波長を操作パラメータとして捕捉することを特徴とする、請求項26に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 制御系が、検出ユニット(28)におけるビーム強度を最大限上げる、および/または画像移動を最小限に抑えることを特徴とする、請求項27に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 試料領域(23)と共焦点絞り(26)との間にも、絞り(26)と検出ユニット(28)との間にも、2軸に対し傾倒および/または旋回の可能な1つのプレート(40、9)が、または1軸に対し傾倒および/または旋回の可能な異なった2つのプレートが、設置されていることを特徴とする、請求項24〜33のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 請求項1〜34に記載の共焦点レーザ走査型顕微鏡が使用されていること、および試料がラマン分光法により、特にコヒーレントなストークスまたは反ストークスまたはハイパラマンまたは誘導ラマン分光法かあるいは高次ラマンプロセスにより分析されることを特徴とする、レーザ走査型顕微鏡検査のための方法。
- 特に細胞結合面および有機体全体における、なかでも1/10秒から時間単位までのダイナミックなプロセス等の生育過程、それも特に下記諸点、すなわち
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので3次元ROI照明から保護されねばならない3次元領域での生細胞の分析、
・ 例えばFRET実験などにおいて、3次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の3次元領域での分析、
・ 例えば3次元FRAP、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にROI外の観察も必要なマーカーによる生細胞の3次元領域での分析、
・ 例えば3次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の3次元領域での照準分析、
・ 例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析、
・ 例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析、
・ 例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、HcRedなど可変性多重マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・ 機能に依存して変色する、例えばCa+マーカーなどでマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、例えばGFPによる形質転換動物、
・ 例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ、
のうちの少なくとも1つの研究のための、前記請求項の少なくとも1つに記載の装置および/または方法の使用。 - 特に、微小な運動構造体、例えばタンパク質の高速度描写に(殆どが1/100秒の領域)、それも特にROIブリーチングを伴うFRAPなどに適用される、細胞内運搬過程の研究のための前記請求項の少なくとも1つに記載の装置および/または方法の使用。
- 例えば、副分子構造解明のためのROIブリーチングを伴うFRETなど、好ましくは間接的技術の使用下における、特に、非常に微小な構造の高速度描写など、分子およびその他副細胞の描写のための前記請求項の少なくとも1つに記載の装置および/または方法の使用。
- 特に筋肉系または神経系に関する研究における迅速な信号伝達過程のための、特に、1/100秒から1/1000秒以下に到るまでの領域で展開されるイオン介在活動に関係する、高い経時的分解能による神経生理学過程のための、前記請求項の少なくとも1つに記載の装置および/または方法の使用。
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