JP2006030997A - 可動有孔ディスク付き光走査型顕微鏡およびそれの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】自由に構成できる複数の検出チャネルおよび良好な３Ｄ（次元）分解能を有する高速撮像顕微鏡
【解決手段】照明光と試料間の相対的移動により試料領域の少なくとも１箇所を捕捉するための光走査型顕微鏡１であって、照明光が試料２３を複数の点または領域で平行に照明し、複数の点または領域が検出装置２８によって同時に検出される、面検出器が配備されていて、照明生成のため可動有孔ディスクが装備されている、および検出光路には取換および／または切換の可能なビームスプリッタ１７および／またはフィルタ２７が配備されている光走査型顕微鏡。
【選択図】図１

Description

本発明は自由に構成できる複数の検出チャネルおよび良好な３Ｄ（次元）分解能を有する高速撮像顕微鏡に関する。

共焦点顕微鏡検査または４Ｄ顕微鏡検査において高いフレームレートを達成するには、試料走査の平行化対策が必要である。これは、従来では変更不能な共焦点絞り（例えば、ニポーディスクの場合）による２Ｄまたは３Ｄにおける分解能の制限、検出器使用台数の制限およびそれによる固定したスペクトル配分（通例、外部設置ＣＣＤカメラ）を意味してきた。それにより、可能な適用法、対象となる試料および３Ｄ画像結果の品質が著しく制限された。
ＤＥ １９９１５１３７Ａ１ ＵＳ ６０２８３０６ ＤＥ １９７０２７５３Ａ１

本発明に基づく共焦点型または４Ｄ型の新しい迅速性顕微鏡は、試料走査の平行化による高フレームレートと調整可能な共焦点絞りとの組み合せにより傑出している。その上、複数のカラースプリッタが選択できて検出チャネルの構成がフレキシブルに行えるように配置された内部検出器が使用されている。それにより、これ迄共焦点型または４Ｄ型の迅速性顕微鏡では不可能であった撮像に対し新たな適用が可能である。特に、検出チャネルおよび検出された波長の迅速交換の場合では、ＤＥ １９９１５１３７Ａ１、ＵＳ ６０２８３０６に記述されている原理どおり、蛍光信号など重畳スペクトル信号の分離／成分分解が有利に行える。
本発明は、ＵＳ ６０２８３０６のような多点照明にもＵＳ ６０２８３０６、ＷＯ ８８０７６９５、ＥＰ ５３９６９１Ａ１のようなニポー型装置にも有利に適用することができる。

以下では図面を参照しながら実施例に基づき本発明をさらに詳しく説明する。
図１は主要部が５つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール２、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行う走査モジュール３、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール４および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール５から成るレーザ走査型顕微鏡１の模式図である。その場合検出モジュール５は、図１に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはＤＥ １９７０２７５３Ａ１が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。

光源モジュール２は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール２に２つのレーザ６および７が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ８および減衰器９が接続されており、それらはビームを結合ポイント１０を通じて光ファイバ１１に連結させている。光バルブ８は、レーザユニット６または７のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ８は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ１１へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）として形成されている。

図１のモデル例ではレーザユニット６は、３つのレーザＢ、Ｃ、Ｄを有しているが、それに対しレーザユニット７はレーザＡを１つ持つのみである。したがって、図の６と７は単一波長用レーザと多種波長用レーザの組み合せモデルであり、個別に、または共同で１つまたは複数のファイバに連結されている。複数ファイバを通じてビームを同時連結することも可能であるが、その場合ではビームは後に、すなわち適合光学系の通過後にカラー結合器によって混合される。このようにして、励起光用に種々様々な波長または波長領域を使用することができる。

光ファイバ１１に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系１２および１３によりビーム結合ミラー１４，１５を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。
コリメータ１２、１３は、光源モジュール２から走査モジュール３へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、（図には描かれていない）中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ１２、１３とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。

ビーム形成ユニットについては後にさらに詳しく説明するが、これは、ビーム結合ミラー１４、１５の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。
線形ビームとも言われるこの照明光は励起光として用いられ、メインカラースプリッタ１７を通じてスキャナ１８に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール４から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。

スキャナ１８は線形ビームを１軸または２軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ１９および顕微鏡モジュール４の鏡筒レンズ、対物レンズを通って、プレパラートまたは試料内にある焦点２２に集束する。その場合光学結像は、試料が励起光により焦点で照明されるように行なわれる。

線形フォーカスで励起されたこのような蛍光ビームは顕微鏡モジュール４の対物レンズ、鏡筒レンズおよび走査対物レンズ１９を通ってスキャナ１８に戻るので、スキャナ１８に向かっての戻り過程の方向では再び定常ビームになっている。したがって、スキャナ１８は蛍光ビームをデスキャンするとも言われる。

メインカラースプリッタ１７は励起光とは別な波長領域にある蛍光ビームを通すことができるので、蛍光ビームは検出モジュール５の転向ミラー２４で転向させた後分析することができる。検出モジュール５は図１の実施態様では複数のスペクトルチャネルを有している。すなわち、転向ミラー２４のほうから来た蛍光ビームはサブカラースプリッタ２５により２つのスペクトルチャネルに分割される。

各スペクトルチャネルは、試料２３に対して共焦点結合あるいは部分共焦点結合を実現するスリット絞り２６を有しており、その大きさがビームの検出を可能にする焦点深度を決定する。したがって、スリット絞り２６の幾何学構造は、蛍光ビームの検出がなされる（厚みのある）プレパラート内の切断面を決定づける。
スリット絞り２６の後方にはさらに、検出モジュール５に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ２７が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器２８によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り２６ａ、ブロックフィルタ２７ａおよび検出器２８ａを持つ第２スペクトル検出チャネルも構成されている。

検出モジュール５における共焦点スリット開口の使用はモデル例に過ぎない。もちろん、単点型スキャナの実現も可能である。その場合ではスリット絞り２６、２６ａはホール型絞りに代えられ、ビーム形成ユニットは省くことができる。因みに、そのような構造様式にはすべての光学系が回転対称に構成される。もちろん、単点式の走査および検出に代えて、後に図３および４を手掛かりに改めて説明する点雲形式またはニポーディスク形式のコンセプトなど、原則として任意の多点型装置を使用することもできる。ただし、スキャナの通過時には複数の試料点が平行して捕捉されるので、検出器２８はスポット分解能を有していることが重要である。

図１から分かるように、可動式、すなわち移動可能なコリメータ１２および１３の後方にあるガウス光線束はビーム結合ミラー１４、１５形式のステップ型ミラーを通じて合一化され、続いて、図示された共焦点スリット絞り付き構造様式の場合では、長方形の横断面を持つ光線束に変換される。図１の実施例では、ビーム形成ユニット内には円筒型テレスコープ３７が使用されていて、その後ろには非球面ユニット３８、さらに円筒型光学系３９が配置されている。

ビーム変形後では、ビームはプロフィール平面にはほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
非球面ユニット３８を持つ照明装置は、鏡筒レンズと対物レンズ間にあるひとみを均一充填させるのに用いられる。それによって、対物レンズの光学分解能を完全に発揮させることができる。したがって、このバリエーション法は単点走査式または多点走査式の顕微鏡システム、例えばライン走査システムにも有用である（後者の場合、当該軸に加えそれ以外にも、試料上または試料中にフォーカシングされる）。

例えば線形に整えられた励起光がメインカラースプリッタ１７の方向に偏向される。当カラースプリッタは、好ましい実施態様では分割ミラーとして、つまり本発明でもその内容を包括的に取り入れているＤＥ １０２５７２３７ Ａ１記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ（例えば５０／５０、７０／３０、８０／２０タイプなど）またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。それにより、適用別に選択することが可能になるので、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。

例えば、反射、ストークス／反ストークスラマン分光法、高次数のコヒーレントラマンプロセスや、第２高調波発生、第３高調波発生、和周波混合発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、２光子、多光子吸収および蛍光におけるコヒーレントビーム、すなわち特に方向づけられたビームを検出すべき場合はダイクロイックメインカラースプリッタが有利である。これらの方法のうち、非線光学分光法のいくつかは、コリニヤ重畳をなす２つまたはそれ以上のレーザビームの使用を必要とする。この場合、図示されているような複数レーザビームの結合が特に有利であると実証されている。原則的には、蛍光顕微鏡検査で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば使用可能である。また、ラマン顕微鏡検査には、レイリー散乱成分の抑制のため検出器の前にホログラフィックノッチ・スプリッタまたはフィルタを設置するのが有利である。

図１の実施態様では、励起光または照明光はモータ制御式ズーム光学系４１を通じてスキャナ１８に送り込まれる。ズーム倍率は当方式で適合化させることができ、走査される視野は特定の調整領域内で連続的に変更することができる。ズーム光学系としては、連続的同調過程における焦点位置および結像倍率の適合化のあいだ、ひとみ位置が維持されたままであるようなタイプが特に有利である。

図１に矢印で示されたモータによるズーム光学系４１の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の３つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り４２の配置されたズーム光学系４１が特に好ましい。絞り４２を実地で簡単に実現するには、スキャナ１８鏡面幅の制限によって構成することもできる。ズーム光学系４１を持つ出力側絞り４２により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ１９上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系４１を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ１８領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り４２の使用が好ましい。

ズーム光学系４１と共同作用をする円筒型テレスコープ３７は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット３８の前に配置されている。図２の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
ズーム倍率１．０未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ３７は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ４１が縮小された場合に開口絞り４２への照明が不完全になるのを防止する。したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ３７により、ズーム倍率１未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ４１の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。

円筒型テレスコープ３７の旋回挿入時には照明光線による画像明度の急上昇が避けられないので、画像明度を一定に保つため、（図には描かれていない）制御ユニットでは、円筒型テレスコープ３７が作動している場合、スキャナ１８の送出し速度または検出モジュール５における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。

図１のレーザ走査型顕微鏡では、モータ作動式ズーム光学系４１およびモータにより操作切換可能な円筒型テレスコープ３７のほか、検出モジュール５でも遠隔制御可能な調整素子が設置されている。例えば、色波長誤差の補正のため、スリット絞りの前に丸型光学系４４と円筒型光学系３９が、検出器２８の直前に円筒型光学系３９が設置されており、それらはモータによりそれぞれ軸方向に移動できるようになっている。

加えて、補償のため補正ユニット４０が配備されているが、それについては以下に簡単に説明する。
スリット絞り２６は、前方配置の丸型光学系４４、同様に前方配置の第１円筒型光学系３９および後方配置の第２円筒型光学系と共に検出システム５のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り２６によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第２円筒型レンズ３９の前にはブロックフィルタ２７も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器２８、２８ａに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。

カラースプリッタ２５またはブロックフィルタ２７を取り換えて旋回挿入した場合、幾分かの傾斜誤差または楔角誤差が発生するのは避けられない。カラースプリッタは試料領域とスリット絞り２６間の誤差を、ブロックフィルタ２７はスリット絞り２６と検出器２８間の誤差を持ち込む可能性がある。その場合に、スリット絞り２６または検出器２８の新たな位置調整が必要になることがないように、丸型光学系４４とスリット絞り２６の間に、すなわち試料と検出器２８間の結像光路内に、コントローラの制御下で様々な傾斜位置に設定することのできるオプチカルフラットのプレート４０が配置されている。オプチカルフラットのプレート４０は、その目的のために然るべきホルダ内に位置調整可能なように設置されている。

図２は、ズーム光学系４１を利用すれば提供された最大限の視野ＳＦ内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している。例えば、共振型スキャナの場合では必ず必要なことであるが、振幅に変化が起きないようにスキャナ１８を持続的に制御すれば、ズーム光学系においてセットされた１．０以上の倍率により走査フィールドＳＦの光軸を中心として選択されるＲＯＩ領域が狭められる。
共振型スキャナに関しては、例えばＰａｗｌｅｙ著“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ社１９９４年刊、４６１ページ以降に記述されている。

スキャナがフィールドを、光軸に対し、すなわち走査ミラーの定常位置に対し非対称に走査するように、スキャナの制御を行えば、ズーム作用との関連性から選定ＲＯＩ領域の補正移動ＯＦが得られる。既に触れたスキャナ１８のデスキャン作用およびズーム光学系４１の再通過により、検出器方向への検出光路における観察対象領域ＲＯＩの選択が改めて中断される。それにより、走査画像ＳＦ内のＲＯＩ領域に対し任意の選択が可能になる。様々なＲＯＩ領域の選択毎に画像を追加獲得することができ、それらを高分解性画像に合成することができる。

選択ＲＯＩ領域を光軸に対する補正分ＯＦだけ移動させるのでなく、それに加えて回転もさせたい場合は、メインカラースプリッタ１７と試料２３間の光路のひとみに、周知のとおり画像フィールドに対して回転作用のあるアッベ・ケーニッヒプリズムを配置した実施態様が目的に適っている。この場合も検出器方向で作業の中断を行う。それにより、様々な補正シフトＯＦおよび様々な回転角を持つ画像が測定でき、続いて、例えば文献“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；Ｉｍａｇｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ VII”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＳＰＩＥ第３９１９巻（２０００年）、１４１〜１５０ページのＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｍ．著“Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に修正することができる。

図３は、ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡１として考えられる別な構造様式を示している。図３では極端に簡略描画されている光源モジュールが、ミニレンズアレー６５からメインカラースプリッタ１７を通過して、例えばＵＳ ６，０２８，３０６、ＷＯ ８８ ０７６９５またはＤＥ ２３６０１９７ Ａ１に記載されているようなニポーディスク６４を照明する。ミニレンズアレー６５を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール４内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系４１が設置されている。

ニポースキャナの場合、図１の構造様式からは変更部分があり、照明はメインカラースプリッタ１７を通過させて行われ、検出光は反射分離される。さらに、ニポーディスク６４による多点照明の場合では、それに対応した平行な走査が行われるように、図２に変更を加えて検出器２８はスポット分解能を持つように作られている。そのほか、ニポーディスク６４とズーム光学系４１の間には、ニポーディスク６４のピンホールを通り抜ける発散光を適当な束直径に変換させる、正の屈折力を持った然るべき固定型光学系６３が配置されている。

メインカラースプリッタ１７は、図３のニポー式構造の場合では旧来型のダイクロイックビームスプリッタであり、したがってスリット状または点状の反射領域を持つ上記ビームスプリッタではない。
ズーム光学系４１は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク６４があるため、もちろんスキャナ１８は不要になる。しかし、図２を基に説明したＲＯＩ領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。

多点走査による別法が模式図として図４に示されているが、その方法では複数の光源がスキャナのひとみに対して斜めに照射される。この場合でもメインカラースプリッタ１７とスキャナ１８間での結像にズーム光学系４１を使用することにより、図２に描かれたようなズーム機能を実現することができる。ひとみに共役な平面に様々な角度から光線束を同時入射することにより、光点が対象物平面に共役な平面に形成され、それがスキャナ１８により同時に対象物フィールド全体のうちの一部領域上に誘導される。スポット分解性のあるマトリックス検出器２８では部分画像全体の評価を通して画像情報が生成される。

その他の実施態様としては、ＵＳ ６，０２８，３０６に記載されているような多点走査があるが、その開示内容の中で関連事項は本発明に包括的に取り入れられている。ここでもスポット分解性のある検出器２８を設置することができる。その場合では試料は多点光源によって照明されるが、それは、多点光源が実現されるようにマルチ開口プレートを照明する、マイクロレンズアレーの後続配置されたビームエキスパンダによってなされる。

図５は、迅速性（平行化）ラインスキャナにおける複数カラーの検出のための、取換可能なビームスプリッタを持つ２つの内部検出器の配置に関するモデル例である。
ラインスキャナ（詳細は図１参照）の模式図にあるように、交換可能なダイクロイックビームスプリッタの使用下、たとえば分離ハンドルＴにより異なったスペクトルの検出波長間の迅速交換が、および複数のライン検出器、ここでは１および２の番号が付けられた検出器により平行して検出が行われる。

図６は、迅速性（平行化）ラインスキャナでの光学スライスの形成による３Ｄ検出改良用としての調整可能な共焦点スリット絞りの配置を示している。
ここでは、スペクトル検出モジュールの変更に代えて、またはそれに加えてＺ方向でのスライス厚の変更を実現するための調整可能なスリット絞りが図示されている。
軸方向または横方向の分割を伴うビーム多重化の場合は、ダイクロイックビームスプリッタの代わりに中性スプリッタを使用することもできる。光線経路の軸方向または横方向の相互移動は、例えばスリット絞りの軸方向、横方向の然るべきポジション設定により検出器に選択的に反映させることができる。

本発明は、迅速作業性のある共焦点レーザ走査型顕微鏡の適用可能性を大幅に拡大するものである。このような改良開発の重要性は、細胞生物学的に関する標準文献およびそこに記述されている細胞、副細胞の迅速な変化過程^１、さらには多数の色素を用いた検査方法^２を手掛かりに読み取ることができる。
例えば下記の文献が参考になる：
^１Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ他著（２００２年）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ；Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ刊
^１，２Ｇ．Ｋａｒｐ著（２００２年）：Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ；Ｗｉｌｅｙ Ｔｅｘｔ Ｂｏｏｋｓ刊
^１，２Ｒ．Ｙｕｓｔｅ他著（２０００年）：Ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ–ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊、ニューヨーク
^２Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ著（２００３年）：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ第１０版；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ刊

本発明は次のプロセスおよび変遷にとって非常に重要な意味を持っている：
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも１／１０秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する：
・ Ａｂｄｕｌ−Ｋａｒｉｎ、Ｍ．Ａ．他は２００３年“Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．”第６６巻、１１３〜１２５ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、３次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・ Ｓｏｌｌ、Ｄ．Ｒ．他は２００３年“Ｓｃｉｅｎｔｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎ．”第３巻８２７〜８４１ページに３次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｒ他は２００２年“Ｇｌｉａ”第３７巻２２９〜２４０ページにラットの微小神経膠細胞における運動の３次元分析について記述している。そのデータは１０時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。

これに関しては特に次のことが重要なポイントである：
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析
・ 例えばＦＲＥＴ実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元ＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物
・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ

細胞内の運搬過程
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えばタンパク質を高速度で（殆どが１／１００秒の領域）描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰもしばしば適用される。

そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく：
・ Ｕｍｅｎｉｓｈｉ，Ｆ．他が２０００年“Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．”第７８巻１０２４〜１０３５ページに、ＧＦＰ変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・ Ｇｉｍｐｌ，Ｇ．他が２００２年“Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．”第１３９巻４３〜５５ページに、ＲＯＩブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびＧＦＰマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・ Ｚｈａｎｇ他が２００１年“Ｎｅｕｒｏｎ”第３１巻２６１〜２７５ページに、ＧＦＰ変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。

分子間の相互作用
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度（１／１００秒レベル）で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく：
・ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ａ．およびＤａｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．が２００４年“Ｇｌｉａ”第４６巻１９５〜２０６ページに、ラット海馬角の培養における２チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて３次元空間において長時間に亘り２チャネルで記録される。
・ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．他が２００３年“Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”第２０巻６３３〜６３８ページに、ヒトの線維肉腫細胞の２色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＲＦＰ）が同時にリアルタイムで観察された。
・ Ｂｅｒｔｅｒａ，Ｓ．他が２００３年“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”第３５巻７１８〜７２２ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内３次元空間で迅速シリーズとして行われる。

細胞間の信号伝達
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が１／１００秒から１／１０００秒以下の範囲で起こるからである。
筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく：
・ Ｂｒｕｍ Ｇ他が２０００年“Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ”第５２８巻４１９〜４３３ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なＣａ＋活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・ Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｈ他が２００３年“Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ”第５５１巻１３〜３２ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるＣａ＋イオンの分析について記述している。変化するＣａ＋に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なＣａ＋変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるＣａ＋活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。

レーザ走査顕微鏡の模式図 視野内の観察対象領域（ＲＯＩ） レーザ走査型顕微鏡の別の構造模式図 多点走査による別法の模式図 ラインスキャナの内部検出器の配置のモデル例 ラインスキャナの共焦点スリット絞りの配置

符号の説明

１ 光走査型顕微鏡
２ 光源モジュール
３ 走査モジュール
４ 顕微鏡モジュール
５ 検出モジュール
６，７ レーザユニット
８ 光バルブ
９ 減衰器
１０ 結合ポイント
１１ 光ファイバ
１２，１３ コリメータ
１４，１５ ビーム結合ミラー
１７ ビームスプリッタ
１８ スキャナ
１９ 対物レンズ
２２ 焦点
２３ 試料
２４ 転向ミラー
２５ カラースプリッタ
２６ 絞り
２７ ブロックフィルタ
２８ 検出器
３７ 円筒形テレスコープ
３８ 非球面ユニット
３９ 円筒形光学系
４０ 補正ユニット
４１ ズーム光学系
４２ 絞り
４４ 丸型光学系
６４ ニポーディスク
６５ ミニレンズアレー

Claims (10)

1. 照明光と試料間の相対的移動により試料領域の少なくとも１箇所を捕捉するための光走査型顕微鏡であって、照明光が、試料を複数の点または領域で平行に照明し、複数の点または領域が検出装置によって同時に検出される、面検出器が配備されていて、照明生成のため可動有孔ディスクが装備されている、および検出光路には取換および／または切換の可能なビームスプリッタおよび／またはフィルタが配備されている光走査型顕微鏡。
2. 調整可能な共焦点絞りが光学スライス厚の変更のために配備されている、請求項１に記載の光走査型顕微鏡。
3. 複数の内部検出器に対して波長の割り振りを行うため、これらの検出器に切換および／または取換の可能なビームスプリッタが装備されている、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
4. 制御ユニットがスペクトル検出および絞り設定の同期制御のために配備されている、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
5. 複数の照明領域が複数の点または線によって照明され、それに対して検出器が割り振られている、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡であって、スペクトル検出の迅速変換により蛍光スペクトルが記録され、異なった波長がスペクトル分離される、および成分分離法が適用される光走査型顕微鏡。
6. 共振型スキャナ、ニポースキャナまたは多点スキャナを持つ光走査型顕微鏡。
7. 特に細胞結合面および有機体全体における、なかでも１／１０秒から時間単位までのダイナミックなプロセス等の生育過程、それも特に以下の諸点、すなわち
   ・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析、
   ・ 例えばＦＲＥＴ実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
   ・ 例えば３次元ＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
   ・ 例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析、
   ・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析、
   ・ 例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析、
   ・ 例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
   ・ 機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
   ・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物、
   ・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
   ・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
   ・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ、
   のうちの少なくとも１つの研究のための、前記請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
8. 特に、微小な運動構造体、例えばタンパク質の高速度描写に（殆どが１／１００秒の領域）、それも特にＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰなどに適用される、細胞内運搬過程の研究のための先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
9. 例えば、副分子構造解明のためのＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなど、好ましくは間接的技術の使用下における、特に、非常に微小な構造の高速度描写など、分子およびその他副細胞の描写のための先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
10. 特に筋肉系または神経系に関する研究における迅速な信号伝達過程のための、特に、１／１００秒から１／１０００秒以下に到るまでの領域で展開されるイオン介在活動に関係する、高い経時的分解能による神経生理学過程のための、先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。